Nádorová cytogenomika (ONKOCYTOGENETIKA) Metody v onkocytogenetice Marie Jarošová Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologická klinika FN a LF MU Brno Ústav lékařské genetiky a genomiky MU Brno §Historie §Metody cytogenetiky §Klasické cytogenetické vyšetřené §Metody molekulární cytogenetiky –FISH –mFISH –Mband –arrayCGH/SNP array §Význam a využití metod v hematologii a onkologii § • Nádorová cytogenomika Nádorová cytogenomika § Charakteristickou vlastností nádorových buněk jsou • chromosomové změny : početní změny chromosomů • strukturní změny chromosomů • • • Fritscher karyotyp b C:\Majka a Eva\Karyotyp publi 2_soubory\HRAO[2].002K.JPG Cytogenetics is the study of the structure and properties of chromosomes, their behaviour during somatic cell division during growth and development (mitosis), and germ cell division during reproduction (meiosis), as well as their influence on phenotype. Cytogenetics also includes the study of factors that cause chromosomal changes. Hare &Singh1979 Historie cytogenetiky 1956 - určen přesný počet 46 lidských chromosomů Historie nádorové cytogenetiky Philadelphia chromosome (Ph1) Peter Nowell & David Hungerford Science 1960,132:1497 Historie nádorové cytogenetiky Classification of chromosomes into seven groups by size and relative centromere position established the so-called "Denver System" (right) in 1960. Chromosomes within groups B - G were not readily distinguishable from each other. The X chromosome is in the C group, and the Y is in the G group: males are recognizable by five small G-type chromosomes. Historie nádorové cytogenetiky Pruhování chromosomů Banding techniques: Casperson & Zech,1970 Historie nádorové cytogenetiky Philadelphia chromosome (Ph1) (1973) Dr. Rowley received the Lasker Award, given for distinguished contributions to medical science; the National Medal of Science from President Bill Clinton; and the Presidential Medal of Freedom from President Obama, among many other honors (1925-2013) t(9;22)(q34;q11) 2001A1 § Zkoumá získané chromosomové změny • nádorových buněk § §Hodnotí početní a strukturní změny • chromosomů • §Základní metoda – G-pruhovací technika • (rozlišení kolem 3-5Mb) • §V jednom vyšetření analyzuje celý genom § § • § • Nádorová cytogenetika (onkocytogenetika) Nádorová cytogenomika - metody G-1324295KN1~A ALL IKZF1-Zoom metap1 arrayCGH/SNP array FISH Konvenční cytogenetická analýza bandkaryogram2 M-1324295KN1~B mFISH mBAND 2001A1 Idiogram_panel3 Konvenční cytogenetika 1-2ml 1. • ANd9GcT2aLB7GQrGPck8wtnGTrA7biFrQo_Sz0uZdYvV5ll71hX2Zpxo Kultivace 2/24/72hod/týdny NewsCO2 1. ü kostní dřeň ü periferní krev ü uzlina ü nádorová tkáň Postup kultivace buněk nádorů 37°C/ 5%CO2 ZPRACOVÁNÍ BUNĚČNÉ KULTURY • stock-photo-cell-culture-dishes-and-centrifuge-tube-58307962 1. • ANd9GcRufznt74zubdXmrMKJH_ckcnd2z2Y4ftTxrhLxfT7a9qjG1NYMUQ HYPOTONIZACE 0,075M KCl FIXACE ROZTOKEM KYS.OCTOVÉ A METANOLU v poměru 1:3 PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ KAPÁNÍM BB SUSPENZE NA SKLO Velké tečky BARVENÍ A HODNOCENÍ V MIKROSKOPU P1010056 msearch muz-symbol Klasická cytogenetika - karyotyp age1image1712000 G-banding; rozlišení 5-10Mb, např. chr 8 : 146Mb; ~500 genů,cMYC ~600kb, Konvenční cytogenetika Cytogenetické vyšetření In the first instance, banding analysis must be undertaken and, if an abnormal karyotype is found, a minimum of five abnormal metaphases must be fully analysed with a further five clonal metaphases counted and scored for additional structural changes if available. In the event of anormal karyotype 20 metaphases must be examined with at least ten fully analysed and the remainder counted and scored for structural abnormalities before the issue of a normal report. If 20 metaphases cannot be examined the normal report must be qualified (see section 5 on reporting). Cytogenetics and molecular genetics European recommendations and quality assurance for cytogenomic analysis of haematological neoplasms. Rack et al. Leukemia (2019) 33:1851–1867 Molekulární cytogenetika FISH mFISH mBAND arrayCGH/SNP array Molekulární cytogenetika •Metody založené na fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) vytváří spojení mezi metodami molekulární genetiky a klasické cytogenetiky •Metody využívající základní vlastnosti jednořetězcové DNA vzájemně se vázat na základě komplementarity bazí Denature Hybridization Denaturace Hybridizace centromerické celochromosomové genové Typy sond Nejčastěji jsou BAC sondy, do vektoru se vloží DNA o velikosti 100-200 kb. Image5A [USEMAP] Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace (mFISH) Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace (M-FISH) je molekulárně cytogenetická metoda založená na hybridizaci 24 fluorescenčně značených celochromosomových sond, které dovolují současně obarvení všech chromosomových párů odlišnými barvami. bandkaryogram2 •Kombinuje paintingové proby specifické pro danou oblast chromosomu • •Sondy připravené mikrodisekcí chromosomových oblastí • •Pruhování pokrývá celý chromosom • n Mband FISH Převzato I.Chudoba §Nádorová DNA je hybridizována společně s kontrolní DNA k hybridizačnímu sklu, na kterém jsou fragmenty genomické DNA/oligonukleotidy ArrayCGH – komparativní genomová hybridizace age3image1802944 Rozlišení aCGH/SNPs ∼400kb (25–85-mer oligonucleotides) GeneChip 6.0 (906 600 SNP sequences a 900 000 nonpolymorphic oligonucleotides, an average spacing of 0.7 Kb, tj 700bp). The microarray-principle, as exemplified by the Genechip® 250k NSP SNP-array (Affymetrix). The array contains assays against approximately 250.000 SNPs, distributed in small rectangular features on the array. Fluorescently labeled DNA is hybridized to the array, and the fluorescent intensity for each feature is then detected. The photograph of array cartridges and the schematic representation of the array features are reproduced with courtesy of Affymetrix Genetické změny u hematologických malignit §90-95% nemocných s chronickou myeloidní leukémií (CML) §60-80% nemocných s akutní myeloidní leukémií (AML) §60% nemocných s myelodysplastickým syndromem (MDS) §50-80% nemocných s chronickou lymfocytární leukémií (CLL) §70-90% nemocných s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL) §60-90% nemocných s nehodgkinským lymfomem (NHL) §90% nemocných s mnohočetným myelomem (MM) 1.Diagnosa 2.Prognosa 3.Léčebné rozhodování Cytogenetika v hematologii Filadelfský chromosom (Ph) První specifická chromosomová změna u nádoru člověka Převzato: www.jaypeedigital.com 90-95% Ph chromosom výsledek translokace t(9;22)(q34;q21) Cytogenetika CML §Přídatné chromosomové změny Diagnosa CHF: ~12% Akcelerovaná fáze: ~30% Blastická zvrat : ~70% Diagnóza Prognóza •“major” route změny – +8 – +der(22)t(9;22) – +19 – i(17)(q10) – •“minor” route změny –+ 17, + 21 –- Y, -7, -17 –t(3;21) –t(4;6), t(2;16), t(1;21) Aberace Frekvence % +8 38 +Ph 30 i(17q) 20 +19 13 -Y 8 +21 7 +17 5 -7 5 t(3;21) 2 Komplexní změny 1 Přídatné změny u CML Mitelman ,Leuk Lymphoma 1993 Wang et al, Blood 2016 Přídatné chromosomové změny u CML Prognosa Relativně dobrá: +8,+Ph,-Y Relativně špatná: i(17) Aberace 3q26.3 -7/del7q Jaroso~1 Glivec (Imatinib) Type of Response Definition CHR Complete Hematologic Response Normal differential, WBC & platelets ≤ ULN MCyR Major cytogenetic Response 0–35% Ph+marrow metaphases CCyR Complete Cytogenetic Response 0% Ph+marrow metaphases MMR Major Molecular Response BCR-ABL/ABL ≤ 0.1% (International Scale) MR4.0 BCR-ABL/ABL ≤ 0.001% (IS) “4-log reduction” MR4.5 BCR-ABL/ABL ≤ 0.003% (IS) “4.5-log reduction” CMR Complete Molecular Response Undetectable BCR-ABL (test of sensitivity ≥4.5 logs) ELN sledování MRN CML cytogenetika CML – v době léčby inhibitory Table. TKI Treatments for CML5-10 *All TKIs administered with steroids NIL and DAS have significantly increased apoptosis more than IM by involving both intracellular calcium signaling as well as oxidative stress. WHO Classification §Od roku 2008 je cytogenetika součástí diagnostiky a klasifikace řady hematologických malignit § §Cytogenetika je součástí WHO klasifikace AML § §Společně s cytomorfologií stratifikuje nemocné s MDS a MPN § §Klasifikace lymfomů- histologie, cytogenetika a FISH potvrzují klasifikační zařazení § §Je součástí prognostické stratifikace u MM § WHO Classification 2022 WHO klasifikace AML 2016 2022 WHO prognostická stratifikace AML Grimwade D et al. Blood 2010;116:354-365 Stratifikace podle cytogenetických nálezů APL t(15;17)(q22;q12) / PML-RARA CBFB-Rearrangement m3v-kleiner K02b t(15;17)(q22;q12) PML-RARA Janet D Rowley et al. Lancet 1977 Cílená léčba nemocných s APL Schéma z práce [USEMAP] coactivator corepressor retinoid X receptor ALL – heterogenní onemocnění s monoklonální proliferací a expanzí nezralých lymfoidních buněk v KD, PK a dalších orgánech §Cytogenetika má prognostický význam §Diagnostický význam - imunofenotyp AKUTNÍ LYMFOBLASTICKÁ LEUKEMIE (ALL) Distribution of cytogenetic abnormalities from data collected from UK childhood ALL treatment trials. Christine J. Harrison Hematology 2013;2013:118-125 ©2013 by American Society of Hematology Dětské ALL Tvoří 30% všech dětských nádorů Distribution of cytogenetic abnormalities from data collected from UK childhood ALL treatment trials. (A) Relative incidence of the established cytogenetic abnormalities among childhood BCP-ALL. (B) Distribution of different cytogenetic subgroups according to age. The abnormalities are color coded and the incidence of each abnormality indicated according to age group. The relative incidence of T-ALL is also shown. IGH@ indicates all translocations except with CRLF2; CRLF2, IGH@-CRLF2 and P2RY8-CRLF2; hap/hypo, hypodiploidy (< 44 chromosomes); t(9;22), BCR-ABL1 positive; and HeH, high hyperdiploidy. § de novo MDS 40-60% § t-MDS nebo sekundární MDS 90% § SNPs+arrayCGH 70% Chromosomové změny u MDS Klinická heterogenita MDS je odrazem heterogenity získaných somatických genetických změn Myelodysplastický syndrom (MDS) §Refractory cytopenia with unilineage dysplasia (RCUD) §Refractory anemia with ringed sideroblasts (RARS) §Refractory cytopenia with multilineage dysplasia (RCMD) §Refractory anemia with excess blasts-1 (RAEB-1) §Refractory anemia with excess blasts-2 (RAEB-2) §Myelodysplastic syndrome, unclassified (MDS-U) §Myelodysplastic syndrome associated with isolated del(5q) WHO klasifikace MDS Prognostická stratifikace MDS Prognostický význam chromosomových změn u CLL Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A, Bullinger L, Dohner K, Bentz M, Lichter P: Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2000; 343:1910-1916. CYTOGENETIKA CLL Puiggros et al, BMRI 2014 CLL – prognostická a léčebná stratifikace Wiestner, Haematologica 2015 BCR signalizace u CLL •BCR (B cell antigen receptor) signalizace – nejdůležitější patogenetický mechanismus vedoucí k vývoji, progresi a relapsu CLL • Bruton tyrosin kináza (BTK) - hlavní součást BCR signální dráhy • Konstitutivní aktivace BCR signalizace – buněčná proliferace, přežívání a migrace • Inhibitor BTK blokuje BCR signální dráhu a indukuje apoptózu Pacient CLL05 SEC63 MYC TRAILR1,2 SEC63 Mutace TP53 a BTK Nehodgkinské lymfomy - NHL § Maligní lymfomy jsou heterogenní skupina nádorů lymfatické tkáně § Vznikají na základě genetických změn v původně normálních buňkách § Klasifikace lymfomů- histopatologie - WHO klasifikace lymfomů 2008 § Cytogenetika a FISH potvrzují klasifikační zařazení Folikulární lymfom (FL) indolentní B buněčný lymfom ~20 % všech lymfomů heterogenní klinický průběh , os několik roků až 20 let 90% nemocných má translokaci t(14;18)(q32;q21) http://www.multiweb.cz/guide/t1418.jpg Fúze IGH/BCL2 Nehodgkinské lymfomy (NHL) u dětí Převzato: Hochberg et al, BJH 2008 § 4-7% nádorů u dětí a mladistvých § incidence vzrůstá s věkem § zvýšené riziko děti s imunodeficitem (např. AT) § WHO klasifikace 2008 § Frekvence histologických subtypů odlišná od dospělých 48,X,-Y,del(1)(p13pter),+der(1)del(1)(q?24q?ter)t(1;4)(q23;?q?), +ider(1)(q11)del(1)(q?24q?ter)t(1;4)(q23;?q?),del(6)(q?15),+7,t(8;14)(q24;q32)(1.klon-56%) 11/2011 BURKITT LYMFOM (BL) Špunar_MFISH MNOHOČETNÝ MYELOM MM je B-buněčné nádorové onemocnění, charakterizované nekontrolovatelnou proliferací abnormálních plasmatických buněk v kostní dřeni. Walker B, MNOHOČETNÝ MYELOM 2015 http://image.slidesharecdn.com/multiplemyeloma-140429091154-phpapp02/95/multiple-myeloma-4-638.jpg? cb=1398763024 §Cytogenetika je nedílnou součástí diagnostických a prognostických stratifikací hematologických malignit i dětských solidních nádorů § §V jednom vyšetření analyzuje celý genom § §Dovoluje potvrdit klinickou diagnosu nálezem specifických chromosomových změn § §Nenáhodné rekurentní změny určují prognosu onemocnění § §Určení změny dovoluje monitorovat účinnost léčby ZÁVĚR