Molekulárně biologické metody v mikrobiologii https://www.fnbrno.cz/ Monika Dolejská Oddělení klinické mikrobiologie Ústav laboratorní medicíny Fakultní nemocnice Brno • Historie, vývoj a trendy klinické mikrobiologie • Základní metody v molekulární mikrobiologii • Nové technologie v mikrobiologické diagnostice • Nové diagnostické přístupy https://www.fnbrno.cz/ Obsah prezentace Historie klinické mikrobiologie “Pravěk” První pozorování mikrobů Souvislost mikrobů a nemocí - období “lovců mikrobů” Antoni van Leeuwenhoek (1632 - 1723) Louis Pasteur (1822 - 1895) Robert Koch (1843 - 1910) Joseph Lister (1827 - 1912) https://www.fnbrno.cz/ Historie klinické mikrobiologie Objev a zavedení antibiotik Imunologie, serologie Alexander Fleming (1881 – 1955) „Klinická mikrobiologie“ Virologie a mykologie Rozvoj nových metod https://www.fnbrno.cz/ • Omezený počet kultivovatelných mikrobů • I v rámci jednoho druhu nebo úzce příbuzných taxonů dochází k významnému rozdílu ve virulenci (např. Escherichia coli vs. Shigella spp., Bacillus anthracis vs. Bacillus. cereus) Kultivace mikrobů CDC, Atlanta https://www.fnbrno.cz/ Mikrobiologická diagnostika Mikrob Hostitel Prostředí Infekce • Virologie – Sérologie – Molekulární genetika – Kultivace – Elektronová mikroskopie • Bakteriologie a mykologie – Kultivace – Mikroskopie – Molekulární genetika – Sérologie • Parazitologie – Mikroskopie – Sérologie – Molekulární genetika https://www.fnbrno.cz/ Současné potřeby mikrobiologické diagnostiky • Rychlost • Přesnost • Klinická validita https://www.fnbrno.cz/ Diagnostické metody v mikrobiologii Molekulárně – genetické metody Amplifikační techniky Mikročipy Celogenomová sekvenace Kultivační metody Automatické systémy Analýza obrazu Funkční metody Hmotnostní spektrometrie Další spektroskopické metody Speciální mikroskopické techniky Průtoková cytometrie https://www.fnbrno.cz/ Molekulární metody v klinické mikrobiologii https://www.fnbrno.cz/ https://www.fnbrno.cz/ Nevýhody tradičních metod • Nedostatečná citlivost pro některé mikroby • Limitace na patogeny se známými růstovými parametry • Špatné odlišení mezi mikroby s běžnými vlastnostmi • Neschopnost průkazu infekcí vyvolaných nekultivovatelnými (novými) mikroby Příklady: • Průkaz a identifikace pomalu rostoucích a obtížně kultivovatelných mikrobů – M. tuberculosis, Borrelia burgdorferi • Nemoci, o nichž se předpokládá, že jsou infekční, zůstávají špatně definovány bez detekovaného mikroorganismu – náhlá horečka po přisátí klíštěte • viry: virové průjmy, virus vztekliny, viry chřipky, virus hepatitidy B a C, enteroviry, adenoviry, RS-virus, viry parainfluenzy, herpex simplex virus, virus příušnic Nevýhody tradičních metod https://www.fnbrno.cz/ Molekulárně-biologické techniky - Polymerázová řetězová reakce (PCR) – průkaz DNA - PCR s reverzní transkripcí (RT-PCR) – průkaz RNA - Real-time PCR (RT-PCR) - Microarray - Hybridizace - DNA sekvenování https://www.fnbrno.cz/ PCR https://www.fnbrno.cz/ • 1983 Kary B. Mullis  Nobelova cena 1993 • Mnohonásobné zmnožení (amplifikace) specifického úseku DNA in vitro na principu replikace • Široce používaná technika pro průkaz mikrobů ve vzorku • Použití sekvenčně specifických primerů • Vysoká citlivost (detekce i jedné buňky) • Průkaz amplifikačního PCR produktu značí přítomnost mikroba PCR – základní kroky https://www.fnbrno.cz/ • Izolace DNA (fenol-chloroform, silikagely, magnetické částice) • Amplifikace specifického úseku DNA • Detekce produktu amplifikace – gelovou elektroforézou – použitím fluorescenční sondy https://www.fnbrno.cz/ Automatizace izolace NK „Otevřené“ a „uzavřené“ systémy 1) voda 2) nukleotidy (dNTP) 3) reakční pufr 4) primery 5) termostabilní DNA polymeráza 6) templátová nukleová kyselina (DNA) 7) případné látky (BSA, DMSO, Tween 20, glycerol, 8) spermidin, minerální olej) https://www.fnbrno.cz/ Složení PCR směsi Cyklus číslo Počet nových dvouřetězcových molekul 1 1 2 3 3 7 4 15 5 31 6 63 7 127 8 255 9 511 10 1 023 11 2 047 12 4 095 13 8 191 14 16 383 15 32 767 16 65 535 17 131 071 18 262 143 19 524 287 20 1 048 575 21 2 097 151 22 4 194 303 23 8 388 607 24 16 777 215 25 33 554 431 26 67 108 863 27 134 217 727 28 268 435 455 29 536 870 911 30 1 073 741 823 Denaturace vzorku DNA Pro oddělení řetězců dsDNA (94 °C, 5 min) Připojení primerů na řetězce DNA (30 - 65 °C, 1 min) Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s) Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) 25 – 35 × https://www.fnbrno.cz/ https://www.fnbrno.cz/ Průběh PCR • dochází k tzv. inhibici reakce (běžné) • inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. z rukavic) • pro detekci použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA a druhou sadu primerů • pozitivita IC - nedošlo k inhibici reakce • IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (reakce kompetují o nukleotidy) Interní kontrola v PCR https://www.fnbrno.cz/ • „klasická“ PCR: end-point analýza (po proběhnutí všech cyklů analýza produktů gelovou elektroforézou) • real-time PCR: sledování amplifikačních produktů po každém proběhlém cyklu („in real time“), nejčastěji používána kvantitativně (qPCR) • reverzně transkripční PCR (RT-PCR): analýza RNA; samotné PCR předchází přepis RNA do cDNA reverzní transkriptázou • qRT-PCR (RT-qPCR): kvantitativní (real-time) reverzně transkripční PCR https://www.fnbrno.cz/ Typy PCR • specifická PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.) • univerzální PCR (cílové místo je gen, který mají všechny bakterie, nejčastěji gen pro 16S rRNA) • multiplex PCR (několik specifických cílových míst v jedné reakci) • nested PCR (dvě sady primerů použité ve dvou následujících PCR; omezuje vznik nespecifický produktů) https://www.fnbrno.cz/ Typy PCR https://www.fnbrno.cz/ Multiplex PCR • Reakční směs obsahuje ne jeden, ale několik párů primerů rozpoznávajících různé cílové sekvence • Detekce několika genů/produktů současně v jediné reakční směsi • Výhoda – simultánní detekce více agens, nižší náklady než při jednotlivých PCR dělaných zvlášť • Nevýhoda – reakci je nutno velmi důkladně optimalizovat vznikající produkty musí být různě dlouhé, aby je šlo současně detekovat při elektroforéze nutno vyvažovat poměry koncentrací primerů (ve směsi se chovají jinak než jednotlivě); kompetice o „zdroje“ (zejm. polymerázu), nebezpečí preferenční amplifikace jednoho fragmentu na úkor ostatních dále roste důležitost pozitivních a negativních kontrol https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR též kvantitativní PCR (qPCR) umožňuje detekci a kvantifikaci produktu PCR v průběhu reakce (ne až po ní jako při konvenční PCR) – přidaná hodnota proti běžné PCR extrémně vysoká citlivost využití pro studium genové exprese, diagnostiku patogenů… princip: detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu produkovaného při syntéze PCR produktu v tzv. light-cycleru – termocykler se zabudovaným fluorimetrem, tj. přístroj, který kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování průběhu PCR kvantitativní vztah mezi množstvím PCR produktu a intenzitou fluorescence • Využívá tzv. fluoroforů – molekul, které po předchozí absorpci světla určité vlnové délky emitují světlo jiné vlnové délky (vždy vyšší, protože nižší energie) nespecifická • interkalační barviva specifická – oligonukleotidy s fluoroforem • TaqMan sondy • FRET • molekulární majáky • citlivější a dražší • tyto sondy (oligonukleotidy komplementární k PCR produktu) mimo fluoroforu často obsahují i zhášeč – molekulu, která zachytává fluorescenci fluoroforu, brání detekci signálu před navázáním sondy (tj. před vznikem produktu) https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR – detekce amplikonu hydrolyzační sondy (TaqMan®) https://www.fnbrno.cz/ hybridizační sondy (FRET) – Fluorescence Resonance Energy Transfer Real-time PCR – detekce amplikonu https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR – detekce amplikonu sonda hybridizovaná s cílovou sekvencí → molekula reportéru je separovaná od quencheru → emise → fluorescence Molekularní majáky stanovení tzv. amplifikačního prahu detekce • amplifikační práh detekce – Ct (threshold cycle) • fáze celého procesu, kdy začíná exponenciální nárůst množství PCR produktu (vlastně číslo, udávající, ve kterém cyklu k nárůstu došlo) • určený na základě hodnoty fluorescence pozadí a vzorku v exponenciální fázi • čím menší Ct (čím dřív růst začne), tím větší počet kopií templátu vstoupil do reakce; rozdíl 1 Ct teoreticky odpovídá dvojnásobnému množství templátu A > B > C https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR – princip kvantifikace • Absolutní kvantifikace • pomocí externí kalibrační křivky • srovnání hodnot Ct jednotlivých vzorků s Ct externího standardu o známé koncentraci • Výstup – absolutní hodnota (koncentrace, množství DNA…) • Relativní kvantifikace – normalizace pomocí jednoho či více referenčních genů v tomtéž vzorku • nevyžaduje externí standard • výstup – relativní hodnota – kolikrát více/méně templátu ve srovnání s referenčním genem v tomtéž vzorku • význam – např. analýza exprese genů – srovnání, jak je exprese určitého genu intenzivní či jak se mění ve srovnání s referenčním genem se stálou expresí • nutná normalizace výsledků – koriguje variabilitu mezi jednotlivými vzorky způsobenou charakterem vzorků, pipetovacími chybami, kolísající efektivitou reverzní transkripce atd. https://www.fnbrno.cz/ Real-time PCR – kvantifikační strategie • CE IVD • Dle patogenu • Soubor patogenu spojených s chorobou https://www.fnbrno.cz/ PCR diagnostické kity https://www.fnbrno.cz/ Respiračnípatogeny https://www.fnbrno.cz/ PatogenyGIT Chlamydia trachomatis (CT) Mycoplasma genitalium (MG) Mycoplasma hominis (Quantitative) (MH) Neisseria gonorrhoeae (NG) Trichomonas vaginalis (TV) Ureaplasma parvum (UP) Ureaplasma urealyticum (UU) Internal Control (IC) https://www.fnbrno.cz/ • soubor různých krátkých vláken DNA (oligonukleotidů) přichycených na podkladu ve známých konkrétních místech (spotech) • v konkrétním místě je přichyceno více kopií stejného oligonukleotidu (sonda, próba, reportér) • vzorek: – DNA (stanovování genového profilu různých organismů, často i blízce příbuzných) – RNA jako cDNA (předchází krok RT-PCR) pro analýzu exprese – cílové molekuly označeny fluoroforem https://www.fnbrno.cz/ DNA čipy https://www.fnbrno.cz/ DNA čipy • cílové molekuly hybridizují s komplementarními vlákny oligonukleotidů přichycenými k destičce • promytí odplaví všechny neuchycené molekuly • kvantifikace fluorescence v každém z míst (spotů) • zpracování bioinformatickými postupy To identify bacteria at the species level, we chose to use a 16S rDNA probe combined with a species–specific probe to detect each bacterium. The sequences of the species–specific probes corresponded to 15 species–specific genes. https://www.fnbrno.cz/ DNA čipy AR genes in the National Center for Biotechnology Information GenBank database were identified by their annotations and compiled into a nonredundant list of 775 genes. A DNA microarray was constructed of 70mer oligonucleotide probes designed to detect these genes encoding resistances to various antibiotics. https://www.fnbrno.cz/ Automatizované systémy v diagnostice Automatizované systémy v diagnostice https://www.fnbrno.cz/ Automatizované systémy v diagnostice https://www.fnbrno.cz/ Automatizované systémy v diagnostice - POCT https://www.fnbrno.cz/ Influenza A/B+RSV SARS-CoV-2+Influenza A/B Streptococcus pyogenes skupiny A Clostridium difficile Metody sekvenování NK https://www.fnbrno.cz/ • stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury) • význam: odvození informace o aminokyselinové sekvenci kódovaných proteinů, regulaci jejich tvorby charakterizace mutací např. způsobujících genetické choroby charakteristika příbuznosti organismů a mnohé další • Chemická metoda (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) • Enzymatická metoda (Sangerovo sekvenování) • Pyrosekvenování • Sekvenování nové generace (NGS) Metody sekvenování NK https://www.fnbrno.cz/ • Založená na asymetrické PCR – do reakce vstupuje pouze jeden primer (sekvenujeme-li produkt PCR, používá se nejčastěji jeden z primerů použitých při PCR, případně oba ve dvou oddělených reakcích) • Reakční směs oproti běžné PCR obsahuje navíc tzv. dideoxynukleotidy • Frederick Sanger (1977) • Komercializace Applied Biosystems • Nejpoužívanější metoda po 40 let • Dnes postupně nahrazována NGS Enzymatická (Sangerova) metoda https://www.fnbrno.cz/ Enzymatická (Sangerova) metoda https://www.fnbrno.cz/ • výstup ze sekvenátoru – chromatogram • reprezentuje hrubá data, vyžadující další zpracování Hodnocení dat https://www.fnbrno.cz/ Přiřazení sekvence známému organismu ● bioinformatické přístupy: – BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) – další (specializované) databáze: 16SpathDB ● vyhledávání podobností v databázi • Poptávka po nízkonákladovém sekvenování vyvolala tlak na vývoj „highthroughput“ metod • Princip – paralelizace procesu sekvenování • Produkce tisíců až milionů sekvencí současně • Výstupem obrovský objem dat, který je třeba zpracovat/roztřídit • Poprvé v historii problém ne s tím jak data získat, ale smysluplně je interpretovat, vytěžit • Využití obecně – získání velkého množství sekvenční informace (o celém genomu, nebo o mnoha kopiích určitého úseku DNA, nebo o mnoha genomech současně – metagenomika) Sekvenování nové generace https://www.fnbrno.cz/ • Různé technologie, přístupy, mají své výhody i nevýhody, vhodné pro různé aplikace • Obecné schéma obvykle podobné: ( 0. izolace celogenomové DNA - získáme mnoho kopií genomové DNA) 1. Příprava tzv. knihovny - fragmentace genomové DNA na fragmenty o délce řádově stovky bp dlouhé (např. ultrazvukem, proudem dusíku, enzymy aj.) 2. Zatupení konců fragmentů a ligace tzv. adaptérů - krátkých oligonukleotidů, od kterých pak probíhá sekvenování jednotlivých fragmentů (vážou se k nim primery; všechny fragmenty se tedy sekvenují stejným primerem) (3. Namnožení klonů jednotlivých fragmentů – např. emulzní PCR) – NGS metody 3. generace už nevyužívají 4. Vlastní sekvenování - zpravidla na základě detekce toho, jaká báze se právě začlenila do vznikajícího řetězce Sekvenování nové generace - platformy https://www.fnbrno.cz/ • 454 (Roche) • Illumina • Ion Torrent (Life Technologies) • SOLiD (Life Technologies) • PACBIO (Pacific BioSciences) • Oxford Nanopore (MinION…) 2. generace sekvenování 3. generace sekvenování Sekvenování nové generace - platformy https://www.fnbrno.cz/ • firma Roche • modely 454 GS Junior (35 MB) x 454 GS FLX (700 MB) • příprava knihovny: nebulizace tekutým dusíkem • příprava vlastního templátu pro sekvenování: emulzní PCR na kuličkách (beads); na každou kuličku se váže jeden fragment původní knihovny; kriticky důležitá koncentrace DNA v knihovně (aby na každou kuličku připadal jen jeden fragment) • Po PCR na každé kuličce navázáno mnoho kopií příslušného fragmentu • Sekvenace syntézou v mikrojamkách (objem v pl, v každé jedna kulička), detekce chemiluminiscenční - pyrosekvenování 454 pyrosekvenování https://www.fnbrno.cz/ 454 pyrosekvenování https://www.fnbrno.cz/ • různé modely platforem • příprava templátu: hybridizace na sklíčku, tvorba clusterů (shluků) na pevné destičce, tj. ne v kapce (emulzi); každý cluster opět obsahuje klony (kopie) téhož fragmentu • sekvenace syntézou (SBS – sequencing by synthesis) • detekce fluorescence odštěpené značky z reverzního terminátoru (nukleotidu) – pokud se začlení, vidíme (různo)barevnou fluorescenci • opět paralelní analýza mnoha clusterů současně Illumina https://www.fnbrno.cz/ Illumina https://www.fnbrno.cz/ https://www.fnbrno.cz/ • až 1000 kopií fragmentu na μm2 povrchu • na celém povrchu až 10 milionů shluků na cm2 Illumina https://www.fnbrno.cz/ • nevyužívá pomnožení templátu pro zvýšení signálu, sekvenace v reálném čase – analogie real-time PCR • produkuje výrazně delší čtení (řádově tisíce až desetitisíce bp) – snazší sestavování (assembly) • snazší sekvenování GC bohatých oblastí (druhá generace – problémy) Sekvenování třetí generace https://www.fnbrno.cz/ • PacBio RSII (500-1000 MB) • Od 2011 • technologie SMRT (single molecule real time sequencing) • detekce odštěpeného barviva z připojovaného nukleotidu v tzv. zero mode waveguides (malé „kontejnery“ na dně jamky) • volné nukleotidy plavou v roztoku PacBIO https://www.fnbrno.cz/ PacBIO https://www.fnbrno.cz/ PacBio RSIIflowcell → Pooling libraries - multiplexing BluePippinBluePippin gel cassette PacBIO - workflow It helps to ensure equimolar pooling and sequencing representation across all pooled samples despite different genome size, shear size and sample concentration PacBio – multiplexování knihoven https://www.fnbrno.cz/ • Modely Flongle, MinION, GridION, PromethION (řádově jednotky až stovky GB!) • Od 2014 • Délky readů až stovky kb • MinION – přenosné zařízení! (< 100 g) • Zatím také o něco nižší přesnost čtení (>99%) • Potřeba hybridního assembly s daty z short read sekvenování • Princip – průchod vlákna DNA miniaturním pórem, kterým prochází elektrický proud; při průchodu dochází ke kolísání proudu specifickým způsobem odpovídajícím procházejícímu nukleotidu Oxford Nanopore https://www.fnbrno.cz/ Oxford Nanopore https://www.fnbrno.cz/ • Long reads – ability to assemble whole plasmids and chromosomes • Quality worse than PacBio but cheaper than PacBio Illumina-only Hybrid assembly Why Oxford Nanopore? https://www.fnbrno.cz/ Nové diagnostické přístupy https://www.fnbrno.cz/ Sekvenování nové generace • Analýza mikrobiomu (bakteriom, virom,…) – Detekce nových infekčních agens • Vyšetření citlivosti • Virologická diagnostika https://www.fnbrno.cz/ Mikrobiom člověka a jeho vliv www.biomedic-plzen.cz UNIVERZITA KARLOVA Studie zaměřené na mikrobiom https://www.fnbrno.cz/ • Metataxonomika (16S rRNA profilování) • Metagenomika (analýza DNA) • Metatranskriptomika (analýza mRNA) • Metabolomika (analýza metabolitů) Analýza mikrobiálních populací https://www.fnbrno.cz/ • Metataxonomika • Běžně dostupná metoda • Využití 16S rRNA profilování (limity identifikace) • Neumožňuje identifikaci taxonů na detailní úrovni • Nepopisuje variabilitu na úrovni jednotlivého druhu (např. faktory virulence) Analýza mikrobiálních populací https://www.fnbrno.cz/ • Metagenomika • Detailní úroveň genetické informace • Náročné bioinformatické analýzy • Možné popsat i jiné mikroorganismy • viry • mikromycety • parazity • Metatranskriptomika (analýza mRNA) • Poskytuje informace o jednotlivých exprimovaných genech • Náročná laboratorní část • Náročné zpracování vzorků Analýza mikrobiálních populací https://www.fnbrno.cz/ Metagenomika, metatranskriptomika, metabolomika mohou přinášet skvělé výsledky, avšak problémem je zpracování dat a klinická interpretace Analýza mikrobiálních populací https://www.fnbrno.cz/ Využití NGS – predikce ATB rezistence https://www.fnbrno.cz/ Staphylococcus aureus Mycobacterium tuberculosis Sekvenování nové generace a vyšetření citlivosti https://www.fnbrno.cz/ Využití pro vyšetření infekcí CNS https://www.fnbrno.cz/ Závěr https://www.fnbrno.cz/ Strategie v klinicko-mikrobiologické diagnostice https://www.fnbrno.cz/ Kam kráčí klinická mikrobiologie • Mikrobiologická diagnostika zaznamenává bouřlivý rozvoj • Vždy je však za vzorkem potřeba vidět pacienta • Funkční metody mohou přispět k další personalizaci medicíny • Vývoj nových metod klinické virologie https://www.fnbrno.cz/ Sekvenování DNA https://www.youtube.com/watch?v=vK-HlMaitnE – Sanger sequencing https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8 - Illumina https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw – Nanopore https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI – Pacific Biosciences https://www.fnbrno.cz/