ANÉMIE Vytisková Soňa Vznik anemie Anemie je stav, kdy hodnota Hb, případně Hct (nikoliv však erytrocytů) je nižší než dolní hranice fyziologické hodnoty s ohledem na věk, pohlaví a nadmořskou výšku, v níž jedinec žije. Pozn. světová zdravotnická organizace – definice anémie: snížení Hb v krvi < 130 g/l u mužů < 120 g/l u žen Jsou tu i rasové rozdíly, u jedinců černé rasy jsou hodnoty Hb a Hct nižší než u jedinců bílé rasy. • Normálně na pokles hladiny kyslíku v organismu reagují ledviny zvýšenou produkcí hormonu erytropoetinu (EPO). • EPO se přenáší krví do kostní dřeně, kde je vydán signál ke zvýšené produkci ERY a stav se kompenzuje. • V určitých případech, zejména u nádorových onemocnění nebo u chronických zánětlivých procesů je ale tento proces nedostačující a vzniká anemie. Sledování vyšetření Sledovat: • hloubku anémie v KO • morfologické změny erytrocytů v periferní krvi (barevné, tvarové, inkluze) • morfologické a množstevní změny erytrocytární populace v KD 4 Erytropoeza Proerytroblast Basofilní erytroblast Polychromatický erytroblast Ortochromatický erytroblast Retikulocyt Erytrocyt Zmenšování velikosti buňky Nárůst syntézy HGB Kostní dřeň Krev 1-3 dny KD / 1-2dny PK Retikulocyt obsahuje zbytky organel obsahující RNA (ribozomy, zbytky endoplazmatického retikula). Erytrocyty a retikulocyty •Vzhledem k tomu, že normální doba života RBC je 120 dní, zhruba 1/120 (~1%) nových RBC musí být denně doplněno do periferní krve, aby byl zachován jejich konstantní počet. •Erytrocyty jsou „dlouhověké“ a mohou nám vypovídat o erytropoetické aktivitě během několika posledních měsíců. •Erytrocyty již neprodukují nový hemoglobin. •Naproti tomu retikulocyty jsou „krátkověké“ a mohou nám proto poskytnout informace o aktuální erytropoetické aktivitě. •Retikulocyty stále produkují Hgb. Vyšetření retikulocytů - počet Barvení RNA v erytrocytech: •mikroskopicky •supravitální barvení (bez fixace preparátu) •analyzátorem •analýza prošlého světla •analýza fluorescence •počet (=kvantita) + nejvyšší třída analyzátorů hemoglobinizace retikulocytů (=kvalita) Mikroskopické vyšetření retikulocytů • V retikulocytech se barví supravitálně brillantcresylovou modří zbytky RNA (barví se tzv. substatnia granulofilametosa) • Pozitivita se hodnotí v 1000 erytrocytech • normální hodnoty: 0,5 – 2,5 % Retikulocyty Vyšetření retikulocytů na analyzátoru • analýza prošlého světla probíhá v retikulocytech na precipitovaných, obervených síťových strukturách RNA • fluorescenční analýza měření RNA v retikulocytech obarvených fluorescenčními barvami (měření fluorescence) • cytochemicka analýza (Advia, Beckman Coulter): • Normální hodnoty: • Počet : 0,5 – 2,5 % 25 – 100 x 109/L • RET-He: 28 -35 pg hodnoty nižší než 28 pg se považují za projev funkčního nedostatku železa • Dle množství zbytkové RNA rozeznáváme zralé a nezralé retikulocyty (IRF). Cytochemické vyšetření zásobního Fe - I • Zásobní (nehemové) železo ve formě Fe3+ ▪ v erytrocytech ▪ NRBC ▪ makrofázích • Princip: Fe3+ tvoří s ferrokyanidem draselným a kyselinou chlorovodíkovou barevný komplex – berlínskou modř. Cytochemické vyšetření zásobního Fe - II •Hodnocení: zelenomodrá granula ▪v erytrocytech (siderocyty) ▪v NRBC (sideroblasty) ▪zrnka v NRBC okolo 2/3 jádra (prstenčité sideroblasty) ▪v makrofázích (siderofágy) •Normální hodnoty: 20 – 60 % pozitivních NRBC 2 - 4 siderofágy ze 6 nalezených makrofágů •Klinický význam: anémie ▪např.: sideropenické (nízké hodnoty) ▪sideroblastické (přítomné prstenčité sideroblasty, zvýšené zásobní Fe) ▪hemolytické anémie (vysoké hodnoty) ▪refrakterní anémie (vysoké hodnoty) Barvení Fe 3+ Barvení Fe 3+ Barvení Fe 3+ (MDS) Barvení Fe3+ (MDS) Barvení Fe3+ (MDS) Barvení Fe3+ (MDS) Barvení Fe3+ (MDS) Barvení Fe3+ (MDS) Porucha syntézy hemu Sideropenická anémie (nedostatek železa) • KO: pokles HGB, MCV, vyšší RDW • nátěr PK: hypochromní mikrocyty, anulocyty, poikilocyty, bazofilní tečkování • nátěr KD: vyšší erytropoéza, NRBC opožděné vyzrávání cytoplazmy, vyšetřování zásobního Fe (hodnoty snížené nebo nulové) Sideropenická anémie Porucha syntézy globinu Thalasemie • KO: nižší nebo normál. RBC, nižší nebo normál. HGB, výrazně snížené MCV, vyšší RDW, lehce vyšší WBC, lehce vyšší PLT • nátěr PK: mikrocytóza, hypochromie, terčovité ery, polychromázie, bazofilní tečkování, H.J.tělíska, bazofilní tečkování, NRBC, mladší formy WBC • nátěr KD: hyperplazie erytropoézy, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) Thalasemie Porucha syntézy DNA Megaloblastové anémie • KO: MCV >100fl, HGB až pod 50g/L, vyšší RDW, snížení WBC, NE, PLT • nátěr PK: makroovalocytóza, poikilocytóza, Cabotovy prstence, bazofilní tečkování, H.J. tělíska, NRBC, NE hypersegmentace, větší buňky, větší laločnatost jader i u monocytů, velké až gigantické PLT • nátěr KD: buněčně bohatá, erytropoéza zmnožená, posun k mladším formám, (megaloblastová přestavba ve všech vývojových řadách), velké tyče, metamyelocyty, hypersegmentace MGK, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) NRBC Megaloblasty NRBC X Megaloblast Megaloblastová anémie Megaloblastová anémie Aplastické anémie • periferní krev: pancytopenie nebo alespoň anemie a trombocytopenie, mírná makrocytóza a anizocytóza • kostní dřeň: obvykle hypoplastická až aplastická, bývá zmnožení plazm.b. a makrofágů, megaloidní rysy, snížené množství magakaryocytů (MGK) Aplastické anémie KD Dysplastické anémie Dysplázie erytropoézy - porucha vyzrávání, morfologické abnormality • Vrozené (kongenitální dyserytropoetické anémie - KDA) • perifrní krev: často makrocytóza, anizocytóza, poikilocytóza • kostní dřeň: často megaloidní rysy, vícejaderné NRBC, karyorexe, interplazmatické můstky, mitózy, bývají zvýšené zásoby Fe • Získané (řadí se mezi MDS) Anemie ze zvýšené ztráty erytrocytů Korpuskulární • porucha membrány (hereditární sférocytóza, eliptocytóza, stomatocytóza, akantocytóza) • porucha metabolismu • hemoglobinopatie Extrakorpuskulární • imunitní • neimunitní Vyšetření na hemolytické anémie (HA) např.: • volný hemoglobin v plazmě • základní metodika pro vyšetřování hemolýzy v plazmě • haptoglobin • feritin • elektroforéza hemoglobinu Speciální vyšetření: • osmotická rezistence • hemosiderin v moči • hemoglobin F • Heinzova tělíska • autohemolýza • pink test Princip základní metodiky • Volný hemoglobin v plazmě Volný hemoglobin Hb (Fe2+) v plazmě je stanoven fotometricky po jeho oxidaci na hemiglobin (Fe3+) a ten se potom pomocí kyanidu (CN-) draselného přemění na barevný komplex hemiglobinkyanidu, stanovitelný fotometricky. Osmotická rezistence • Princip • Stanovení odolnosti erytrocytů vůči různě koncentrovaným hypotonickým roztokům NaCl v koncentracích od 0,70 % do 0,22 % (odstupňované po 0,02 %). • Jestliže jsou erytrocyty v isotonickém roztoku 0,9% NaCl, dochází na membráně buňky k rovnovážnému stavu a kapalina se nedostává ani z buňky ani do buňky. • Jestliže jsou erytrocyty umístěny v prostředí hypotonického roztoku (0,70 - 0,22 % NaCl), tak buďto prasknou a dojde k hemolýze nebo se vytvoří na membráně rovnováha. Osmotická rezistence normál patologie příprava Osmotická rezistence - hodnocení • Výši osmotické rezistence posuzujeme podle koncentrace roztoku, ve kterém pozorujeme první známky osmotické hemolýzy (minimální osmotická rezistence) a podle koncentrace roztoku, ve kterém hemolyzovaly všechny krvinky (maximální osmotická rezistence). • Snížená osmotiská rezistence: 0,46 % a výše - 0,34 % a výše • Zvýšená osmotická rezistence: 0,40 % a níže - 0,30 % a níže Nulová hemolýza Krvinky tvoří souvislý sediment, který je ostře ohraničený od bezbarvého nebo lehce nažloutlého roztoku NaCl. Musí být ve zkumavce s fyziologickým roztokem. Částečná hemolýza Roztok NaCl nad sedimentem je zbarven do světle červena. Úplná hemolýza Červená barva roztoku NaCl se vyrovná červené barvě ve zkumavce s destilovanou vodou. Musí být ve zkumavce s destilovanou vodou. Osmotická rezistence – klinický význam • Osmotická rezistence erytrocytů popisuje odolnost erytrocytů vůči hypotonickým roztokům (roztoky NaCl). Fyziologické erytrocyty se vyznačují určitou odolností vůči hypotonickým roztokům, ale vlivem některých chorob, zejména vrozených a získaných hemolytických anémií dochází ke snížené této odolnosti. Erytrocyty pak v hypotonickém prostředí natahují vodu a vlivem zvýšeného tlaku na membránu dochází k hemolýze. • Primární faktor ovlivňující osmotickou rezistenci červených krvinek je jejich tvar, který závisí na objemu a povrchu buňky a na funkčním stavu membrány erytrocytů. Větší povrch červených krvinek v poměru k velikosti buňky umožňuje absorbovat více tekutiny, aniž by došlo k protržení buněčné membrány a následně k lýze buňky (tzn. větší rezistence buněk k hemolýze a snížená fragilita membrány). • Například terčovité erytrocyty mají větší povrch buňky a tedy vykazují zvýšenou rezistenci. Sférocyt má menší povrch než je jeho objem, dojde k protržení membrány, což je snížená rezistence. • snížená osmotická rezistence (u hemolytických anemií a hereditární sferocytózy) 0.46% a výše a 0.34% a výše • zvýšená osmotická rezistence (při polycytémii, talasémii a jaterních onemocněních) 0.40% a níže a 0.30% a níže Hemosiderin v moči • Princip Fe3+ v hemosiderinu reaguje s kyselým roztokem ferrokyanidu draselného na ferrokyanid železitý, který vytváří krystalky Berlínské modři. • Klinický význam • Zásobní železo se v organizmu nachází v podobě feritinu a hemosiderinu. Hemosiderin je na rozdíl od feritinu nerozpustný ve vodě a obsahuje více železa. • Hemosiderin dává pozitivní reakci s ferokyanidem draselným v podobě zrníček berlínské modři. Zrníčka jsou uložena v tubulárních epiteliích nebo volně, případně tvoří válce. • Hemosiderin tvoří s ferokyanidem draselným nerozpustná granula, která jsou v malém množství viditelná mikroskopem, ve velkém množství je lze spatřit i makroskopicky. • Jeho zvýšené množství se ukládá do orgánů při onemocněních spojených s velkým rozpadem erytrocytů (hemolytické anemie), po častých transfúzích, při poruchách ukládání zásobního železa, atd. • Přítomnost hemosiderinu v moči je detekovatelná 2 až 5 dnů po hemolytické krizi. Hemosiderin v moči ++++ velké množství hemosiderinu, roztok je zbarven již před centrifugací +++ sediment po centrifugaci vytváří na dně zkumavky modrý kroužek ++ na dně zkumavky po centrifugaci jsou patrná modrá zrnka, mikroskopicky tvoří hemosiderin četné shluky zrn + makroskopicky nelze hemosiderin prokázat, mikroskopicky tvoří ojedinělé shluky zrn stopa hemosiderin je v moči přítomen jen jako ojedinělá zrnka • Semikvantitativní metoda • Nachází – li se v moči hemosiderin, jsou přítomna modře zbarvená menší či větší zrnka berlínské modři. • Zrnka berlínské modři odečítat mikroskopicky nebo makroskopicky: Hemosiderin v moči Hemoglobin F • Princip Nafixované, zaschlé nátěry se ponoří do pufru pH 3.3. Hemoglobin A (adult hemoglobin) je v buňce rozpuštěn a vyplaven, hemoglobin F (fetální hemoglobin) je ke kyselému prostředí rezistentní a v erytrocytu zůstává. Zbylý hemoglobin F se potom barví a odečítá mikroskopicky. • Hodnocení procentuelní hodnocení sytě zbarvených erytrocytů • novorozenci: 50 - 90 % HbF • věk < 2 roky: 0 - 4 % HbF • věk > 2 roky: 0 - 2 % HbF Hemoglobin F Heinzova tělíska • Heinzova tělíska znázorňují vysrážený hemoglobin v případě, že glykolytické enzymy červených krvinek nejsou schopny zabránit oxidaci hemoglobinové molekuly. Tyto precipitáty jsou představovány jedním nebo více oválnými tělísky v červených krvinkách. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které přiléhají. • Během života normální červené krvinky dochází postupně ke snižování množství jednotlivých enzymů a tedy ke tvorbě malého množství Heinzových tělísek. • Heinzova tělíska nalézáme ve větší míře za přítomnosti nestabilních hemoglobinů, při nedostatku některých enzymů (např. G-6-PDH) v redukujícím systému erytrocytů a po užívání oxidačních látek ( např. sulfonamidy, antimalarika, streptomycin atd.). • U nestabilních hemoglobinů odstraňuje Heinzova tělíska z červených krvinek slezina, proto nejsou v buňkách viditelná, tělíska nejsou odstraňována, pokud je provedena splenektomie. • Heinzova tělíska nejsou viditelná při běžném panoptickém barvení, ale až po barvení např. brilliantcresylovou modří. Je-li toto barvení negativní, necháme krvinky reagovat s redukující látkou acetylfenylhydrazinem. Toto barvení je pozitivní, jestliže je nedostatek enzymů v redukujícím systému červené krvinky. • Barvení nátěrů neinkubováných erytrocytů sleduje nestabilní hemoglobiny. • Barvení nátěrů inkubováných erytrocytů sleduje enzymatické poruchy. Heinzova tělíska Vyšetření HA Fotometrická vyšetření na principu stanovení volného hemoglobinu v plazmě. • Autohemolýza Hodnocení spontánní hemolýzy v prostředí fyziologického roztoku, glukózy a ATP po dobu 48 hodin. • Pink test Orientační vyšetření při podezření na hereditární sférocytózu Vyšetření HA – Autohemolýza • Hodnocení spontánní hemolýzy defibrinované krve, která je inkubovaná při teplotě 37oC v prostředí fyziologického roztoku, glukózy a ATP po dobu 48 hodin. • Stupeň hemolýzy je ve fyziologickém roztoku vždy větší než po přidání glukózy a ATP. U normálního vzorku se hemolýza po přidání glukózy a ATP snižuje. • Hereditární sférocytoza: autohemolýza výrazně zvýšena, po přidání glukózy se snižuje. • PNH: autohemolýza také zvýšená, ale po přidání glukózy se hemolýza snižuje. • Deficit pyruvátkinázy: autohemolýza ve fyziologickém roztoku výrazně zvýšená • po přidání ATP se upravuje • po přidání glukózy se hemolýza neupravuje. • Deficit G-6-PDH: autohemolýza ve fyziologickém roztoku normální nebo lehce zvýšená, po přidání ATP a glukózy dochází k částečné úpravě. Vyšetření HA – Pink test • Orientační vyšetření při podezření na hereditární sférocytózu. • V testu se stanovuje konečné procento hemolýzy v prostředí glycerolu při pH 6,6. • Pro snadné a rychlé provedení (ve srovnání s testem na osmotickou rezistenci a testem autohemolýzy) se test používá jako doplňující a vyhledávací vyšetření na dědičnou sférocytózu. Ref. rozmezí: 1 - 23.7 %, průměrná hodnota 10% Hereditární sférocytóza: 32 – 90 % s průměrem 60% Vyšetření HbS, HbA2 • Princip metody: aniontová chromatografie hemoglobinů, která probíhá v pufrovaném prostředí o specifickém pH. Na pozitivně nabité částice pryskyřice se naváží části hemoglobinu s negativním nábojem. Jednotlivé hemoglobinové frakce se z chromatografické kolony vymyjí pufrem po změně pH nebo iontové síly. Množství jednotlivých typů hemoglobinů se vyšetřuje spektrofotometricky. HbA2 • Přesné stanovení množství HbA2 v klinické praxi je důležité pro diferenciální diagnostiku anemií a thalasemií. Pro určení přesné diagnózy je nutné přihlížet také k ostatním laboratorním výsledkům, zejména se jedná o železo v séru, vazebnou kapacitu železa, morfologii červených krvinek, hemoglobin, hematokrit a střední objem erytrocytů (MCV). • Celkové množství HbA2 se ve spojení s hodnotou MCV používá jako kritérium pro diferenciální diagnostiku -talasemie minor, anemie z nedostatku železa a další hypochromní mikrocytární anemie. • U -talasemie se může hodnota HbA2 pohybovat ve fyziologických mezích v případě, že je snížené množství železa. HbS • Kvantitativní stanovení HbS je klinicky významné pro diagnostiku srpkovité anémie (také u pacientů trpících současně srpkovitou a  nebo -talasemií) a dále u pacientů se srpkovitou anémií, kteří jsou léčení transfuzemi. Za normálních okolností je hodnota HbS negativní, v případě heterozygotů (Sickle cell trait: genotyp A/S) se hodnota HbS pohybuje v rozmezí 20-40%, v případě homozygotů (Sickle cell anemia: genotyp S/S) se hodnota HbS pohybuje v rozmezí 80-100%