Průtoková cytometrie Andrea Wagnerová Průtoková cytometrie •Laboratorní metoda, která umožňuje rychlou multiparametrickou analýzu buněk. • •U každé buňky z připravené buněčné suspenze je možné analyzovat: §velikost buňky §vnitřní strukturu buňky (granularita) §detekovat tzv. CD znaky (intracelulární x extracelulární) • •Význam průtokové cytometrie spočívá zejména v tzv. imunofenotypizaci buněk, tj. možnosti detekovat antigeny buněk (CD znaky). • Princip průtokové cytometrie •Pomocí průtokového cytometru je možné buňky identifikovat a kvantifikovat. • •Buněčná suspenze je unášena proudem nosné kapaliny → s paprskem světla dochází na buňkách k rozptylu světla v různých úhlech → rozlišení vlastnosti buněk: §Forward scatter (přímý rozptyl) – rozptyl laserového paprsku v malém úhlu, informace o velikosti částice, §Side scatter (boční rozptyl) – rozptyl laserového paprsku pod úhlem 90 °, informace o komplexitě částice. § •Součástí buněčné suspenze jsou fluorochromem konjugované monoklonální protilátky, které se vážou na konkrétní struktury částice a po setkání s laserovým paprskem dochází k excitaci fluorochromu a následné emisi záření. Emitované fluorescenční záření je v přístroji detekováno a zpracováno. • Průtokový cytometr •Průtokový cytometr tvoří 3 základní systémy: fluidní, optický a elektronický. • Fluidní systém (Rahman 2016) Instrumentace •Fluidní systém: je tvořený centrálním kanálem, kterým pod tlakem prochází nosná kapalina → usměrnění částic (hydrodynamická fokusace). • Fluidní systém (Rahman 2016) Instrumentace •Optický systém: §lasery (zdroj světla), §systém čoček – soustřeďují fotony emitovaného záření na sadu zrcadel a filtrů, §zrcadla a optické filtry – usměrňují a odrážejí světlo různých vlnových délek do konkrétních fluorescenčních kanálů. • •Fluorochrom navázaný na monoklonální/polyklonální protilátce → vazba na buňky → projití buňky laserovým paprskem → excitace → emise fotonů → detekce optickým systémem přístroje. • Instrumentace •Detekční systém: je představován detektory, které převádějí světelný signál na elektrický. Počet detektorů se liší v závislosti na typu průtokového cytometru. • •2 typy detektorů: §fotodiody – pro detekci silnějšího signálu, §fotonásobiče – jsou citlivějšími detektory vhodnými pro detekci emitovaného fluorescenčního záření. • •Výsledkem je grafické zobrazení na obrazovce počítače. • Analýza dat •Analýza dat je prováděna pomocí grafických a číselných údajů. Pomocí tzv. gatování lze oddělit jednotlivé populace buněk. •Grafický výstup: • jednoparametrový histogram dvouparametrový scattergram Přímá imunofluorescence •Antigen (CD znak) → protilátka značená fluorochromem → komplex Ag x Ab → molekula fluorescenčního barviva emituje záření o specifické vlnové délce → detekce detektorem. • Populace CD3+ buněk, tj. T-lymfocyty (osa x znak CD3, použitým fluorochromem je APC750). CD klasifikace •Tabulka: Přehled nejznámějších povrchových antigenů • CD znak Výskyt CD3 T lymfocyt CD3, CD4 Th lymfocyt CD3, CD8 Tc lymfocyt CD19 B lymfocyt CD14 Monocyt CD15 Neutrofilní, eozinofilní granulocyt Fluorochromy •Použitím monoklonálních protilátek značených různými fluorochromy je možné během jedné analýzy detekovat na buňkách více antigenů. • Fluorochrom Excitace (nm) Emisní vrchol (nm) FITC 488 525 KrO 405 528 PB 405 455 PC7 486–580 710–800 APC 633–638 660 PE 488 575 Tabulka: Přehled vybraných fluorochromů (Beckman Coulter) Aplikace průtokové cytometrie §Imunofenotypizace lymfocytů §Funkční testy a testy fagocytózy §Měření obsahu DNA v buňkách (hodnocení ploidie, buněčného cyklu) §Stanovení cytokinů §Imunofenotypizace trombocytů, erytrocytů • Vyšetřovaný materiál •K nejčastěji vyšetřovanému biologickému materiálu patří: §periferní krev, §kostní dřeň, §buněčná suspenze získaná z bioptického vzorku (vzorku tkáně), uzliny, §jiné tělní tekutiny (likvor, výpotky, BAL…). • Příprava vzorku •Ab + biologický materiál • •Inkubace 15 min ve tmě při lab. teplotě • •Lyzační roztok (lýza ery) • •Inkubace 15 min ve tmě při lab. teplotě • •Promytí vzorku (odstranění nenavázaných Ab a odpadu po lýze ery) • •Měření (v řádu sekund/minut) • Cytometrický výstup měření •Měření nám umožní vizualizaci různých parametrů, jejich grafické znázornění: • §histogram (1 parametr; počet buněk x analyzovaný parametr) §dot plot (2 parametry → jeden na ose x, druhý na ose y) • Histogram vs. Dot plot histogram dot plot Cytometrický výstup měření: čtení grafů •Buňky jsou zobrazeny jako tečky v příslušné oblasti. §na ose y stoupá pozitivita směrem nahoru, §na ose x stoupá pozitivita směrem doprava • Imunofenotypizace •Detekce antigenů na povrchu či uvnitř analyzovaných buněk pomocí fluorochromem značených monoklonálních protilátek. • •Součást laboratorních diagnostických postupů: §přítomnosti klonu maligních buněk hematopoetického původu, §liniová příslušnost buněk, §stupeň diferenciace. • •Příklady onemocnění, využití pro diagnostiku: §akutní a chronická leukémie, §PNH, §mnohočetný myelom… • Funkční testy •Detekce antigenů na povrchu analyzovaných buněk po jejich aktivaci pomocí fluorochromem značených monoklonálních protilátek. • •Cílem provedení funkčních testů je: §odhalení poruchy ve fungování leukocytů, §schopnosti jejich aktivace. • Funkční testy: rozdělení •Funkční testy lymfocytů: §aktivitu T lymfocytů, §aktivitu B lymfocytů, §aktivitu NK buněk. • •Funkční testy granulocytů: §aktivita neutrofilních granulocytů (fagocytóza, tzv. burst test), §aktivita bazofilních granulocytů (alergie, tzv. bazotest). • Funkční testy lymfocytů •Aktivita lymfocytů se stanovuje na základě schopnosti buňky: §proliferovat, §exprimovat aktivační molekuly, §produkovat cytokiny. • Funkční testy: exprese aktivačních molekul •Stanovení exprese antigenů na aktivovaných buňkách po kultivaci s mitogenem. • •Konkrétní molekuly se vyskytují jen na aktivovaných buňkách, varianty provedení testu: §Časná aktivace po 24 hod kultivace s mitogenem §T, B lymfocyty exprimují po aktivaci CD69 §Pozdní aktivace po 48 hod kultivace s mitogenem §T lymfocyty exprimují po aktivaci CD25 §B lymfocyty exprimují po aktivaci CD23 • Průtoková cytometrie: videoukázka •Průtoková cytometrie: video • Zdroje •Beckman Coulter – Instruction For Use [online]. Poslední revize 30. 9. 2021 [cit, 2022-03-10]. Dostupné z: https://www.mybeckman.cz/search#q=navios&t=coveo-tab-techdocs • •Ormerod MG. Flow Cytometry: A Practical Approach. Third Edition. Oxford; 2000. • Děkuji za pozornost. • • • • • • •Autor: RNDr. Andrea Wagnerová •Kontakt: 532 236 860 (OKMI, FN Brno), wagnerova.andrea@fnbrno.cz