KLINICKÁ CYTOGENETIKA
vytvořilo CMBG FN Brno
zpracovala Mgr. Eva Hladílková, PhD
DEFINICE A HISTORIE
• klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromosomů
(jejich počtem a morfologií), jejich segregací v meióze
a mitóze a vztahem mezi nálezy chromosomových
aberací a fenotypovými projevy.
• vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku
1956, kdy Tjio a Levan vyvinuli efektivní metodiky analýzy
chromosomů a stanovili, že normální počet lidských
chromosomů je 46.
ZMĚNA ORGANIZACE
GENETICKÉHO MATERIÁLU
BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU
SOMATICKÝCH BUNĚK
chromosomy = spiralizované molekuly DNA
počet chromosomů v normálním karyotypu
člověka = 46
soubor chromosomů z 1 buňky na
mikroskopickém sklíčku = mitóza
(pojmem „mitóza“ označujeme také proces
dělení jádra a následně buňky)
DNA rozptýlená v buněčném jádře
(interfáze)
chromosomy se kondenzují při buněčném dělení
Metody klasické cytogenetiky vyžadují přítomnost
chromosomů (spiralizovaných struktur) na
mikroskopickém sklíčku - mitóz, metody molekulární
cytogenetiky pracují buď s mitózami nebo
s interfázními jádry.
GENETICKÝ MATERIÁL JÁDRA
BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU
Buněčný cyklus somatických buněk (interfáze, mitóza, cytokineze)
- G1, S, G2 fáze = INTERFÁZE
nejdelší fáze buněčného cyklu,
chromatin je málo kondenzovaný
(různé stupně spiralizace)
- M fáze = MITÓZA + cytokineze
dělení jádra a následně buňky kondenzace
chromatinu,
vznik chromosomů, rozchod
chromosomů do dceřiných buněk
Spiralizované chromosomy v metafázi mitózy vyšetřujeme
ve světelném mikroskopu.
CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM
BUNĚČNÉHO CYKLU
kondenzace chromatinu, vznik chromosomů
Během buněčného cyklu se chromatin nachází
v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký
stupeň spiralizace, během mitózy postupná
kondenzace, maximální v metafázi mitózy)
Ou H.D. et.al: ChromEMT: Visualizing 3D chromatin
structure and compaction n interphase and mitotic cells
Science. 2017 July 28; 357(6349): . doi:10.1126/science.aag0025. Hierarchical chromatin-folding model.
CHROMOSOMY V PRAXI
metafázní chromosom – součástí jsou 2 sesterské chromatidy
schema chromosomu chromosom s G- pruhy
chromosom
konvenčně barvený
chromosom
metoda FISH
telomerická oblast
telomerická oblast
Klasická cytogenetika Molekulární cytogenetika
Metody molekulární
cytogenetiky budou
předmětem
prezentace jiného
přednášejícího.
Světelný mikroskop + systém analýzy
obrazu
Chromosomy připravené metodami klasické cytogenetiky
hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení
1000x – 1250x za použití imerzních objektivů. Při vyšetření
je preparát prosvěcován viditelným světlem.
Dokumentaci mitóz a třídění chromosomů, sestavení
obrázku – karyogramu provádíme v dokumentačním
systému (Lucia, Laboratory Imaging,s r.o.)
kamera
CHROMOSOMY - KARYOTYP
• karyotyp = soubor chromosomů
v somatických buňkách pacienta, který
po zhodnocení minimálně 10 mitóz získaných
z vyšetřované tkáně charakterizujeme
zápisem a doplňujeme karyogramem
(obrázkem vytvořeným z nasnímaných
chromosomů z jedné mitózy, které jsou
utříděné do párů a skupin). Zápis karyotypu
pacienta souhrnně vyjadřuje karyotyp všech
zhodnocených mitóz v jeho vyšetřované tkáni.
V zápisu označujeme počet chromosomů,
pohlavní chromosomy a případné
patologické změny (zápis karyotypu
pacienta, jehož karyogram je vpravo, je
46,XY)
• normální lidský karyotyp se skládá
ze 46 chromosomů, z toho je 22 párů
autosomů (nepohlavních chromosomů)
a 2 gonosomy (pohlavní chromosomy)
chromosomový pár
(homologní chromosomy)
obrázek karyotypu - karyogram
= utříděný soubor chromosomů
z jedné buňky
ZÁPIS KARYOTYPU
46,XX - normální ženský karyotyp
46,XY - normální mužský karyotyp
počet chromosomů v buňkách pacienta
typ pohlavních chromosomů
KARYOTYP
normální mužský karyotyp
46,XY
KARYOTYP
normální ženský karyotyp
46,XX
Spiralizace chromosomů v mitóze
400 pruhů 550 pruhů 850 pruhů
v haploidní sadě chromosomů (bphs)
Směr postupné spiralizace
chromosomů během mitózy
(spiralizace začíná v profázi
mitózy, pokračuje v
prometafázi, nejvíce jsou
chromosomy spiralizované
v metafázi.
Při rutinním stanovení karyotypu vyšetřujeme chromosomy v metafázi mitózy.
IDIOGRAMY pro chromosom 1
CHROMOSOMY typy
chromosomů podle umístění
centromery
• metacentrické chromosomy
centromera téměř nebo úplně uprostřed,
tedy krátká a dlouhá raménka jsou
(téměř) stejně dlouhá
• submetacentrické chromosomy
centromera mimo střed chromosomu, p a
q raménka jsou jasně délkově odlišena
Poloha centromery označena modrou šipkou
CHROMOSOMY typy
chromosomů podle umístění
centromery
• akrocentrické chromosomy
centromera je umístěna velmi blízko
jednomu konci;
od krátkých ramének jsou odškrceny
satelity (malé výrazné části chromatinu);
místo odškrcení = sekundární konstrikce
(tenké stopky);
(sekundární konstrikce obsahuje kopie
genů kódujících rRNA = organizátor
jadérka)
Poloha centromery označena modrou šipkou
TYPY CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN,
které lze laboratorně vyšetřit
- VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ZMĚN – prenatální a postnatální vyšetření konstitučního karyotypu
konstituční karyotyp se nemění v průběhu života pacienta
- VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních
faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření
% aberantních buněk
lze snížit % aberantních buněk na normu vitamínovou léčbou
- VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ABNORMALIT (u onkologických onemocnění)
vyšetření z nádorové tkáně karyotypu maligních klonů
(toto téma bude předmětem prezentace přednášejícího z onkocytogenetické laboratoře)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY
Postnatální stanovení karyotypu
(ověřujeme přítomnost / nepřítomnost
VCA u dětí a dospělých)
- odběr periferní krve dětí a dospělých
Klinické indikace
k postnatálnímu stanovení karyotypu
• problémy časného růstu a vývoje
neprospívání, opoždění vývoje, dysmorfická facies, mnohočetné
malformace, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace
• narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence
výskyt chromosomových abnormalit je vyšší u případů narození
mrtvého plodu (téměř 10%) než u živě narozených dětí (asi
0,7%), zvýšený výskyt také u dětí, které umírají v
novorozeneckém období (okolo 10%)
• problémy s fertilitou
ženy s amenoreou, infertilní páry, opakované spontánní aborty,
partneři před IVF
• rodinná anamnéza
známá nebo suspektní chromosomová abnormalita u příbuzných
• dárci gamet
Prenatální stanovení karyotypu
(ověřujeme přítomnost / nepřítomnost
VCA u plodu)
invazivní metody vyšetření karyotypu plodu:
- biopsie choriových klků (CVS) – časná CVS – 11. – 14. t.g.
- pozdní CVS – II. a III. trimestr
- odběr plodové vody (amniocentéza, AMC) – klasická 16.-20.t.g.
- odběr krve plodu z pupečníku (kordocentéza, CC) – po 20. t.g.
Klinické indikace
k prenatálnímu stanovení karyotypu
(VCA)
invazivní metody vyšetření karyotypu plodu – při vyšším riziku narození dítěte
s VCA
- patologické hodnoty biochemických markerů (screening I., event. II. trimestru)
- VVV nalezené na UZ
- balancovaná VCA u rodičů
- výskyt VCA v rodině
- předchozí porod dítěte s VCA
- věk matky – 35 let v roce porodu – pouze vyšší věk není indikací k vyšetření
- součet věku rodičů – nad 70 let - pouze vyšší věk není indikací k vyšetření
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
• významně se podílejí na mnoha případech poruch reprodukce,
vrozených malformací, mentálních retardací, vývojových vad
• cytogenetické poruchy jsou přítomny přibližně u 0,6% živě
narozených dětí
CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY
• vrozené chromosomové abnormality (VCA)
(vyšetření karyotypu) – početní
- strukturní
prenatální a postnatální stanovení karyotypu
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
• změny počtu chromosomů
- polyploidie – změny počtu chromosomových sad
- počet chromosomů v jádrech somatických buněk
je více než dvojnásobkem haploidního počtu (n = 23)
(triploidie 3n= 69, tetraploidie 4n = 92)
většinou pouze u plodů (samovolné aborty)
69,XXX 92,XXXX
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
• změny počtu chromosomů
- aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný
typ chromosomových poruch
- odchylky v počtu jednotlivých chromosomů
v karyotypu (2n +/- 1)
- tento stav je v naprosté většině případů spojen
s poruchou fyzického nebo mentálního vývoje
- TRISOMIE (přítomnost nadbytečného chromosomu)
- MONOSOMIE (chybění chromosomu)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
změny počtu chromosomů
aneuploidie
• trisomie – nejčastější porucha
(přítomnost nadbytečného chromosomu v karyotypu 2n+1)
- trisomie autosomů (trisomie celého chromosomu je jen vzácně slučitelná
se životem)
- Downův syndrom 47,XX,+21 47,XY, +21
- Edwardsův syndrom 47,XX,+18 47,XY, +18
- Patauův syndrom 47,XX, +13 47,XY, +13
- aneuploidie gonosomů (fenotypové důsledky jsou méně
závažné než u trisomie autosomů)
- Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž)
- XXX syndrom (žena)
- XYY syndrom (muž)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
aneuploidie autosomů - trisomie
Downův syndrom 47, XX, +21
– volná trisomie
Edwardsův syndrom 47,XY,+18 Patauův syndrom 47,XY,+13
- Mentální retardace
- Dysmorfické rysy
- Hypotonie
- Malá postava
- Brachycephalie
- Srdeční vady…..
- Intrauterinní růstová
retardace
- Kraniofaciální dysmorfie
- Vady srdce, mozku a
dalších orgánů
- Těžká PMR
- Překřížené prsty…
- Mikrocefalie
- Rozštěpové vady
- Srdeční vady
- Holoprosencephalie
- Kyklopie…
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
aneuploidie gonosomů
XXX syndrom
47,XXX
- Bez potíží
nebo poruchy
učení, v
některých
případech
poruchy
plodnosti….
XYY syndrom
47,XYY
-Bez potíží
nebo poruchy
učení……
Klinefelterův syndrom 47,XXY
- Eunuchoidní habitua
- Malý penis, hypoplastická
varlata, gynekomastie
- Infertilita, azoospermie
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
aneuploidie - monosomie
• monosomie – méně častá porucha (chybění chromosomu v karyotypu 2n-1)
- monosomie gonosomu X - Turnerův syndrom)
45,X (ženský fenotyp), častý výskyt
- Malý vzrůst
- Abnormality
skeletu
- Pterygium coli
- Neplodnost…
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
aneuploidie - monosomie
monosomie autosomů – výjimečně se vyskytující porucha, slučitelná se životem jen
u některých chromosomů a to v mozaice o nízkém zastoupení
(v těle jedince mohou být přítomny 2 buněčné linie (nebo i více)
s různou chromosomovou sestavou, např. linie s normálním
karyotypem a linie s monosomií chromosomu č.18)
45,XX,-18[1]/46,XX,r(18)[29]
Buněčná linie s monosomií chromosomu 18 Buněčná linie s kruhovým chromosomem 18
VZNIK POČETNÍCH
CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN
DE NOVO -PORUCHY V MEIÓZE
• aneuploidie jsou nejčastějším mutačním mechanismem našeho druhu
• mechanismů, které podmiňují vznik aneuploidií, bylo odhaleno více,
výzkum v této oblasti stále probíhá
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
MOZAICISMUS
• má – li osoba chromosomovou abnormalitu, bývá většinou aberace přítomna ve všech
jejích buňkách
• mozaicismus = v těle jedince jsou přítomny 2 nebo více linie buněk s odlišnou
chromosomovou konstitucí
- nejčastější je výskyt malé mozaiky gonosomů (pacienti s normálním fenotypem a
poruchou plodnosti, možný výskyt i u jedinců bez reprodukčních poruch)
45,X[2]/47,XXX[1]/46,XX[30] – malá mozaika aneuploidie chromosomu X
u žen (aneuploidie gonosomů u mužů), 3- 10%
- mozaiky větší než 10% s potenciálním klinickým významem, vliv na fenotyp pacienta
- mozaika autosomů
- Downův syndrom v mozaice s normálním karyotypem (i malé mozaiky
mohou souviset s postižením pacientů)
47,XY,+21[2]/46,XY[28]
• ve formě mozaiky mohou být přítomny numerické aberace i strukturní přestavby,
početní se vyskytují výrazně častěji
• nejčastější příčinou mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém
mitotickém dělení (např. ztráta chromosomu č.21
z buňky zygoty s trisomií tohoto chromosomu)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
DEFINICE MOZAIKY
Jedinec nebo tkáň obsahuje 2 nebo více buněčných
klonů s odlišným karyotypem pocházejících z jediné
zygoty, které vznikly v důsledku nondisjunkce
při mitotickém dělení.
(Chiméra – buňky jedince pocházejí z více zygot.)
45,X[6]/46,XX[194]
Karyotyp vyšetřujeme metodou analýzy chromosomů s G – pruhy. Při nálezu alespoň 1 mitózy s abnormálním
počtem gonosomů materiál vyšetříme metodou I-FISH (analýza interfázních jader) za použití sond pro gonosomy.
Touto metodou stanovíme zastoupení patologické linie v karyotypu vyšetřované tkáně.
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
MOZAICISMUS - gonosomy
3% = hraniční patologický nález
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
MOZAICISMUS - gonosomy
vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi
pacientky metodou FISH z interfázních jader
(3% zastoupení buněčné linie 45,X)
1 signál
(přítomen
1 chromosom X
(1 centromera)
v jádře buňky)
2 signály (přítomny
2 chromosomy X
(2 centromery)
v jádře T-lymfocytu)
Při vyšetření použita
centromerická sonda
chromosomu X
(cep X)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• méně časté než aneuploidie
• změna struktury chromosomů (autosomů i gonosomů)
• podmínkou je vznik zlomů na chromosomech
• metodami klasické cytogenetiky (ve světelném mikroskopu) lze na
chromosomech rozlišit pouze strukturní změny
o určité velikosti (>5-10Mb)
• změny menší lze detekovat metodami s vyšší rozlišovací schopností
– metodami molekulární cytogenetiky
• strukturní aberace vznikají buď v souvislosti s opravou zlomů na
chromosomech (interchromosomové přestavby) nebo v důsledku
nerovnoměrného crossing-overu (delece, duplikace –
intrachromosomové změny)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
karyotyp s balancovanou/nebalancovanou
strukturní aberací
balancované chromosomové aberace množství
genetického materiálu v buněčném jádře zůstává zachováno,
materiál nechybí ani nepřebývá, ale je jinak organizován (přestavby)
fenotyp pacientů je v naprosté většině případů bez patologie
nebalancované chromosomové aberace –
genetický materiál v buněčném jádře buď
- chybí i přebývá
- nebo pouze chybí či pouze přebývá
fenotyp pacientů je v naprosté většině případů patologický
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
balancované chromosomové aberace
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• translokace – nejčastější ze strukturních aberací
(výskyt možný u všech chromosomů),
předpokladem je vznik dvou zlomů,
každý na jednom chromosomu
- reciproké translokace
- robertsonské translokace
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
reciproké translokace – výměny chromosomových segmentů mezi dvěma,
zpravidla nehomologními, chromosomy
reciproké translokace
se vyskytují s frekvencí
přibližně 1:600 novorozenců
nosiči vrozených balancovaných přestaveb většinou nemají žádné změny fenotypu
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
reciproká translokace t(1;15)
výměna koncových úseků chromosomů
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
reciproká translokace t(1;15)
46,XX,t(1;15)(q21;q22)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
Robertsonské translokace – 2 akrocentrické chromosomy fúzují v oblasti
centromery a ztrácejí svá krátká raménka
(ztráta nemá vliv fenotyp), vznik zlomů
v oblasti centromery
nosiči vrozených balancovaných přestaveb většinou nemají žádné změny fenotypu
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
Robertsonská translokace der(13;14)
(derivovaný chromosom)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
Robertsonská translokace
45,XX,der(13;14)(q10;q10)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALIY (VCA)
strukturní přestavby
translokační forma Downova syndromu
45,XX,der(21;21)(q10;q10) 46,XY,+21,der(21;21)(q10;q10)
fenotyp normální
potomekrodič
postižený
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
translokační forma Downova syndromu
45,XX,der(14;21)(q10;q10) 46,XY,+21,der(14;21)(q10;q10)
potomekrodič
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• inverze – na jednom chromosomu vzniknou 2 zlomy, segment
mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení
do chromosomu
paracentrická inverze –
oba zlomy jsou na stejném raménku,
úsek nezahrnuje centromeru
pericentrická inverze –
na každém raménku je jeden zlom,
invertovaný úsek zahrnuje
centromeru
(změna polohy centromery – změna
morfologie chromosomu)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
pericentrická inverze inv(3)
Místa zlomů označena
červenou šipkou
Poloha centromery
označena modrou
šipkou (díky inverzi
došlo ke změně její
polohy v rámci
chromosomu)
Metacentrický
chromosom 3
bez inverze
Submetacentrický
chromosom 3
s inverzí
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
paracentrická inverze inv(1)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
46,XX,inv(1)(q21q32)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• inzerce – nereciproký typ translokace
- segment z jednoho chromosomu je odstraněn
a vložen do jiného chromosomu buď ve své
původní orientaci nebo opačné
- k jejich vzniku jsou potřeba 3 body zlomu, 2 na
jednom chromosomu a 1 na druhém
- jsou poměrně vzácné (1:80000)
- hrozí vznik nebalancovaných gamet a narození
abnormálních potomků
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
inzerce
inzerce úseku chromosomu č. 14 do chromosomu č. 6
46,XY,ins(6;14)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
inzerce
46,XY,ins(6;14)(p24;q13q22)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
nebalancované chromosomové aberace
Nebalancované chromosomové aberace mohou
vznikat de novo (rodiče mají normální karyotyp,
potomek deleci nebo duplikaci) nebo lze
nebalancovaný genetický materiál zdědit od rodiče
– nosiče balancované aberace (translokace, inverze).
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromosomu,
který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu
(parciální monosomie) – na 1 chromosomu v páru úsek
přítomen je, na druhém chybí
terminální delece –vznik jednoho zlomu,
ztráta koncového úseku chromosomu
intersticiální delece –vznik dvou zlomů,
ztráta segmentu uloženého mezi
centromerou a terminální částí
incidence cytogeneticky pozorovatelných delecí
je asi 1:700 živě narozených dětí
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY(VCA)
strukturní přestavby
terminální delece del(5)(p14)
syndrom Cri du chat (syndrom kočičího křiku)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
delece
46,XX,del(5)(p14)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
delece - syndromy
další důležité deleční syndromy:
- Wolf – Hirschhornův syndrom – 46,XX,del(4)(p?) / 46,XY,del(4)(p?)
delece části 4p
- De Grouchy syndrom – 46,XX,del(18)(p?) / 46,XY,del(18)(p?)
delece části 18p nebo celého 18p
(nebo i části 18q)
některé delece nemusejí být zařazeny do kategorie
syndrom (málo častý výskyt)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
delece – sporadické nálezy
delece Y – mohou souviset se sterilitou u mužů
S mužskou neplodností souvisejí i velmi
malé delece – mikrodelece oblastí
AZF na Yq (pod rozlišovací schopností
metod klasické cytogenetiky)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
delece – sporadické nálezy
46,X,del(X)(p?)
fenotyp podobný Turnerovu syndromu
(klíčový význam – chybění Xp)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
• duplikace – nadbytečný chromosomový segment, který
způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu
(parciální trisomie)
- fenotyp pacientů bývá méně závažný než u delecí
duplikace části chromosomu
dup(6)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
duplikace
46,XX,dup(6)(q22q23)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní změny – vztah mezi balancovanou
a zděděnou formou nebalancované přestavby
– přenos na potomky
- reciproká translokace, inverze
• translokace a pericentrické inverze u svých nosičů většinou
nezpůsobují abnormální fenotyp
• ale existuje vysoké riziko vzniku nebalancovaných gamet
– samovolné aborty
- narození postižených dětí (nebalancovaný karyotyp – parciální
monosomie jednoho a parciální trisomie druhého chromosomu)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
translokace a inverze
Schemata vzniku gamet s balancovanou a nebalancovanou chromosomovou sestavou
u nosičů balancovaných přestaveb – reciproké translokace a inverze
Spárované párové
chromosomy bez inverze
(profáze meiózy I)
Spárované párové
chromosomy
- jeden nese inverzi
(profáze meiózy I)
46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1)mat
rodič potomek
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní změny
– např. translokace u rodiče - derivovaný chromosom u potomka
vztah mezi balancovaným karyotypem
a zděděnou formou nebalancovaného karyotypu
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní změny
– např. translokace u rodiče - derivovaný chromosom u potomka
vztah mezi balancovaným karyotypem
a zděděnou formou nebalancovaného karyotypu
postižený potomek
s nebalancovaným karyotypem
46,XY,der(21)t(16;21)mat
nebalancovaný karyotyp (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie
druhého chromosomu) – potomek rodiče – nosiče balancované translokace
matka s balancovanou
přestavbou v karyotypu
46,XX,t(16;21)
chromosomy, které se zúčastnily translokace
derivovaný chromosom 21, pochází z translokace
u matky (parciální monosomie – chybění
části chromosomu 21, parciální trisomie - nadbytek
části chromosomu 16)
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
strukturní přestavby
translokace
Reciproké translokace u svých nosičů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp,
ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet
a s tím souvisejících samovolných potratů nebo narození potomků
s nebalancovaným karyotypem (parciální monosomie jednoho a parciální
trisomie druhého chromosomu).
PORUCHY POHLAVNÍHO VÝVOJE
(DISORDERS OF SEX
DEVELOPMENT – DSD)
- Odhad frekvence výskytu všech anomálií pohlavního vývoje je 1:4500 živě narozených dětí.
- Poruchy pohlavního vývoje definujeme jako komplexní vrozené vady, kde chromosomové,
gonadální a anatomické pohlaví není ve vzájemném souladu. Problematika je široká, zahrnuje
poruchy na úrovni genů, které hrají roli ve vývoji ovarií a testes (SRY, NR0B1, SOX3, SOX9, NR5A1,
WNT4, AR, CYP21A2), na úrovni karyotypu můžeme detekovat nesoulad chromosomového
a fenotypového pohlaví.
Cytogenetické nálezy v souvislosti s DSD:
1) konstituční karyotyp jedince není v souladu s fenotypovým pohlavím jedince –
46,XY – 1) zdánlivě normální ženský fenotyp (kratší pochva, chybí děloha a vejcovody, varlata
v pánvi), mužský karyotyp, identifikují se jako ženy
2) varlata a nekompletně maskulinizovaný nebo ženský genitál
46,XX – 1) mužský fenotyp (menší varlata, gynekomastie, infertilita, u některých hypospadie,
kryptorchismus), ženský karyotyp, identifikují se jako muži
2) obojetné gonády
3) vaječníky, ale neurčitý nebo mužský genitál
2) v konstitučním karyotypu jedince je detekována chromosomová abnormalita pohlavních
chromosomů - sex chromosome DSDs:
- karyotyp 45,X (ztráta germinálních buněk, degenerace oocytů, ovariální dysgeneze)
- karyotyp 47,XXY (selhání vývoje pohlavních buněk – azoospermie, infertilita)
- 45,X/46,XY – smíšená gonadální dysgeneze
Nesoulad mezi typem pohlavních
chromosomů v karyotypu
a pohlavím pacienta
46,XX u pacienta s mužským fenotypem 46,XY u pacienta s ženským fenotypem
46,XX u jedinců s mužským
fenotypem
Vznik v důsledku abnormální rekombinace
mezi Xp a Yp v meióze v zárodečných
buňkách otce, dochází k přenosu genu SRY
na chromosom X / ztráta genu SRY
na chromosomu Y
(gen SRY je lokalizován v blízkosti
pseudoautosomální oblasti na Yp,
obvykle do rekombinace zahrnován nebývá,
normální rekombinace se týká pouze
pseudoautosomálních oblastí)
Fenotyp: normální mužský fenotyp, malý vzrůst,
malá testes, gynekomastie, sterilita
související s azoospermií. Cítí se být muži.
46,XY u jedinců s ženským fenotypem
Syndrom androgenní insensitivity (AIS) (dříve Syndrom testikulární feminizace)
Nejčastější mužský pseudohermafroditismus. Jedinec s tímto syndromem má mužský karyotyp,
oboustranně založená varlata, ale organismu chybí androgenní receptory (AR). Příčinou receptorového
deficitu je porucha genu AR, lokalizovaného na chromosomu X v pozici Xq11-12. Dosud bylo popsáno více
Než 1000 mutací AR genu. Mutace způsobí neschopnost cílové tkáně odpovědět úplně nebo částečně
na androgenní podnět. Dochází k narušení sexuálního vývoje, klinický obraz je velmi variabilní,
od fenotypických žen až po téměř normální muže s nedostatečnou virilizací a infertilitou.
Syndrom úplné (kompletní) androgenní insensitivity (CAIS) – zevní genitál ženský, krátká, slepě
zakončená vagína, karyotyp mužský,
infertilita, cítí se být ženami
Pacientky jsou vyšetřovány pro primární amenoreu, výjimečně pro potíže při pohlavním styku. Jsou přítomna
varlata v pánvi, tříselném kanálu nebo velkých labiích. Hrozí malignizace varlat, riziko vzrůstá v pubertě.
Odstranění gonád je indikováno co nejdříve po stanovení diagnózy.
Syndrom částečné (parciální) androgenní insensitivity (PAIS) – různě vyjádřený obojetný zevní genitál,
karyotyp mužský
Syndrom mírné (mild) androgenní insensitivity (MAIS) – fenotyp mužský, hypospadie, gynekomastie,
infertilita
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABNORMALITY (VCA)
komplexní chromosomové přestavby
-chromothripsis
Jednorázová katastrofická buněčná událost, která tvoří základ komplexních genomových přestaveb v zárodečných liniích.
(Fukami M. et.al. Catastrophic cellular events leading to complex chromosomal rearrangements in the germline Clin Genet 2017: 91: 653–660)
Komplexní přestavby autosomů v zárodečných liniích často vedou k opoždění vývoje
a projevu dysmorfických rysů, přestavby chromosomu X jsou obvykle asociovány
s relativně mírnou klinickou manifestací.
Chromothripsis – komplexní přestavba postihující jeden nebo více chromosomů
během jedné katastrofické události. Vznikají četné chromosomové zlomy,
následně dojde k opětovnému náhodnému sestavení chromosomových fragmentů.
Může docházet ke ztrátám či zisku genetického materiálu a ke vzniku inverzí nebo
translokací.
Dosud se věřilo, že komplexní chromosomové přestavby jsou výsledkem postupné
akumulace poškození DNA. Současné studie však ukazují, že takové přestavby
mohou vznikat během jedné katastrofické buněčné události. Tato událost
pojmenovaná jako chromothripsis, chromoanasynthesis a chromoanagenesis byla
poprvé zdokumentována v nádorovém genomu a následně pozorována i v
zárodečných liniích. De novo chromothripsis v zárodečných liniích má nejčastěji
paternální původ.
Komplexní chromosomové přestavby jsou klasicky definovány jako strukturní přestavby
zahrnujíci více než 3 místa zlomů na více než dvou chromosomech. Avšak přestavby
zahrnující pouze jediný chromosom mohou být také vysoce „komplexní“.
PŘÍPRAVA CHROMOSOMOVÝCH
PREPARÁTŮ
METODAMI KLASICKÉ CYTOGENETIKY
Podrobný postup viz video „Postnatální cytogenetické vyšetření“.
Metody klasické cytogenetiky se vyznačují tím, že pro analýzu je nezbytné získat
chromosomy, spiralizované molekuly DNA, na mikroskopickém sklíčku. Tyto metody
(narozdíl od metod molekulární cytogenetiky) nelze využít k analýze interfázních jader.
VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ
VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ABNORMALIT
• postnatální materiály: periferní krev
• prenatální materiály: plodová voda, choriové klky,
krev plodu, kůže potracených plodů
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
• odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR!
• kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk
(s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem
• zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze buněk
• vykapání na podložní sklíčka
• pruhování / barvení chromosomů
• hodnocení ve světelném mikroskopu
relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární
cytogenetiky a molekulární diagnostiky)
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
odběr materiálu
Odběr vstupních materiálů pro účely
cytogenetického vyšetření vždy za sterilních
podmínek
Odběr periferní krve do zkumavek s heparinem
(nikoli do zkumavek s EDTA jako na izolaci DNA)
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
nasazení do kultivačního média
Sterilní práce v laminárním boxu
!!!!!!!STERILNÍ PROSTŘEDÍ!!!!!!!
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
kultivace materiálu
nasazení plodové vody
nasazení periferní krve
aplikace kolchicinu –
mitotického jedu –
po kultivacikultivace v termostatu
1 2 3
Materiál nasazujeme do tekutého kultivačního média. T-lymfocyty periferní krve stimulujeme k dělení
(a s tím související spiralizaci chromosomů) přidáním mitogenu phytohemaglutininu (PHA).
ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE BUNĚK
(hypotonizace, fixace)
1- vzorek po kultivaci a centrifugaci
2 – po hypotonizaci a centrifugaci
3 – po fixaci a centrifugaci (přídavek fixativu 3x)
4 – výsledná suspenze T - lymfocytů
1 2 3 3 3 4
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
• vykapání suspenze na podložní sklíčka
(na sklíčcích jsou rozloženy buňky s chromosomy a interfázní jádra, sklíčko
samovolně zasychá ve vodorovné poloze na laboratorním stole)
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
G - pruhování chromosomů
G - pruhování chromosomů
2 – barvení barvivem
Giemsa – Romanowski - A
A
1 - inkubace preparátu v roztoku enzymu trypsinu
(natrávení proteinů na povrchu chromosomů)
chromosom s G-pruhy
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
nebo konvenční barvení chromosomů
konvenční barvení chromosomů
barvení barvivem
Giemsa – Romanowski - A
A
chromosom konvenčně barvený
(vynechán krok natrávení chromosomových proteinů trypsinem)
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
hodnocení
chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu
zdroj světla - klasická nebo halogenová žárovka
(viditelná část spektra)
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
barvení / pruhování chromosomů
• barvení Giemsovým barvivem
(bez inkubace v roztoku trypsinu,
obarvuje chromosomy po celé
délce, bez pruhů) - hodnocení
získaných chr. aberací, které vznikly
v důsledku působení mutagenních
faktorů prostředí
• pruhování
chromosomů
(hodnocení konstitučního
karyotypu)
chromosomy s G - pruhy
chromosomy barvené konvenčně
VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH
CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ
v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí
- z periferní krve
STANOVENÍ % ABERANTNÍCH BUNĚK
VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ
periferní krev
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE
(ZCA/CAPL)
příčiny vzniku
působení - fyzikálních faktorů
(ionizující záření)
- chemických látek
(cytostatika, imunosupresiva, oxidační,
alkylační činidla ad. látky používané
v průmyslu)
- biologických faktorů
(virové infekce – pravé neštovice, spalničky,
zarděnky ad.)
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (ZCA/CAPL)typ
poškození – chromatidové aberace
• chromatidové gapy
(mezery) - chtg (chromatid
gap)– příčně slabě se barvící
část chromatidy (achromatické
léze), také úplné přerušení
nepřesahující šířku chromatidy
• chromatidové zlomy chtb
(chromatid
break), úplné přerušení
chromatidy,
pravděpodobně koncová
delece
• chromatidové výměny
- chte (chromatid
exchange)- výměny
části chromatid v rámci
jednoho nebo více
chromosomů
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (ZCA/CAPL)typ
poškození – chromosomové aberace
• chromosomové
gapy - chrg
(chromosome gap)
-příčně slabě se
barvící část
chromosomu
(achromatické léze),
také úplné přerušení
chromosomu
nepřesahující šířku
chromatidy
• chromosomové zlomy chrb
(chromosome
break), oddělení
párových fragmentů
(DF)- úplné přerušení
obou chromatid,
pravděpodobně koncová
delece
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (ZCA/CAPL)typ
poškození – chromosomové aberace
• acentrické ringy,
kruhové chromosomyuzavřené
struktury, vznik
dvou zlomů na jednom
chromosomu, dojde ke
spojení – acentrické ringy
jsou bez centromery,
kruhové chromosomy
zahrnují centromeru
• chromosomy zahrnující
více než 1 centromeru-
dicentrické,
tricentrické
chromosomy…
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE
(vliv mutagenních faktorů prostředí)
aberantní buňka
(mitóza s aberací)
• nacházíme různé změny v různých buňkách
• v každé buňce může být jiná chromosomová
aberace – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné
změny, v jedné mitóze můžeme nalézt 1 změnu
nebo i více
• vyšetřujeme mitózy, které jsou barvené konvenční metodou barvení chromosomů
• mitózy, ve kterých je nalezena alespoň jedna chromosomová nebo chromatidová
aberace, nazýváme „aberantní buňky“
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE
(vliv mutagenních faktorů prostředí)
vyšetření z periferní krve
• rychlejší stárnutí organismu
• vznik degenerativních onemocnění
• možné maligní zvrhnutí
Přítomnost aberací v somatických buňkách
Přítomnost aberací v gametách
• zvýšené riziko narození postiženého dítěte
Konvenční barvení chromosomů
Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem
aberantní buňka
ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE
(vliv mutagenních faktorů prostředí)
Výsledek: stanovení % aberantních buněk
• CYTOGENETICKÁ ANALÝZA PERIFERNÍCH LYMFOCYTŮ (CAPL) skupinové
hodnocení
- hraniční patologie při skupinovém hodnocení:
zvýšená expozice mutagenním faktorům:
2 – 4 % aberantních buněk z 200 – 300 hodnocených
vysoká expozice mutagenním faktorům:
více než 4% aberantních buněk z 200 – 300 hodnocených
• ANALÝZA ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (ZCA) –
individuální hodnocení
- hraniční patologie při individuálním hodnocení:
opakovaný nález 5% ab. buněk ze 100 hodnocených
důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro:
1. stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy
- délka kultivace 72 hodin
- G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa –
Romanowski
- nalezenou aberaci se snažíme co nejpřesněji definovat
(i za pomoci metod molekulární cytogenetiky)
2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené
- délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení –
později dochází k opravě aberací)
- konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu
- konkrétní aberace neupřesňujeme, podstatné je pouze jestli je/není
v dané buňce některá aberace přítomna
PŘÍPRAVA PREPARÁTŮ – srovnání
konstituční karyotyp/ZCA, CAPL
Klinické indikace
k vyšetření ZCA/CAPL
(mutagenní faktory)
• práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením),
vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem
• po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě
• kontrolní vyšetření u podchycených případů
% aberantních buněk se sníží na normu po vitaminizaci antioxidanty
(vitamíny A, E, C, event. Se, Zn, doba léčby 3 – 6 měsíců)