 Páry s poruchou reprodukce (víc než rok, SA,..)
 Zátěž v rodě (VCA,…)
 Pacienti s intelektuálním postižením
(neurovývojovými poruchami, vývojovými poruchami
intelektu), poruchami autistického spektra, vrozenými
vývojovými vadami, stigmatizací...
 Prenatální indikace z důvodu abnormálního průběhu
gravidity (abnormální prenatální screening)
 Onkologická onemocnění

Indikace k molekulárně cytogenetickému vyšetření
Cytogenetika v medicíně dnes…
V ČR jsou cytogenetické laboratoře součástí Oddělení lékařské
genetiky (velké nemocnice – Praha, Brno, Olomouc, Ostrava,
Plzeň, Hradec Králové, České Budějovice…)
• soukromá pracoviště (laboratoře)
• 20 – 30 cytogenetických laboratoří v ČR…
Cytogenetická laboratoř/cytogenetická diagnostika:
a) prenatální cytogenetika
b) postnatální cytogenetika
c) nádorová cytogenetika
• Lékařská genetika
• Onkologie
• Reprodukční
medicína
• Pediatrie
• Kardiologie
• Patologie
• Kožní
• Neurologie
• aj
Materiál pro cytogenetické
vyšetření
 periferní krev
 vzorky různých tkání (biopsie kožní)
 buňky plodové vody, choriových klků, placenty
 pupečníková krev
 buňky kostní dřeně
 vzorky solidních nádorů
- Izolovaná DNA
- Suspenze buněk ( jádra interfázní či metafáze)
I. Metody molekulární cytogenetiky
FISH (fluorescenční in situ hybridizace)
detekce balancovaných i nebalancovaných změn
Mnohobarevná FISH – M FISH;
detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu
Array-CGH - komparativní genomová
hybridizace na čipech
Agilent´s Human CGH Microarray Kit
detekce nebalancovaných změn v celém genomu
MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification)
detekce nebalancovaných změn
OGM(Optical Genome Mapping)
detekce balancovaných i nebalancovaných změn v celém
genomu
FISH = fluorescenční in situ hybridizace
 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení
 1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH)
Hybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy na
cytogenetickém preparátu
Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn
v interfázních buňkách i v mitózách
FISH
Příprava
chromozomových
preparátů
Vyhodnocení
na fluorescenčním
mikroskopu
Značená sonda
hybridizovaná
s cílovou sekvencí
Sonda
D e n a t u r a c e
H y b r i d i z a c e
Značení
fluorochromem
Cílová sekvence
Postup FISH
Zhotovení kvalitních preparátů
1. Denaturace sondy i cílového místa
2. Hybridizace
3. Odmytí
4. Barvení pozadí
5. Hodnocení pomocí
fluorescenčního mikroskopu
• fluorescenční mikroskop vybavený
sadou fluorescenčních filtrů
• citlivá ČB kamera
• počítač a specifické programové
moduly pro aplikace FISH, M-FISH
FISH Vybavení
FISH : Typy sond
 Celochromozomové
 Centromerické
 Sondy subtelomerické
 Sondy lokus specifické
Sondy pro jedinečné sekvence:
a) plazmidové (500pb-5 kb)
b) kosmidové (20-50 kb)
c) bakteriofág lambda (8-15 kb)
d) YAC klony (50-1000 kb)
Značení DNA sond
 fluorochromy, Texas Red, Spectrum Green,
Spectrum Orange, FITC, TRITC
SpectrumAqua, SpectrumGold, aj
FISH : Přítomnost, počet a poloha signálů
Identifikace každého chromozómu pomocí
jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC,
Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5
•referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny
každému chromozómovému páru na základě
měření vlnových délek
Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz
- úspěšná hybridizace
- finančně nákladné
Umožňuje odhalení balancovaných a
nebalancovaných ( i kryptických ) přestaveb
celého genomu v jednom kroku
Mnohobarevná FISH (M FISH)
vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednom
preparátu
Speicher a kol., 1996 (M-FISH), Schröck a kol., 1996 (SKY)
Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno)
M FISH - komplexní karyotyp
Mnohobarevné pruhování (M-banding)
 parciální malovací sondy ze specifických
oblastí chromozomů
 fluorescenční signály jednotlivých sond se
podél sledovaného chromozomu částečně
překrývají a dochází k jejich kombinaci
 umožňuje rozlišení intrachromozomových
přestaveb (inverzí)
Komparativní genomová hybridizace
na čipech (array-CGH)
• Efektivní metoda celogenomového screeningu nebalancovaných přestaveb
chromosomů během 1 hybridizační reakce
• Založena na společné hybridizaci různě značených vzorků DNA (testované
DNA a referenční DNA) na DNA mikročip pokrytý fragmenty oligonukleotidů
• Ztráta či zisk genetického materiálu v testované DNA je odečten ze spotů
vykazující abnormální poměry intenzit signálů .
tradiční
karyotypování
5-10 Mb
array CGH 50-100 kb
https://www.agilent.com/cs/library/videoanimation/
public/Agilent%20CGH%20-%20D12b.mp4
• Solinas-Toldo a kol., 1997
• vyhází z principu klasické (chromosomální) CGH
• nahrazení chromozomů separovanými klony
(BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy)

Array-CGHCGH
Původ metody array-CGH
Agilent Human CGH Microarray
Oligo arrays
• 8x15K custom chip
• 4x44K 43 kb rozlišení
• 2x105K 21 kb rozlišení
• 1x244K 9 Kb rozlišení
Nové typy – Sure Print G3 Human
• 8x60K 41 Kb rozlišení
• 4x180K 13 Kb rozlišení
• 2x400K 5 Kb rozlišení
• 1x1M 2 Kb rozlišení
HRCGH
negativní
8x15K
negativní
4x44K
del(1)(p36)
2x105K
del(1)(p36)
del(1)(p36), cca 3 Mb
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
Array CGH : vyhodnocení
Interpretace nálezů CNVs musí probíhat vždy v
kontextu s:
1. Fenotyp jedince
2. Vyšetření rodičů -> stanovení původu CNVs (de novo/zděděná
CNV od rodiče s normálním/patologickým fenotypem)
3. Informace v databázích genetických variant (UCSC,
DECIPHER, DGV...) a o genech v oblasti CNVs (databáze
OMIM)
4. Informace v relevantní vědecké literatuře (Pubmed...)
Array CGH: ~ 1000-krát větší rozlišení nebalancovaných
změn než klasická cytogenetika, ale nedokáže detekovat
balancované přestavby chromozomů…!!!
• jedná se o speciální formu
multiplex PCR, při které se
amplifikují MLPA sondy a ne
zkoumaná DNA
• detekuje změny počtu kopií
( především rozsáhlejších
delecí/duplikací ) až 50
specifických sekvencí v jedné
PCR reakci
• dokáže odlišit sekvence lišící se
v jediném nukleotidu;
• další aplikace – stanovení SNP,
metylace v promotorové oblasti
Pacient
Kontrola
MLPA princip
1971 G-pruhování (5 – 10 Mb)
1986 Molekulární cytogenetika
FISH (100 kb)
1997 array-CGH (oligo 0,06 kb)
2000 NGS
Od chromozomů
…k analýzám DNA
…
Vývoj nových cytogenetických technik pro
detekci chromozomových změn
2010 Optical mapping
Existuje univerzální metoda, která by
nahradila vše?
https://bionano.com/videos/saphyr-ogm-
technology-overview-video/
Optické mapování genomu - postup
Bionano Genomics (https://bionanogenomics.com/technology/platform-technology/)
reference
vzorek
Detekce chromozomových aberací pomocí
optického mapování
OGM - příklad translokace (13;20)(q32;p13)
Dremsek et al. 2021
II. Využití metod molekulární cytogenetiky
v klinické genetice dle typu aberací
Detekce numerických změn: aneuploidie (monozomie, trizomie,…)
Detekce strukturních změn:
- balancované: inverze, reciproké translokace,
robertson. translokace,…
- nebalancované:
-Mikrodelece (mikrodeleční/mikroduplikační syndromy, CNV,..)
-Subtelomerické přestavby
-Nebalancované translokace
-Marker chromozomy
-Izochromozom; ring chromozomy,…
Detekce LOH, UPD
Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady)
numerické změny: Downův syndrom 47,XX/XY,+21
FISH
Využití metod molekulární cytogenetiky
(příklady)
numerické změny: Klinefelterův syndrom
 47,XXY
 vysoká postava, porucha
růstu vousů, ženská
distribuce podkožního
tuku, PMR
FISH
Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady)
numerické změny: Turnerův syndrom
 45,X
 chybí jeden chromozom X
 1/2500 dívek
 95 % SA
 malá postava, chybí vaječníky až
sterilita
FISH
 výskyt v populaci s četností asi 1 : 500
 neovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v
populaci mentálně retardovaných pacientů)
 významná příčina sterilit u přenašečů
 v důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s
nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece)
 Metoda FISH, karyotyp
Využití metod molekulární cytogenetiky
strukturní změny: balancované translokace
46,XX,add(1)
 děvče, rok narození 2002
 dg: stigmata – mongoloidní postavení očí, hyperplastická gingivální
sliznice, soudkovitý hrudník, velké rozlité bříško
 matka 46,XX, inv(9), otec 46,XY,add(1)[87]/46,XY[13]
Kazuistika
CGH: rev ish enh (11p15-pter) – nebalancovaná translokace
FISH: der(1)t(1;11)
Kazuistika
 skupina geneticky podmíněných chorob, jejichž příčinou jsou
drobné mikrodelece DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou
detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami
 pacienti mají specifické klinické příznaky…dříve popis dle
fenotypu („phenotype first“…)
 nyní přístup „genotype first“ …nejprve nález, srovnání
velikosti, genů – vliv na fenotyp
 rekurentní - vznikají opakovaně ve stejném
místě na chromozomu …např. del 22q11
 nerekurentní - mohou vzniknout kdekoliv v genomu …
Využití metod molekulární cytogenetiky
strukturní změny: Mikrodeleční syndromy
Mikrodeleční syndromy
• růstová retardace
• dysmorfismus
• stigmata
• mentální retardace
• malformace
• vrozené vady
Obecné příznaky:
Jsou způsobeny mikrodelecí úseku chromozomu – většinou 2 – 4 Mb
Nejčastější rekurentní mikrodeleční syndromy:
DiGeorgeův/Velokardiofaciální syndrom
Prader-Williho a Angelmanův syndrom
Williamsův-Beurenův syndrom
Využití metod molekulární cytogenetiky
FISH: detekce mikrodelečních syndromů
– např. del 22q11 DiGeorge syndrom
 SRDEČNÍ VADY
 ANOMÁLIE TVÁŘE
 PORUCHY IMUNITY
Využití metod molekulární cytogenetiky
FISH: DiGeorge syndrom del 22q11
Dvoubarevná FISH
Obrázek: Ukázka normální
mitózy a mitózy
s mikrodelecí 22q11
vyšetřená pomocí techniky
FISH (de Ravel et al., 2007;
upraveno)
Obrázek: Příklad komerčně
dostupných sond pro detekci
mikrodelece 22q11
(www.cytocell.co.uk)
Array-CGH profil DNA pacienta s mikrodeleci 22q11 o velikosti 2,72 Mb
ISCN: arr[GRCh37] 22q11.21(18818376_21540347)x1
Využití metod molekulární cytogenetiky
Array CGH: DiGeorge syndrom del 22q11
Pomocí DNA čipů zjistíme i velikost mikrodelece
Využití metod molekulární cytogenetiky
mikrodeleční syndromy : Prader Willi a Angelman syndrom
del 15q11-13
Metody pro stanovení diagnózy PWS a AS
Cytogenetické : karyotyp - translokace
Molekulárně cytogenetické : FISH - mikrodelece
15q11-13 DNA sonda
MLPA, array-CGH
Molekulárně genetické:
PCR - uniparentální disomie, Metylační analýza
Prader-Williho syndrom
Hlavní klinické příznaky:
 Snížená aktivita plodu
 Neprospívání kojenců
 Hypotonie novorozenců (do 9 měs.
 Obesita
 Hyperfagie, neukojitelný hlad
 Hypogenitalismus, hypogonadismu
 PMR
 Malá postava
 Akromikrie
 Hypopigmentace
 Problémy s chováním
Angelmanův syndrom – „Happy Puppet“
Výskyt : frekvence není přesně známá –
- odhad asi 1: 15 000- 1: 30 000
Hlavní klinické příznaky
 Vážná PMR
 Tuhá nemotorná chůze
 Trhavé pohyby, špatná rovnováha
 Absence řeči
 Šilhání
 Výbuchy smíchu, šťastná povaha
 Hypotonie
 Epilepsie
 Abnormální tvar lebky
 Hypopigmentace
Využití metod molekulární cytogenetiky
Genetické příčiny vzniku PWS a AS
Prader-Williho syndrom
1. Delece na paternálním
chromozómu 15
(70%)
2. Maternální uniparentální
disomie chromozómu 15
(20 - 25 %)
3. Změna imprintingu
(2 - 4 %)
4. Různé chromozomální
přestavby
( méně než 5 %)
Angelmanův syndrom
1. Delece na maternálním
chromozómu 15
(70 %)
2. Paternální uniparentální disomie
chromozómu 15
(4 %)
3. Změna imprintingu
(1 %)
4. Různé chromozomální přestavby
(2 %)
5. Mutace v genu UBE 3A
(3 - 5 %)
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Využití metod molekulární cytogenetiky
onkocytogenetika (příklad reciproké translokace)
Chronická myeloidní leukemie (CML)
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
 Cytogenetika: kultivace tkáně tumoru; vyšetření karyotypu
 Molekulární cytogenetika:
 I –FISH: amp.MYCN genu 2p24
del 1p36
gain 17q
 array-CGH
 SKY, MLPA
 Molekulární genetika:
tyrozinhydroxyláza,
protein PGP 9.5
Využití metod molekulární cytogenetiky
u solidních nádorů : Neuroblastom(mimo jiné..)