Katedra laboratorních metod LF MU                                              Bakalářské studium -
Zdravotní laborant, 2.ročník

                                                      Klinická biochemie cvičení – podzimní semestr


Praktické cvičení                                         datum……………………….jméno……………………………………..





Téma praktika:

Hmotnostní spektrometrie, Stanovení Busulfanu LC/MS

Hladina busulfanu v plazmě se stanoví po kapalinové extrakci metodou HPLC s MS detekcí. Busulfan se
používá před transplantací krvetvorných buněk jako základ vysokodávkované chemoterapie.Vedlejším
účinkem busulfanu je při vysokých dávkách hepatotoxicita.


Přístroje a pomůcky:

Pipety

Vortex

Centrifuga MPW-351

Kapalinový chromatograf 1290 Infinity II

Hmotnostní detektor 6470 LC/TQ


Reagencie, spotřební materiál:

1.       Mravenčan amonný

2.       dH[2]O

3.       Methanol

4.       Ethylacetát

5.       D8-Busulfan (interní standard)

6.       Kalibrační standard a kontroly (vlastní příprava)


Úkoly:


1)      Proveďte přípravu mobilní fáze, standardů, kontrol a vzorků


Mobilní fáze:

A1       1mmol/l mravenčan amonný (0,0631 g do 1 L dH[2]O)

B1       100% Methanol


Kontrola BUS 1, 2

Standard BUS 1-4

Vzorky pacienta (čas odběru 0h, 2h, 4h, 6h)



Materiál

                                                    Množství (μl)

Standard/Kontrola/Vzorek (do eppendorfek)

                                                    100 μl

Interní standard (d8-busulfan)

                                                    100 μl

                                       Promíchat na vortexu

Ethylacetát

                                                    800 μl

                              Intenzivně promíchat vortexem (t=10 s)

                            Centrifugace 4000 RPM (t=10 min) PROGRAM 1

Stáhnout supernatant do čistých, popsaných! zkumavek

                                                    600 μl

                                Odpařit ve vakuové odparce (50 °C)

Resuspendovat v mobilní fázi

                                                    300 μl

                     Přepipetovat do vialek s inserty ve stojánku a zavíčkovat




2)      Analýza LC/MS

MF:                 A1 1mmol/l mravenčan amonný    :          B1   100% Methanol

A1:B1         90:10


1.      Umístěte vzorky do správných pozic do autosampleru

2.      Umístěte MF do správných pozic v reagenčním prostoru

3.      Namontujte správnou kolonu

4.      Vyberte metodu na stanovení busulfanu

5.      Spusťte proplach mobilní fází

6.      Vytvořte worklist podle předlohy:


MF

STD1

STD2

STD3

STD4

K1

K2

VZ 0 hod

VZ 2 hod

VZ 4 hod

VZ 6 hod

                                                MF

                                             Proplach

                                              Standby


7.      Spusťte analýzu

8.      Vyhodnoťte kalibrační křivku, kontrolní a pacientské vzorky

9.      Vytiskněte výsledky




3)      Vyhodnocení

Program Microsoft Excel - výpočet AUC

4)      Otevřít ikonu Microsoft Excel, pak zminimalizovat (na lištu)

5)      Otevřít ikonu pk2.xla – vybrat „Povolit makra“

6)      Zadat do sloupce A čas v minutách (0,120,240, 360)

7)      Do sloupce B hladinu busulfanu v odpovídající minutě (ng/ml)

8)      V horní liště obrazovky vybrat fx , šipkou rozbalit „naposledy použité“ označit vlastní a
vybrat AUCO_t – OK

9)      Do conc_Data napsat b1 : b4 , myší přejít do Time_Data napsat a1 : a4 a OK

10)   Na dolním řádku je vypočteno AUC

11)   Css (stady state) vypočítat jako podíl AUC a doby monitorování ( AUC / 360 ), ponechat ng/ml

12)   Pak provést přepočet AUC na[µmol/l/min]


                         AUC [ng/ml/min]

        ---------------------------------------------- = AUC [µmol/l/min]

           246,3 (mol hmotnost busulfanu)


13)   Soubor – Konec – Ne


4) Výsledky


Čas odběru (hod)

                                                                                              c BUS ng/ml

                                                 0


2


4


6



K1


K2



AUC

                                                                                                                                             ng/ml/min

                                                AUC

                                                                                                                                            μmol/l/min

                                                Css

                                                                                                                                                 ng/ml


AUC – plocha pod křivkou

Css – koncentrace v ustáleném stavu



Závěr:
……………………………………………………………………………….……………………………………………………………………………….…………………………………………………………………………………………………
…….