Průtoková cytometrie Mgr. Ondřej Vymazal Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology1 Úvod ̶ Co je to průtokový cytometr? ̶ K jakým aplikacím se využívá? ̶ Jak funguje? Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology2 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology3 Otázka pro chatGPT: vysvětli, co je analytická cytometrie tak, jako bys to vysvětloval dorostenci ve třetím ročníku obecného gymnázia . Zkus použít jednoduchý jazyk a příklady, které by dorostenec mohl snadno pochopit. Co je analytická cytometrie je technika, která nám umožňuje podrobně zkoumat buňky. Buňky jsou základní stavební kameny všeho živého, včetně nás samotných. Představ si, že máš velkou krabici LEGO kostiček různých barev a tvarů a chceš zjistit, kolik je v nich červených kostiček. Mohl bys je samozřejmě vysypat a počítat je jednu po druhé, ale to by trvalo dlouho. Místo toho můžeš použít speciální přístroj, který prohlédne všechny kostičky a řekne ti, kolik z nich je červených. To je podobné tomu, co dělá analytická cytometrie, ale místo LEGO kostiček se díváme na buňky. Když chceme zjistit něco konkrétního o buňkách, například kolik z nich má určitou molekulu, můžeme je označit speciálním barvivem , které se přichytí jen na buňky s touto molekulou. Pak použijeme přístroj zvaný cytometr, který rychle prohlédne všechny buňky a řekne nám, kolik z nich má toto barvivo. Tato technika je velmi důležitá v mnoha oblastech vědy a medicíny. Například, může nám pomoci zjistit, jaké typy buněk jsou přítomny v krvi pacienta s určitou nemocí, nebo jak reagují buňky na nový lék. Introduction ̶ What is the Flow cytometr? ̶ For which aplication it can be used? ̶ How does it work? ̶ Co je to průtokový cytometr? Introduction Úvod ̶ Co je to průtokový cytometr? Přístroj, který počítá částice/buňky a měří parametry u každé jednotlivé z nich. ̶ K jakým aplikacím se využívá? ̶ Jak funguje? Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology6 Introduction Úvod ̶ Co je to průtokový cytometr? Přístroj, který počítá částice/buňky a měří parametry u každé jednotlivé z nich. ̶ K jakým aplikacím se využívá? Fenotypizace, analýza buněčného cyklu, viabilita, funkční analýzy. ̶ Jak funguje? Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology8 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology9 Úvod ̶ Co je to průtokový cytometr? Přístroj, který počítá částice/buňky a měří parametry u každé jednotlivé z nich. ̶ K jakým aplikacím se využívá? Fenotypizace, analýza buněčného cyklu, viabilita, funkční analýzy. ̶ Jak funguje? Proud jednotlivých buněk v suspenzi protéká skrz paprsek světla a na základě rozptylu a odrazu světla buňkou cytometr měří jejich vlastnosti. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology10 11 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology12 Trocha historie ̶ 1940-1950 Vývoj principů, které se využívají v průtokové cytometrii, jako jsou fluorescenční barvy, počítaní částic v proudu vzduchu. ̶ 1953 – Laminární proudění. ̶ 1956 Wallace Coulter – Měření změn vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem. ̶ 1960-1970 Vývoj cytometru. ̶ Rozšíření a rozvoj průtokové cytometrie. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology13 Technické součásti Buňky v suspenzi proudí jednotlivě přes ozařovanou část, kde rozptylují světlo a emitují fluorescenci, která je detekována, filtrována a převedena na digitální hodnoty, které jsou analyzovány a uloženy v počítači. Fluidika Optika Elektronika 14 Cells in suspension flow individually across illuminated part where they scatter light and emit fluorescence, which is detected, filtered and converted to digital values analyzed and stored on your computer. Fluidics Optics Electronics Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology15 ̶ Laminární proudění. Fluidika Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology16 ̶ Hydrodynamické zaostřování zarovnává buňky v systému fluidiky, kde jsou buňky analyzovány. Fluidika Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology17 Technické součásti Buňky v suspenzi proudí jednotlivě přes ozařovanou část, kde rozptylují světlo a emitují fluorescenci, která je detekována, filtrována a převedena na digitální hodnoty, které jsou analyzovány a uloženy v počítači. Fluidika Optika Elektronika Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology18 Optika ̶ UV/Arc lamps ̶ Lasers zdroj světla/laser Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Deparmetment of Biology19 Optika Optické dráhy ̶ Dráha světla od ozářené buňky až k detektoru. ̶ Optické části oddělují jednotlivé vlnové délky. 20 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 21 Optika Filtry ̶ Používají se k oddělení vlnových délek. ̶ V úhlu 45° fungují jako dichroická zrcátka. 22 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 525/50 (rozsah) 525+/-25 = 500 až 550 23 Optika Optické kanály ̶ Informace o povrchových vlastnostech a velikosti buňky. ̶ Umožňuje rozlišit živé buňky. ̶ Informace o granularitě, inkluzích a hustotě buňky. ̶ Můžem rozlišit buňky podle granularity. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 24 Optika ̶ Fluorescence emitovaná každým flourochromem je detekována specifickým fluorescenčním kanálem. ̶ Specificita detekce je zaručena selektivitou filtrů a zrcátek. Optické kanály Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 25 Optika Optické kanály Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 26 Detektory Optika ̶ Diody (používají se ve forward scatteru). ̶ Pouze pro silné signály, lepší linearita. ̶ Fotonásobiče (PMT detektory pro fluorescenci). ̶ Citlivé, ale mohou se poškodit přeexponováním vysokou silou laseru. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology27 BD Facs Canto II 28 Použití textu v prezentaci ̶ Máme zde několik úrovní odrážek, konkrétně tři. U všech textů by se mělo používat zarovnání odstavce vlevo. ̶ Položka odrážkového seznamu druhé úrovně. ̶ Druhá položka odrážkového seznamu druhé úrovně. Položka odrážkového seznamu třetí úrovně. Má velikost fontu 16 a doporučujeme nepoužívat menší velikost fontu z důvodu zajištění čitelnosti. ̶ Samozřejmě lze použít i běžný text bez odrážek. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 29 FACSCanto Laser Detector Fluorochromes 405 450/50 Pacific Blue, eFluor 450, V450, BV 421, Cascade Yellow, (DAPI) 510/50 AmCyan, BV 510, Krome Orange, V500, Cacsade Blue 488 530/30 FITC, Alexa Fluor 488, BB 515, CFSE, Fluo-3, GFP 585/42 PE, PI 670LP PerCP, PerCP-Cy 5.5, PC5, 7-AAD 780/60 PC7 633 660/20 APC, Alexa Fluor 647, eFluor 660 780/60 APC-Cy7, APC-H7, APC - Alexa Fluor 750, APC-eFluor 780 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 30 Zdroje fluorescenčního signálu Optika ̶ Protilátky značené fluorofory. ̶ Autofluorescence. ̶ Fluorescenční barvy – PI, GFP,... ̶ Jiné chemické látky s fluorescenčními vlastnosmi (léčiva, alkaloidy,…). Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Deparmetment of Biology31 Použití textu v prezentaci ̶ Máme zde několik úrovní odrážek, konkrétně tři. U všech textů by se mělo používat zarovnání odstavce vlevo. ̶ Položka odrážkového seznamu druhé úrovně. ̶ Druhá položka odrážkového seznamu druhé úrovně. Položka odrážkového seznamu třetí úrovně. Má velikost fontu 16 a doporučujeme nepoužívat menší velikost fontu z důvodu zajištění čitelnosti. ̶ Samozřejmě lze použít i běžný text bez odrážek. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Deparmetment of Biology32 Sestavení mnohobarvného panelu ̶ Párujeme silné fluorofory (např. PE) s markery, které jsou exprimovány v nízkých hladinách. ̶ Slabé fluorofory (např. Pacific Blue) párujeme s markery s vysokou expresí. 33 FACSCanto Laser Detector Fluorochromes 405 450/50 Pacific Blue, eFluor 450, V450, BV 421, Cascade Yellow, (DAPI) 510/50 AmCyan, BV 510, Krome Orange, V500, Cacsade Blue 488 530/30 FITC, Alexa Fluor 488, BB 515, CFSE, Fluo-3, GFP 585/42 PE, PI 670LP PerCP, PerCP-Cy 5.5, PC5, 7-AAD 780/60 PC7 633 660/20 APC, Alexa Fluor 647, eFluor 660 780/60 APC-Cy7, APC-H7, APC - Alexa Fluor 750, APC-eFluor 780 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology34 Technické součásti Buňky v suspenzi proudí jednotlivě přes ozařovanou část, kde rozptylují světlo a emitují fluorescenci, která je detekována, filtrována a převedena na digitální hodnoty, které jsou analyzovány a uloženy v počítači. Fluidika Optika Elektronika Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Deparmetment of Biology35 ̶ Když buňka prochází laserem, rozptýlené světlo vytvoří puls na senzoru. Electronika Zpracování signálu 36 Zpracování signáluElectronika Lin or log signal amplification Analog/digital conversion Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 37 Analýza datElectronika Zobrazení naměřených dat ̶ histogram ̶ dot plot ̶ isometric display ̶ contour plot ̶ chromatic (color) plots ̶ 3D projection Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 38 Analýza datElektronika Gatování Back gating Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology Ukázková prezentace LF MU v jednotném vizuálním stylu39 Kompenzace Ukázková prezentace LF MU v jednotném vizuálním stylu40 Kompenzace ̶ Nutné jsou jednobarevné kontroly pro každý fluorofor, který je použitý v koktailu protilátek pro daný experiment. ̶ K tomu využíváme značené buňky nebo kompenzační kuličky. ̶ Kompenzaci pak můžeme používat při opakování pokusu ve stejném nastavení, ale při změně protilátek musíme udělat novou kompenzaci. 41 Kompenzace ̶ Video o kompenzaci v BD software ̶ Compensation of a 7 color panel on the BD LSR II: https://youtu.be/5UHw4DIArx4 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 42 Phenotyping Využití Baumer, Y., Gutierrez-Huerta, C.A., Saxena, A. et al. Immune cell phenotyping in low blood volumes for assessment of cardiovascular disease risk, development, and progression: a pilot study. J Transl Med 18, 29 (2020). https://doi.org/10.1186/s12967-020-02207-0 Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 43 Cell cycle analysis Využití ̶ Fluorescent dyes binding DNA. ̶ Cells have to be fixed and permeabilized. ̶ Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) ̶ I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. ̶ Can be used to label viable cells. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 44 Cell cycle analysis Využití ̶ Software for analysis of distribution of cells in individual phases. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 45 Viability Využití ̶ Based on detection of membrane integrity. ̶ Some fluorescence dyes (PI,EBr) don´t leak into live cells. Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 46 Doxorubicin accumulation Využití ̶ Chemotherapeutic drug with fluorescent properties. ̶ Cells get rid of it from intracelular space using ABC-transporters in cytoplazmic membranes. Cytoplasm Outside ABC-transporter Doxorubicin Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 47 -DOXO +DOXO Verapamil Lignans Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology 48 Děkuji za pozornost! Flow cytometry, Ondřej Vymazal, Department of Biology