praktikum č. 11
HLA ANTIGENY
IMUNOLOGIE
TRANSPLANTACÍ
Major histocompatibility complex
(MHC)
Human leukocyte antigens
(HLA)
soubor 40-50 genů seřazených v úseku DNA
na chromozomu 6
hlavní histokompatibilní komplex (MHC) se u lidí
nazývá HLA (human leukocyte antigens)
MHC
(major histocompatibility complex)
soubor molekul zodpovědných za odvržení
transplantované tkáně nebo orgánu
(odtud název)
hlavní úloha MHC spočívá v prezentaci
antigenů T lymfocytům
MHC u člověka →
HLA (human leukocyte antigen)
STRUKTURA MOLEKUL MHC
prostorová struktura MHC I. a II. třídy je podobná
MHC I. třídy
těžký řetězec α nekovalentně spojen s ß2-mikroglobulinem
(kódovaným mimo MHC oblast)
řetězec α tvořen doménami pro vazbu peptidu (α1, α2),
doménou podobnou imunoglobulinové doméně (α3),
transmembránovou a cytoplazmatickou částí
MHC II. třídy
heterodimery 2 těžkých řetězců α a ß spojených
nekovalentní vazbou
řetězce tvořeny doménami pro vazbu peptidu (α1, ß1),
doménami podobnými imunoglobulinové doméně (α2, ß2),
transmembránovými a cytoplazmatickými částmi
SCHÉMA MHC I SCHÉMA MHC II
CHARAKTERISTIKA GENŮ MHC
Dvě třídy: MHC I a MHC II
MHC I předkládají (presentují) peptidy lymfocytům CD8+
MHC II předkládají (presentují) peptidy lymfocytům CD4+
POLYMORFISMUS
Geny MHC jsou nejpolymorfnějšími geny v genomu
(cca 500 alel HLA)
KODOMINANTNÍ EXPRESE
Každý jedinec má dvě alely (od obou rodičů); označují se
číslicemi (např. HLA-A2, HLA-B5, HLA-DR3 …)
soubor MHC alel na chromosomu se nazývá
haplotyp
CHARAKTERISTIKA GENŮ MHC
dvě třídy: MHC I a MHC II
klasické MHC glykoproteiny I. třídy
3 IZOTYPY → HLA-A, HLA-B, HLA-C
neklasické MHC glykoproteiny I. třídy
HLA-E, HLA-F, HLA-G a také CD1
nejsou produkty MHC genů, ale strukturálně a funkčně k nim mají velmi blízko
MHC glykoproteiny II. třídy
3 IZOTYPY → HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP
CHARAKTERISTIKA INTERAKCÍ
MEZI MHC A PEPTIDY
MHC molekuly neodlišují peptidy vlastní a cizí
imunnogennost proteinových antigenů je určena schopností
buněk předkládajících antigen vytvořit peptidy, které se budou
vázat na vlastní molekuly MHC
MHC molekuly vážou v 1 chvíli jeden peptid, ale celkově
mohou vázat řadu strukturálně podobných peptidů (x TCR-
epitop)
vazba je nekovalentní, ligand je lineární a sestává z 8-11
aminokyselin (MHC I), resp. z 10-30 aminokyselin (MHC II)
T lymfocyty jsou schopny poznávat i lipidové a glykolipidové
struktury: je to populace NK-T, která poznává tyto antigeny
„neklasickými molekulami MHC“ → CD1
EXPRESE MOLEKUL MHC NA BUŇKÁCH
MHC I třídy jsou přítomny na všech jaderných
buňkách (tedy ne na erytrocytech!)
exprese MHC I je na většině buněk zvýšena působením IFN,
TNF, LT (tedy při vrozených imunitních reakcích)
MHC II třídy jsou konstitučně přítomny na buňkách
imunitního systému (buňky předkládající antigen →
dendritické buňky, makrofágy, B-lymfocyty), dále
na buňkách endotelových a na epitelu thymu
expresi MHC II na buňkách prezentujících antigen (ne však
na neuronech) zvyšuje IFN-g
PŮVOD A ZPRACOVÁNÍ ANTIGENŮ
HLA antigeny I. třídy
prezentuje cytoplazmatické antigeny
(peptidové fragmenty proteinů kódovaných infikujícími viry
či intracelulárními parazity, peptidy aberovaných buněk,
např. nádorových, extracelulární antigeny uvolněné do
cytoplazmy a podobně)
proteolytická degradace antigenů v proteasomech
transport peptidů do ER → vazba na molekulu HLA I
komplex HLA I s antigenem přes Golgiho systém exocytózou
na povrch buňky
prezentuje pohlcené extracelulární peptidy
(mikrobiální antigeny)
proteolytická degradace proteinů v endosomech
a lysozomech
molekula HLA II v ER zablokována pro vazbu peptidu,
transportována přes Golgiho systém do
endosomu/lysosomu
vazebná část HLA II molekuly v endosomu/lysosomu
uvolněna → navázání peptidu a transport exocytózou
na povrch buňky
PŮVOD A ZPRACOVÁNÍ ANTIGENŮ
HLA antigeny II. třídy
PREZENTACE ANTIGENŮ LYMFOCYTŮM T
T-lymfocyty poznávají antigeny pouze ve formě
peptidových fragmentů vázaných na MHC
glykoproteinech I. nebo II. třídy
(tzv. fenomén MHC-restrikce)
MHC I. třídy
prezentace antigenů
cytotoxickým T lymfocytům CD8+
MHC II. třídy
prezentace antigenů
pomocným T lymfocytům CD4+
GENETIKA HLA
HLA systém je na krátkém raménku 6. chromozomu
soubor MHC genů na 1 chromosomu se nazývá haplotyp
nízká míra rekombinace mezi geny na jednotlivých lokusech →
určité kombinace se vyskytují častěji než by odpovídalo volné
kombinovatelnosti alel = vazebná nerovnováha
kodominantní exprese
každý jedinec má dvě alely (2 haplotypy) → jeden
od každého z rodičů
vysoká míra polymorfizmu
geny MHC jsou nejpolymorfnějšími geny v genomu
je obtížné najít 2 jedince s plnou shodou MHC genů
HLA TYPIZACE
stanovení HLA výbavy konkrétního jedince
serologické techniky – stanovení antigenu
(HLA-A2)
mikrolymfocytotoxický test
HLA I. třídy (na ústupu)
cross-match test
screening anti-HLA protilátek
relativně rychlá a levná
molekulárně genetické metody – určení alely
(HLA-A*0201)
sekvenčně specifická PCR, hybridizace specifických sond,
sekvenace
vyšší přesnost a spolehlivost typizace
nízké (HLA-DR*03) nebo vysoké (HLA-DR*0302) rozlišení
vyšší náklady
KLINICKÉ VYUŽITÍ HLA TYPIZACE
asociace molekul HLA systému s chorobami
transplantologie
ASOCIACE MOLEKUL HLA SYSTÉMU S
CHOROBAMI
choroby s imunologickou patogenezí
(např. revmatoidní arthritida, juvenilní diabetes, celiakie a další)
choroby s etiopatogenezí nejasnou
(m. Bechtěrev, psoriasis vulgaris)
choroby, u nichž se imunopatogenetický mechanismus
neuplatňuje
(narkolepsie, idiopatická hemochromatóza, adrenogenitální syndrom)
možné příčiny
HLA antigen je znakem přítomnosti defektního genu, který
se nachází v blízkosti HLA (vazebná nerovnováha)
selhání mechanizmu negativní selekce autoreaktivních
T lymfocytů
selhání funkce regulačních T lymfocytů
HLA antigeny jsou receptory pro mikroby → fenomén
molekulárního mimikry a zkřížená reaktivita
VZTAH ANTIGENŮ HLA K CHOROBÁM
narkolepsie
HLA-DQ6
M. Bechtěrev
HLA-B27
Celiakie
HLA-DQ2 a HLA-DQ8
juvenilní diabetes mellitus
HLA-DR3/4
revmatoidní arthritida
HLA-DR4
ANKYLOZUJÍCÍ SPONDYLARTRITIS
(M. BECHTĚREV)
postiženi především muži
začíná obvykle sakroileitidou → postupně postižena celá páteř
dochází k fibrotizaci až osifikaci intervertebrálních kloubů a
ligament (mohou být postiženy i kyčelní a ramenní klouby)
mimokloubní příznaky → iridocyklitida, aortitida
většina pacientů (90%) je HLA-B27 pozitivních (x 3-10%
zdravých; vysoká negativní prediktivní hodnota vyšetření!)
jen u asi 2% HLA-B27 pozitivních pacientů se rozvine AS
obvykle je přítomna hypergamaglobulinémie a zánětlivé
příznaky
CELIAKIE (GLUTENOVÁ ENTEROPATIE)
klasické klinické příznaky
dítě ve věku 4–24 měsíců → zvracení, steatorhea,
objemné stolice 1–3x denně, neprospívání, malá postava
v současnosti stále větší počet pacientů diagnostikován ve
vyšším věku s nevýraznými nespecifickými příznaky
průjmy, úbytek na váze, abdominální dyskomfort, únava,
periferní neuropatie, nutriční deficience, anemie,
osteoporóza, psychické poruchy, infertilita
neléčená celiakie je asociována se vznikem střevního
lymfomu!
95% pacientů jsou nositelé HLA-DQ2 a/nebo HLA-DQ8
(také 20% zdravé populace; vysoká negativní prediktivní
hodnota vyšetření HLA)
CELIAKIE
výskyt autoprotilátek
lze prokázat protilátky proti řadě antigenů
gliadinu
endomysiu hladkého svalstva
tkáňové transglutamináze
za nejspecifičtější je v současné době považováno
vyšetření
autoprotilátek proti tkáňové
transglutamináze (anti-tTG) ve třídě IgA
IMUNOLOGICKÉ ASPEKTY TRANSFUZE KRVE
transfúze krve představuje nejčastější druh
transplantace v klinické praxi
polysacharidové antigeny krevních skupin
nejdůležitější je systém ABO
proteinové antigeny
nejdůležitější je systém Rh
IMUNOLOGICKÉ ASPEKTY TRANSFUZE KRVE
polysacharidové antigeny
nejdůležitější je systém ABO
antigeny mohou být přítomny i v sekretech a na mnoha
epiteliálních a endoteliálních buňkách
základní strukturou ABO antigenů je substance H
(velmi řídce se vyskytuje tzv. bombajský fenotyp →
nepřítomnost H-substance)
protilátky proti polysacharidovým antigenům krevních
skupin → isohemaglutininy
vyskytují se přirozeně → zejména ve třídě IgM
PŘIROZENÉ ISOHEMAGLUTININY
(IgM)
krevní skupina A → isohemaglutininy anti-B
krevní skupina B → isohemaglutininy anti-A
krevní skupina 0 → isohemaglutininy anti-A, anti-B
krevní skupina AB → isohemaglutininy anti-A ani anti-B
nejsou přítomny
křížová zkouška (cross-match test)
sérum příjemce + erytrocyty dárce
TRANSFUSE KRVE
systém krevních skupin AB0
0: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal
l
Fuc
A: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal-GalNAc
l
Fuc
B: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal-Gal
l
Fuc
IMUNOLOGICKÉ ASPEKTY TRANSFUZE KRVE
proteinové antigeny
nejdůležitější je systém Rh
Rh faktor je pojmenován podle makaků Macaca
mulatta (anglicky Rhesus Macaque), u kterých jej
Landsteiner a Wiener objevili
Rh faktor je zapříčiněn skupinou zhruba 40 antigenů,
ale nejvýznačnějších je pět antigenů uložených na třech
genech → nejdůležitější je antigen D
protilátky proti antigenu D se vyskytují až po antigenní
stimulaci → podstatné zejména ve třídě IgG
MALÉ KREVNÍ SKUPINY
systém MNS
silně glykosylované proteiny (glycophoriny) nesou antigeny
M, N, S, s
protilátky IgG i IgM (podle cílového antigenu)
systém Duffy
glykoprotein, nejvýznamnější antigeny jsou Fya a Fyb
protilátky IgG
systém Kell
glykoprotein, nejvýznamnější je K antigen
protilátky IgG
třetí nejčastější příčina hemolytické reakce novorozenců
systém Lewis
antigeny Lea a Leb jsou součástí antigenů ABO systému
protilátky IgM
INKOMPATIBILITA V RH SYSTÉMU
MEZI MATKOU A PLODEM
sensitizace Rh- matek plodem Rh+
v následné graviditě IgG anti-Rh protilátky přestupují
přes placentu
hemolytický účinek
Komplementový systém, fagocyty, NK buňky →
erythroblastosis fetalis
diagnostika → Coombsův antiglobulinový test (přímý,
nepřímý)
profylaxe → anti Rh sérum do 72 hodin po porodu nebo
abortu
TRANSFÚZE KRVE
komplikace
po převodu krve neslučitelné v systému AB0
dochází k hemolytické reakci, která je způsobena
intravaskulární destrukcí červených krvinek
protilátkami příjemce
příznaky
bolesti na hrudi, v zádech, dušnost, neklid,
horečka s třesavkou, zvracení, hypotenze,
šokový stav. Přežije-li nemocný šokový stav,
objeví se do 24 hod. žloutenka, selhání ledvin,
krvácení z diseminované intravaskulární
koagulace, trombocytopenie a fibrinolýzy
TRANSFÚZE KRVE
komplikace na imunologickém podkladě
reakce vyvolané protilátkami proti leukocytům a
trombocytům
asi u 1/3 nemocných s těmito protilátkami po opakovaných
transfuzích
do 3 hodin po převodu se mohou rozvinout příznaky (horečka,
třesavka, zimnice, bolesti hlavy, zrudnutí, tlak na hrudi, kašel)
alergické reakce → kopřivka, laryngospasmus
anafylaktoidní reakce → anti-IgA protilátky
aloimunizace
TRANSFÚZÍ INDUKOVANÁ GVHR
podané lymfocyty obsažené v transfuzním přípravku
mohou u imunokompromitovaných pacientů nebo při
příbuzenské transfuzi uniknout imunitnímu dohledu
příjemce a následně reagovat na antigeny příjemce a
projít klonální expanzí a tvořit protilátky proti příjemci
může být způsobena podáním neozářené krve
imunodeficitnímu pacientovi (např. T-buněčný primární
imunodeficity, leukémie) → terapeuticky prakticky
nezvládnutelná
imunokompromitovaným pacientům nutné podávat
ozářené transfuzní přípravky
(deleukotizace není dostatečně efektivní)
TRANSPLANTACE
přenosy tkání nebo orgánů
nahrazují nefunkční tkáň nebo orgán příjemce zdravým
ekvivalentem
typy transplantací
dle příjemce → autogenní (přenos z téhož jedince),
isogenní (přenos z monogenního jedince –
jednovaječného dvojčete), alogenní (přenos z jiného
jedince téhož druhu), xenogenní (přenos z jedince jiného
druhu)
dle štěpu → orgánové/tkáňové
zásadní úloha imunitních pochodů → význam MHC
rejekce (odvržení, odhojení) štěpu
reakce štěpu proti hostiteli (Graft Versus Host Reaction)
shoda mezi dárcem a příjemcem štěpu v HLA
znacích
snížení výskytu komplikací
vyšší úspěšnost transplantací
delší přežívání pacientů i transplantátů
zvýšení kvality života pacientů po transplantaci
imunitně zprostředkované komplikace
transplantace
rejekce štěpu
reakce štěpu proti hostiteli (GvHD)
HLA A TRANSPLANTACE
TRANSPLANTACE
VYŠETŘENÍ PŘÍJEMCE ŠTĚPU
určení krevní skupiny AB0
typizace HLA I (A, B, C) a HLA II (DR, DQ) třídy
přítomnost autoprotilátek
preformované aloprotilátky
crossmatching
kultivace směsi lymfocytů
TYPIZACE HLA
typizace HLA I (A, B, C), HLA II (DR, DQ)
transplantace ledvin (A, B, DR → nízké rozlišení)
HSCT (A, B, C, DR, DQ → vysoké rozlišení)
SEROLOGICKÉ METODY
lymfocytotoxický test
reakce protilátek s antigenními determinantami na povrchu lymfocytů
(jamky mikrotitračních destiček s různými protilátkami proti HLA –
přidání lymfocytů – tvorba imunokomplexů – aktivace komlementu
– lýza buněk – barvení – odlišení živých a mrtvých buněk)
MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ TYPIZACE
PCR
PREFORMOVANÉ ALOPROTILÁTKY
screening výskytu preformovaných anti-HLA protilátek
(porody, transfúze, transplantace)
zejména protilátky IgG anti-HLA I. třídy mohou být
spojeny s rizikem hyperakutní rejekce
vlastní stanovení se provádí testováním séra za využití
buněčného panelu několika desítek buněk, jenž mají
známé HLA antigeny
testování probíhá pomocí lymfocytotoxického crossmatch
testu nebo pomocí metody ELISA či průtokové
cytémetrie (výrazně citlivější cross-match test)
CROSS MATCH TEST
po nalezení vhodného dárce testuje, zda pacient
nemá protilátky specificky reagující s buňkami
dárce
sérum příjemce + lymfocyty dárce
cytotoxický test či průtoková cytometrie
TRANSPLANTACE
rejekce štěpu
rejekce hyperakutní
rozvoj během minut
protilátky proti AB0 nebo preformované protilátky
proti HLA antigenům
rejekce akutní
po prvním týdnu
je způsobena efektorovými lymfocyty T příjemce,
namířenými proti HLA antigenům dárce, a protilátkami
rejekce chronická
asi po půl roce
reakce pozdní přecitlivělosti, vedoucí k fibróze, poškození cév
a ztrátě funkce štěpu
imunosupresivní léčba
TRANSPLANTACE
HEMATOPOETICKÝCH BUNĚK
užívá se buď kostní dřeň nebo izolované periferní CD34+
kmenové buňky
cílem je osídlit dřeň příjemce kmenovými buňkami dárce
s následnou obnovou krvetvorby
nutnost HLA typizace s vysokým rozlišením – požadována
co největší shoda v HLA systému
INDIKACE
maligní nádory
(leukémie, lymfomy, vybrané solidní tumory - neuroblastom)
selhání kostní dřeně
(aplastická anémie)
závažné primární imunodeficity
transplantace kmenových buněk
T lymfocyty ve štěpu dřeně rozeznávají tkáňové antigeny
příjemce jako cizorodé
transplantace solidních orgánů
T lymfocyty v transplantátu (např. játra) není možné dobře
vymýt – cílovým orgánem GvHD je kostní dřeň
klinické příznaky
makulopapulární exantém, generalizovaná erytrodermie,
puchýře, deskvamace
hepatopatie, zvýšení koncentrace bilirubinu v séru
průjem, velké bolesti břicha, ileus
REAKCE ŠTĚPU PROTI HOSTITELI
(GRAFT VERSUS HOST REACTION, GVHR)
REAKCE ŠTĚPU PROTI LEUKÉMII
(GRAFT VERSUS LEUKEMIA, GVL)
reaktivita dárcovských T lymfocytů přenesených
společně s kmenovými buňkami vůči zbytkovým
leukemickým buňkám příjemce
příjemce je v imunosupresi → spojeno vždy i s
GvHD
suspenze kmenových buněk bez T lymfocytů +
injekce malého množství T lymfocytů dárce
(T lymfocyty vzniklé z nové kostní dřeně prochází
thymovou výchovou)
IMUNOSUPRESIVNÍ LÉČBA
indikována především u autoimunitních chorob,
vaskulitid, a u pacientů po transplantacích
výjimečně používána u těžkých alergických chorob
nebo u onemocnění způsobených nadměrnou
aktivací T-lymfocytů (psoriáza)
léčba vždy vede k sekundárnímu imunodeficitu náchylnosti
k infekcím a častějšímu výskytu
malignit, zejména lymfatického systému
ke snížení výskytu vedlejších reakcí se obvykle
používá kombinovaná léčba
MECHANISMUS ÚČINKU IMUNOSUPRESIVUM
ovlivnění genové exprese glukokortikoidy
ovlivnění metabolismu DNA alkylační agens cyklofosfamid
inhibice syntézy purinů azathiorin, kladribin, mykofenolát
inhibice syntézy pyrimidinů leflunomid, teriflunomid
antifolika metotrexát
vazba na imunofliliny kalcineuronové inhibitory cyklosporin, takrolimus,
pimekrolimus
inhibitory mTOR sirolimus, everolimus
kinázové inhibitory nintedanib, tofacitinib, baricitinib
imunoglobuliny polyklonální IVIG, anti-thymocytární globulin
monoklonální viz následující slide
fúzní proteiny a analoga cytokinů abatacept, belatacept, etanercept
analoga cytokinů anakinra
další apremilast, fingolimod, pirfenidon,
talidomid, lenalidomid,
pomalidomid
MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY POUŽITÉ V KLINICKÉ PRAXI
infliximab anti-TNFα revmatoidní a psoriatická artritida, psoriáza, Crohnova
choroba, ulcerózní kolitida, ankylozující spondylartritida
rituximab anti-CD20 revmatoidní artritida, mikroskopická polyangiitida
a granulomatóza s polyangiitidou
natalizumab anti-alfa-4-integrin roztroušená skleróza
brodalumab anti-IL-17 psoriáza
ekulizumab anti-C5 paroxysmální noční hemoglobinurie, atypický
hemolytickouremický syndrom, myasthenia gravis
tocilizumab anti-IL-6 revmatoidní a juvenilní idiopatická artritida
kanakinumab anti-IL1beta syndromy periodických horeček, Stillova choroba
a dnavá artritida
další monoklonální
protilátky registrované v ČR
jako imunosupresiva
adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, belimumab, brodalumab,
certolizumab pegol, ekulizumab, golimumab, guselkumab, ixekizumab,
okrelizumab, sarilumab, sekukinumab, ustekinumab, vedolizumab
PŘEHLED MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK
REGISTROVANÝCH V ČR JAKO
IMUNOSUPRESIVA
GLUKOKORTIKOIDY
jako imunosupresiva
imunosupresivně působí především dávky 0,5-1 mg
Prednisonu/kg/den → udržovací dávka bývá u
dospělých 5-10 mg Prednisonu/den
mechanismy účinky
snížená produkce cytokinů (IL-1, TNF-a, IL-2)
snížení exprese adhezivních molekul
inhibice exprese HLA antigenů II. třídy
inhibice fosfolipázy A2 v granulocytech → blok tvorby
metabolitů kyseliny arachidonové
Vedlejší nežádoucí činky → redistribuce tuku, vznik vředové
choroby, steroidní diabetes, hypertenze, poruchy růstu dětí,
hypokalémie, osteoporóza, katarakta, psychózy a další
IVIG V LÉČBĚAUTOIMUNITNÍCH
CHOROB A VASKULITID
léčba je někdy vysoce účinná → nelze však predikovat
u kterého konkrétního pacienta
vysoké náklady na léčbu
jednoznačnou indikací je prevence koronárních
aneurysmat u Kawasakiho choroby
možné mechanismy
blokáda Fc-receptorů na fagocytujících buňkách
inhibice tvorby protilátek včetně autoprotilátek
přítomnost anti-idiotypových protilátek
inhibice aktivace komplementového systému