Molekulární cytogenetika (FISH, array CGH, SNP array) Mgr. Miroslav Štolfa miroslav.stolfa@fnmotol.cz Mgr. Jana Drábová, Ph.D. Oddělení lékařské cytogenetiky, Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol Fluorescenční hybridizace in situ - FISH („Fluorescent in situ hybridization“) Princip metody: - přímo či nepřímo fluorescenčně značené jednořetězcové DNA sondy hybridizují na specifické sekvence v despiralizovaných vláknech DNA fixovaných jáder nedělících se buněk (interfázní FISH) a sekvence DNA v metafázních chromozomech (metafázní FISH) 1.denaturace sondy a cílové DNA 2.hybridizace sondy a cílové DNA – komplementarita 3.odstranění nespecifických signálů Materiál: - periferní a pupečníková krev, choriové klky, plodová voda, bukální stěr, materiál z potratu, vzorky z parafinových bločků (xylen) - nativní vzorky - pepsin Rybárová Katarína,nat Sondy: - nutnost znát cílovou sekvenci v genomu - vždy je třeba předem určit, jaké lokusy budou vyšetřeny - hodnotíme přítomnost, počet, lokalizaci a intenzitu signálů - sondy o délce několika kb až 1 Mb naštěpené na fragmenty o délce 200 až 400 pb 1)satelitní sondy – centromerické (α-satelitní DNA – unikátní pericentromerické oblasti) a telomerické (repetice 6pb „TTAGGG“) 2)lokus specifické sondy 3)celochromozomové („malovací“) sondy K:\Cytogenetika\FISH\Výsledky FISH - obrázky 2018\Stanilová nat. CVS FAST FISH 13,21 010a .JPG Strážnický Zdeněk V DGS 021 Lešovský Dominik V 16p11 Lešovský Dominik V 16p11 Modifikace metody FISH: WCP („whole chromosome painting“; obarvení celého chromozomu) M-FISH („multicolour FISH“; mnohobarevná FISH) SKY („spectral karyotyping“; spektrální karyotypování) M-BAND („multicoulour banding“; mnohobarevné pruhování) - aplikace na metafázní chromozomy odhalí a upřesní strukturní přestavby chromozomů - využití především v onkocytogenetice Laboratorní postup – 1. den: C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\FISH\IMG_20201029_124216.jpg preparát 2x SSC 80%, 96%, abs. ethanol 1. 2. 3. C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\FISH\IMG_20201029_125518.jpg 4. Laboratorní postup – 2. den: IMG_20201030_090422.jpg 5. 6. C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\FISH\IMG_20201030_090350.jpg 7. 0,4x SSC C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\FISH\IMG_20201030_091438.jpg Fluorescenční mikroskop: CCD kamera zdroj záření – výbojka Xe karusel s filtry okuláry objektivy makro- a mikrošroub FluorescenceFilters 2008-09-28 cs.svg filtr (zdroj: http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/fluor/fluor.htm) napájení zdroje záření a mikroskopu http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/fluor/FITC2.gif http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/fluor/fluorescence.gif C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\FISH\IMG_20201030_103132.jpg Analýza – software (Isis - MetaSystems, Lucia Cytogenetics ad.) Komparativní celogenomová hybridizace na čipu – array CGH („array Comparative Genomic Hybridization“) Princip metody: - odlišnými fluorochromy značené vyšetřovaná a referenční DNA kompetitivně kohybridizují se sondami na mikročipu - vyšetření celého genomu a odhalení submikroskopických zisků či ztrát genetického materiálu, tzv. variant v počtu kopií genomových segmentů (CNV; „copy number variations“) https://www.nature.com/scitable/content/41020/arrayCGH_Theisen_large_2.jpg (zdroj: https://www.nature.com/scitable/content/diagram-of-the-microarray-based-comparative-genomic-41020/) https://www.youtube.com/watch?v=s7WWd7zsCdU Sondy: - mikročip je v podstatě podložní sklo s pevně navázanými sondami - jednotlivé body (spoty) mikročipu jsou tvořeny klony: - 1)sondy BAC - krátké úseků lidské genomové DNA o velikosti 75 až 200 kb amplifikované pomocí umělých bakteriálních chromozomů (BAC; „bacterial artificial chromosome“) – knihovna BAC (označení RP_číslo) – nejdříve tvorba sond pro FISH 2) 2)oligonukleotidy - uměle syntetizované oligonukleotidy o délce jen 25 až 85 bazí WhatIsMicroarray_02 fragmenty ssDNA spoty/ body array/ pole/ mřížka CGH+mikroarray Historické okénko: 1 Mb / 100 kb 5 – 10 Mb Cy5 Cy3 https://www.dnalink.com/english/media/slide-design.jpg Agilent – SurePrint Technology (OGT, BlueGnome): SurePrint_ABCD Platformy: Odkaz na video: https://www.youtube.com/watch?v=eSr5CxAdiww Roche – NimbleGen technology: Roche NimbleGen oligonucleotide microarray. Maskless array synthesizer technology is depicted, which utilizes a digital micromirror device (DMD) to create virtual masks. The DMD forms the pattern of UV light needed to direct the specific nucleic acid addition during photo-mediated synthesis. UV light removes the photolabile protecting group (circles) from the microarray surface, allowing the addition of a single protected nucleotide to the growing oligonucleotide chain. The cycling of DMD filtering, light deprotection, and nucleotide addition creates oligonucleotide features 60 to 100 bp in length on the NimbleGen microarray. (Courtesy of Roche NimbleGen [copyright Roche NimbleGen, Inc.].) https://www.researchgate.net/profile/Yi-Wei_Tang/publication/26888549/figure/fig3/AS:27701689403392 6@1443057382670/Affymetrix-GeneChip-oligonucleotide-microarray-Top-Photolithography-UV-light-is.png Affymetrix – GeneChip technology: (ThermoFisher) Designy: - mikročipy navržené k vyšetřování klinicky významných genů a regionů genomu pro postnatální a prenatální genetiku (tzv. oblasti ISCA), dále pro preimplantační genetiku, onkogenetiku, kardiogenetiku, neurogenetiku ad. („custom“ čipy) Nutnost sjednotit aCGH design, protokol a interpretaci výsledku vedla ke vzniku ISCA: „International Standard Cytogenomic Array Consortium and Public Database „ (zdroj: Miller et al, Am J Hum Genet, 2010) Referenční DNA: - komerčně dodávané (Agilent, OGT, Kreatech) - - - - - - normální jedinec - kdo je normální? - - směs (pool) více jedinců - kolika? jakých? jaké množství? - jiný pacient - trojbodové kruhové uspořádání princip array Pacient A Pacient B Pacient C Indikace k vyšetření metodou array CGH •Postnatální: –materiál – venózní krev, bukální stěr, biopsie kůže ad. (tkáň plodu) – –pacienti bez kauzálního nálezu splňující indikační kritéria: •opoždění psychomotorického vývoje, intelektuální nedostatečnost, poruchy autistického spektra, ADHD, poruchy řeči a učení… •abnormality CNS (ageneze corpus callosum, sy Dandy-Walker), záchvaty, hypotonie, hypertonie… •VVV (např. srdce, gastrointestinálního/urogenitálního traktu, končetin a další) •makrocefalie/mikrocefalie, faciální stigmatizace, dysmorfické rysy… •prenatální/postnatální porucha růstu, neprospívání… –ke zpřesnění nebalancovaných přestaveb, zejména jejich rozsahu a vyloučení případné další kryptické přestavby –s nálezem balancované aberace, ale s abnormálním fenotypem (až 40 % je jen zdánlivě balancovaných) –segregace CNV v rodině – •Prenatální: –materiál – choriové klky, plodová voda, pupečníková krev – –UZ nález (> NT, oligo/polyhydramnion, hydrops, VCC, VVV CNS/GIT/končetin ad.) => vyšetření není podmíněno normálním karyotypem –de novo marker chromozom, de novo translokace u plodu –nejasný nebo neúplný karyotyp (komplexní přestavba, podezření na intersticiální aberaci ad.) Pin on Microarray Services specifická restrikce (Alu I + Rsa I) / nespecifická fragmentace vysokou teplotou pre-hybridizace s COT DNA (blokace repetitivních sekvencí) C:\Users\stolfa54341\Desktop\Prezentace IPVZ\array CGH\IMG_20201030_145738.jpg Postup metody array CGH: denaturace a značení (náhodné primery + dNTP + Cy3-dUTP + Cy5-dUTP + Klenowův fragmemt) purifikace a kvantifikace smísení značené DNA vzorku se značenou referenční DNA (elfo) koncentrace, čistota; elfo – fragmentace (resp. degradace) Odkaz na video: https://www.youtube.com/watch?v=zVdihEVbrBY Pin on Microarray Services „kapání čipu“ a hybridizace (video čas 0:00 – 8:48) „odmytí čipu“ – Wash Buffer 1 a 2 (video čas od 8:49) skenování analýza Analýza: inv dup del 11q – VCC (koarktace aorty), faciální dysmorfismus, cyanóza, abnormality končetin => dg. Jacobsenův syndrom Zápis ISCN (2016): arr[GRCh37] 11q23.3q25(118210301_133382894)x3, 11q25(133477198_134868407)x1 • genomové prohlížeče (např. UCSC Genome Browser) • • on-line databáze (DGV, OMIM, Decipher, ClinGen ad.) • • GeneReviews, PubMed, Google Scholar -1.0 [=log2(1/2)] cut-off: -0.3 +0.58 [=log2(3/2)] cut-off: +0.3 <-2 hmz del / -1 het del 0 +0.58 dup / >+1 amp (zdroj: Scionti et al., 2018) „Troubleshooting“: SNP array / array CGH+SNP SNP – „single nucleotide polymorphism“ – záměna jednoho nukleotidu s frekvencí v populaci > 1 %, polymorfizmus (vs. susp. mutace < 1 %) Princip metody: - https://www.fp-lims.com/wp-content/uploads/2019/01/Agilent-1.jpg CGH+SNP - komparativní metoda - nutnost kontrolní DNA se známým genotypem SNP array - nekomparativní metoda - bez kontrolní DNA - relativní detekce CNV dle intenzity signálů CGH+SNP - komparativní metoda - kontrolní DNA bez známého genotypu How Microarrays Work Illumina (ILMN) http://www.ipc.nxgenomics.org/newsletter/images/infiniumprotocol.jpg Odkaz na video: https://www.youtube.com/watch?v=lVG04dAAyvY LOH – „loss of heterozygosity“ – ztráta heterozygotnosti: (zdroj: agilent.com) (Agilent) Frekvence alely B (BAF; „B allele frequency“): (Illumina, OGT) (zdroj: illumina.com) Konsangvinita: (zdroj: de Leeuw, prezentace: SNP array analysis and interpretation in constitutional genome diagnostics, 2016) Záchytnost patologií u cca 10 % vzorků (včetně VOUS cca 20 %) 1. Agilent – CGH sondy v ISCA regionech a „backbone“ + sondy SNP („number of uncut alleles“) 2. OGT – CGH sondy v ISCA regionech a „backbone“ + sondy SNP („B allele frequency“) 3. Illumina – SNP array („B allele frequency“) 4. Affymetrix – SNP array („B allele frequency“) 1. 2. 3. 4. (zdroj: de Leeuw, prezentace: SNP array analysis and interpretation in constitutional genome diagnostics, 2016) Kazuistika č. 1: § Dandy–Walkerova anomálie § opoždění psychomotorického vývoje § faciální dysmorfie array CGH: • •duplikace terminální oblasti 5p15.33p15.1 o velikosti 15 Mb zahrnující 69 Ensembl genů, z toho 27 OMIM genů → dle mean log ratio profilu duplikace (0,18) se jedná o 10-20% mozaiku arr[GRCh37] 5p15.33p15.1(50093_15009591)x3 G–pruhování: •47,XY,+mar dn[10]/46,XY[28] Odehnal Dominik V Cri Du Chat 006a ØProkázána 15,8% mozaika aberantní buněčné linie s de novo nadbytečným marker chromozomem derivovaným z chromozomu 5, jenž je invertovanou duplikací oblasti 5p15.33p15.1 s neocentromerou. FISH: •ish nuc 5p15.31(FLJ25076x4),5p15.2(CTNND2x4),5q35(NSD1x2)[55/414] •ish der(5)(p15.31p15.2)(FLJ25076+,CTNND2++,FLJ25076+,NSD1-)[30/112] Odehnal Dominik V Cri Du Chat 007a Odehnal Dominik V Cri Du Chat 006a array CGH+SNP: • 3 kopie: 4 kopie: postnat.: VCC – ASD, centrální hypotonický syndrom, centrální koordinační porucha těžšího stupně, pes calcaneovalgus 14 měsíců: kraniofaciální dysmorfie, hypotonie, statná pastózní postava, hypoplastický genitál, nesestouplá varlata, celkově opožděný psychomotorický vývoj • array CGH periferní krve: SurePrint G3 ISCA v2 8x60K, Agilent karyotyp periferní krve: G-pruhování s rozlišením 450 pruhů S laskavým svolením Mgr. Žmolíkové z laboratoře CGB laboratoř a.s., Ostrava. 46,XY,dup(11)(q23.3q25)dn arr[GRCh37] 11q23.3q25(118210301_133382894)x3,11q25(133477198_134868407)x1 15,2 Mb OMIM: 104 1,4 Mb OMIM: 8 Kazuistika č. 2: R2: ID – intelektuální nedostatečnost KD – kraniofaciální dysmorfie MM – malformace mozku VCC – vrozená srdeční vada R3: KTH – kongenitální tříselná hernie (Ben-Abdallah-Bouhjar et al., 2003; upraveno) Þpatologický nález vysvětlující fenotyp •nerekurentní inv dup del: dvouřetězcový zlom – fúze chromatid • • • • • • • • • (Zuffardi et al., 2009; upraveno)