MUNI
MED
Bilirubin, hemoglobin, porfyriny, VNM, HIOK,
léky
MUDr. RNDr. Michal Riháček, Ph.D.
Ústav laboratorní medicíny a Ústav biochemie
Fakultní nemocnice Brno a LF MU
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Krevní barviva
porfyriny,
hemoglobin a jeho deriváty,
bilirubin
Porfyriny
- sloučeniny odvozené od porfinu
- porfin: tetrapyrol se čtyřmi 7
pyrrolovými kruhy spojenými
methylenovými můstky
- významná vlastnost je schopnost s
vazby kovových iontů
(metaloporfyriny)
- substituce perif. vodíků na uhlíku
1-8 (methyl, vinyl, karboxyethyl, 6
karboxymethyl)
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
Porfyriny
- dle uspořádání substituentů
C1-8 7
- symetrické: porfyriny typu I
- asymetrické: porfyriny typu III
(nejvýznamnější - hem) s
6
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
Biosyntéza hemu
- vznik:
erytrocytární prekurzory (70-80%)
játra (15%)
- cíl:
erytrocyty (hemoglobin)
játra (cytochromy)
ostatní buňky (katalázy,
peroxidasy - dýchací řetězec)
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
1. Syntéza kyseliny 5-aminolevulové (5-ALA)
vzniká kondenzací glycinu se
sukcinyl-CoA a následnou
dekarboxylací intermediátu této
reakce
katalýza: 5-ALA synthasa (ALAS),
vitamin B6 (PLP)
lokalizace: matrix mitochondrie H,N
SCoA
+0
OH
nejvýznamnější regulační bod syntézy
2. Vznik porfobilinogenu (PBG)
- 5-ALA přechází do cytosolu, kondenzace
za enzymatické katalýzy je dalším krokem
katalýza: 5-ALA dehydratasa (ALAD),
Zn2 +
- lokalizace: cytosol
ireversibilní inhibice reakce vazbou Pb2 +
iontů ve vazebných místech pro Zn2 +
choroby: porfyrie z ALAD deficience,
otrava olovem !
o NH-,
OH O
HoO
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
3. Vznik hydroxymethylbilanu
- kondenzace čtyř PBG
katalýza: HMB-synthasa / PBG-
deaminasa
- lokalizace: cytosol
- uvolnění 4 molekul amoniaku
- choroby: akutní intermitentní porfyrie
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
4. Vznik uroporfyrinogenu III
- cyklizace HMB
- katalýza: uroporfyrinogen III synthasa
(UROS)
- lokalizace: cytosol
- uvolnění H 2 0
- choroby: kongenitální erytropetická
porfyrie
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
5. Vznik koproporfyrinogenu III
- dekarboxylace acetátových skupin na
methylové zbytky
- katalýza:
uroporfyrinogendekarboxylasa
(UROD)
- lokalizace: cytosol
- uvolnění 4 molekul C 0 2
- choroby: porphyria cutanea tarda
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
6. Vznik protoporfyrinogenu IX
- oxidatívni dekarboxylace propionátů na
vinylové zbytky
- katalýza: koproporfyrinogenoxidasa
(CPO)
- lokalizace: mitochondrie
- uvolnění 2 molekul C 0 2 a 2H+
- choroby: hereditární koproporfyrie,
otrava olovem !
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2
7. Vznik protoporfyrinu IX
přeměna methylenu na methin a vznik
konjugovaných TT-vazeb (zabarvení)
katalýza: protoporfyrinogenoxidasa
(PPO) + 0 2 za vzniku vody
lokalizace: vnitřní mitochondriální
membrána
uvolnění 6H+
choroby: variegátní porfyrie
8. Vznik hernu
- vestavba Fe2 +
- katalýza: ferrochelatasa \\
(hemsynthasa) a proteinové molekuly s
[2Fe - 2S] klastrem
- lokalizace: vnitřní mitochondriální
membrána
- uvolnění 2H+
- choroby: erytropoetická porfyrie,
otrava olovem !
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 13
DOrfvrie z deficitu ALA dehťdratázv
Dělení porfyrií
nejvíce postižených orgánů produkujících
porfyriny:
1. hepatální-AIP, PCT, HCP, VP, ADP;
2. erytropoetické - CEP;
3. erytrohepatální - EPP;
projevů:
1. kožní-PCT, EPP, CEP;
2. jaterní - AIP, ADP, VP, HCP;
(VP a HCP také způsobují kožní projevy)
průběhu:
1. akutní - AI P, VP, HCP, ADP;
2. chronické - PCT, EPP, CEP;
Akutní intermitentní porfyrie
- defekt 3. kroku = vznik
hydroxymethylbilanu
AD onemocnění
- akutní ataka po zátěži chem. Látkami
(léky, alkohol, steroidy)
bolest břicha, zácpa, zvracení,
neurologické příznaky dg. TTALA a PBG v moči
léčba: glukóza i.v. - inhibice ALAS
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Porfyria cutanea tarda (PCT)
defekt 5. kroku = dekarboxylace acetátů
na methylové zbytky
AD onemocnění
hromadí se uroporfyrinogen III, který
se ukládá do kůže a zvyšuje
fotosenzitivitu
hlavně muži středního věku
léčba: venepunkce, chininové
preparáty, ochrana před sluncem,
jaterní dieta
T uropofyrinogen v moči
tkoproporfyrin ve stolici
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Erytropoetická porfyrie (EPP)
- defekt 8. kroku = ferrochelatasy
- AD onemocnění
- hromadí se protoporfyrinu IX v játrech,
kůži a kostní dřeni
- zarudnutí, svědění a otok kůže,
výjimečně jaterní postižení
protoporfyrin v krvinkách
a ve stolici (vzácně)
- léčba: beta-karoten, antihistaminika
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Diagnostika - iniciální screening z moči
Charakteristické absorbční spektrum - Soretilv pás, s maximem okolo
400 nm
- Materiál: okyselená (H2S04) jednorázová moč, chránená před
světlem
Referenční rozmezí: do 144 |jg/l (0,22 |jmol/l)
- V případe pozitivity následuje další vyšetření moče - stanovení
jednotlivých porfyrinií, stanovení prekurzoril porfyrinií (ALA, PBG), a
případné i enzymů v krvi podílejících se na tvorbé a přeméné
porfyrinií (výjimečné).
- Méné často možnost stanovení porfyrinií ve stolici, erytrocytech či
plazme
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 18
•
Diagnostika - stanovení jednotlivých porfyrinů
- V kyselém prostředí po ozáření UV světlem (400 nm) silné
fluoreskují v červene oblasti (550-650 nm)
- HPLC na reverzní fázi s fluorescenční detekcí
- Materiál: konzervovaná (Na2C03) sbíraná moč (24 h),
chráněná před světlem
- Referenční rozmezí:
URO: do 0,050 |jmol/24h
KOPRO: do 0,280 |jmol/24h
HEPTA: do 0,014 |jmol/24h
HEXA: do 0,006 |jmol/24h
PENTA: do 0,005 |jmol/24h
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Diagnostika - HPLC-FLD porfyriny
E x t e r n a l Standard Report
Sorted Dy i S i g n a l
c e l l D . Data M o d i f i e d «.10.2015 10:34:37
M u l t i p l i e r 1.0000
D i l u t i o n : 1.0000
Use H u l t i p l i e r t D i l u t i o n r a c t o r w i t h ISTDs
Siena) 1: FLD1 A, Ex»390, Ea>«<2»
Area AnT /AreaR e t T i a e Type
(•in)
Amount
l u m o l / l j
Grp
7.«10 BB
».10» BB
10.3»? B6
11.652 B8
12.«58 BS
T o t a l a :
102.60725 1.9453»e-3 2.0000Oe-l
113.6J«37 1.7G00C«-3 2.0000Oe-l
US.63916 1.37325*-3 2.0000Oe-l
147.33250 1.35747«-3 2.00000e-l
172.64391 l.li«45«-3 2.00000e-l
1.00000
URO
HEPTA
HEXA
PEKTA
K0PR0
K L I I I I C K A B I O C H E M I E - PREDNASKA 2 0 2 2
Diagnostika - HPLC-FLD porfyriny
Pacient byl přijat pro podezřeni na porfyrii (poruchu syntézy hernu). Poslední
dva roky se mu objevovaly pigmentové skvrny na rukou, byl vyšetřen na kožní
klinice, kde na základě kožní biopsie vzniklo podezření na porfyrii.
Laboratorně měl pacient opakovaně pozitivní porfyriny v moči. Za
hospitalizace byla provedena jaterní biopsie a laboratorní diagnostika
protilátek, pacient byl nadále sledován ambulantně. Byla mu doporučena
abstinence a nevystavovat se přímému slunci.
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PREDNÁŠKA 2 0 2 2
Diagnostika - HPLC-FLD porfyriny
Test
Rok/Měsíc Referenční interval
Test
1/1 1/2 1/3 3/1 5/1 O SI • KJ
S é r u m
5,0 5,0 5,9 5,8 5,5 (1,7-8,3 mmol/l) ^
Krea 98 83 101 80 82 (59-104 umol/l)
BilT 14,6 9,4 6,8 10,4 9,7 (2,0-21,0 umol/l)
ALT 1,58 1,26 1,64 0,55 0,81 (0,17-0,85 ukat/l) ^
AST 0,78 0,66 0,87 0,50 0,53 (0,17-0,85 ukat/l) ^
GGT 1,14 0,68 0,90 0,27 0,51 (0,13-1,02 ukat/l) ^
0,80 0,83 1,11 0,65 0,81 (0,67-2,15 pkat/1) ^
Moč
0,230 0,290 0,105 0,108 0,200 (0-0,280 pmol/24h) ^
dU-Uroporfyrin 4,230 6,860 1,770 0,016 0,030 (0-0,050 umol/24h) ^
dU-Pentaporfyrin 0,120 0,150 0,057 (0-0,005 umol/24h) ^
dU-Hexaporfyrin 0,070 0,090 0,058 (0-0,006 umol/24h) ^
dU-Heptaporfyrin 0,700 1,060 0,562 (0-0,014 umol/24h) ^
U-Porfobilinogen 26,670 (0,04-36,00 umol/l) ^
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 22
Hemoglobin
- Transportní metaloprotein v červených krvinkách
- Přenos krevních plynil - především 02 z plic do periferních tkání,
ale i části C02 v opačném směru
- Dilležitý pufrační systém krve - vazba H+
na postranní řetězce
His (především v periferní tkáni)
- Koncentrace Hb v krvi se liší podle pohlaví: ženy: 120-162 g/l
muži: 135-172 g/l
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 23
•
Hemoglobin
Poruchy syntézy globinu
talasémie - geneticky podmíněná snížená nebo chybějíc! syntéza některého z globinových řetězců
Beta-talasémie - omezena produkce R-retězců, kompenzace syntézou HbA2, HbF, (fragilnějsi Ery,
porucha zabudováváni Fe)
hemoglobinopatie - vrozené defekty genu tvořícího řetězce globinu: záměna aminokyselin a
následná syntéza patologicky změněné molekuly Hb hemoglobinu);
nejznámějsi: Hemoglobinopatie S (Srpkovitá anémie, Glutamin R>6 -> Val)
hemolytické projevy, zkrácené přežíváni drepanocytů, ztráta negativního náboje Hb
vyšsi odolnost vůči malárii
Analýza globinových řetězců
disociace globinových řetězců a hernu a následná separace - elektroforeticky, HPLC, isoelektrická
fokuzace - možná i analýza pomocí MS
Hemoglobin
Stanovení Hb v plné krvi
v rámci vyšetrení krevního obrazu na hematologických analyzátorech: lýza erytrocytu a tvorba
opticky stálého barevného komplexu s lauryl sulfátem sodným nebo imidazolem
- v rámci vyšetrení acidobazické rovnováhy na ABR
analyzátorech: měření absorpce světla v plné krvi
ABL 825 flex (Radiometr) - 1 ul vzorku je ultrazvukově zhemolyzován v kyvetě, vytvori se tím
opticky čirý roztok, absorbance
Drabkinova metoda (referenční): hemolýza, oxidace Fe2+ na Fe3+ hexakyanoželezitanem
draselným ([Felll(CN)6]3-)
za vzniku metHb, který je reakcí s KCN převeden na kyanHb s absorpčním maximem pri 540 nm
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 25
•
Hemoglobin
Stanovení volného Hb v séru
- tzv. "sérové indexy"
- spektrofotometrie
- detekce hemolýzy ve vrozku
- při porovnání s haptoglobinem a krevním obrazem pac. slouží
k odlišení intra a extra vaskulární hemolýzy
Stanovení hemoglobinu ve stolici - okultní krvácení
- gFOBT (guajakový test, Haemoccult) - interference maso, vit C
iFOBT (imunochemický test) - imunoafinitní chromatografie
(vyloučení krvácení do GIT)
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 26
•
Bilirubin
produkt rozpadu hemoglobinu
hem se nejprve konvertuje na
biliverdin (hemoxidasa), ten
se redukuje na bilirubin,
který se váže na albumin a
pokračuje do jater, kde je
konjugován (blíže viz
přednáška játra...)
hemoglobin -*> biliverdin bilirubin
• A *bruise »healing
• A *&x»« Ao* By Cek*
Bruise Color Bruise Age
Red (Swollen. Tender) 0 to 2 Day*
Hue. Purpte i tg í Day-»
Green í (o T Day*
veno* TioiOOeye
Brown 1010 14 Day*
Mo lurtfwr eviaenc*
ol BruMng i lo 4 Weeks
Bilirubin - stanovení
Spektrofotometrické stanovení
- většina metod fotometrického stanovení
bilirubinu vychází z diazotačních reakcí.
Vznik barevného produktu
Celkový bilirubin
uvolnění z vazby na albumin a rozpuštěni
účinkem akcelerátoru (kofein, benzoan
sodný, octan sodný), následuje diazotace
COOH COOH
I I
CH2 CH
Me v Ha CH2 CH2 " e M
£ J
H
c a , cooH
I 7
Me CH.Me V Me ;H2
H H
N — N - V / / S 0
3 H
+
Přímý bilirubin
přímá reakce s diazo činidlem, krátká
inkubace, zastavení reakce přídavkem
kyseliny askorbové
H S
° 3 - ^ > - N
CH.COOH
I 2
CH„
Jle Me y
K L I N I C K Á B I O C H E M I E - PŘEDNÁŠKA 2 0 2 2 28
•