Principy vyšetření hemostázy RNDr. Jiřina Zavřelová OKH FN Brno Trombóza - Hemostáza - Krvácení Fyziologie krevního srážení • Základní homeostatický mechanizmus • Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb – cévní stěny – trombocytů – plazmatické koagulační faktory – plazmatické inhibitory – systém fibrinolytický Dělení testů • Testy globální – postihují celý systém (i více) • Testy skupinové (screening) – postihují určitou část koagulačního systému – umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu • Testy speciální – vyšetřují jednotlivé složky systémů Dělení testů dle principu • Koagulační • Fotometrické • Imunochemické • Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) • Sledování času rozpuštění koagula • Sledování rozpustnosti koagula • Jiné Dělení testů dle principu • Koagulační – sledování času srážení (srážlivá plná krev) • bez přídavku aktivátoru/aktivovaná doba srážení (ACT) – manuálně (kývání) – POCT (přenosné přístroje point of care) – sledování času vytvoření fibrinového vlákna (plasma) • manuálně (háčkování) • koagulometr (poloautomat, automat) – mechanické » kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) » háčkové » vibrační – optické » nefelometrie (sledování rozptylu světla) » turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) » limitace – chylózní vzorky Doba srážení - kývání • Naklánění zkumavky • První metoda detekce času srážení – vizuálně pozorujeme vznik sraženiny POCT –ACT (HEMOCHRON) • Odkápnutí krve do testovací jamky jednorázové kyvety s reagencií (aktivátor) a vložení do pokusné komory • Pohyb vzorku po smíchání vzorku s reagencií v pokusném kanálku předurčenou rychlostí • Začátek tvorby koagula je detegován na základě zpomalení toku vzorku v pokusném kanálku mezi optickými detektory LED „Háčkování“ • První skutečně použitelná metoda • Protahujeme háček reakční směsí a pozorujeme vznik koagula • Dostatečně přesná, dostatečně citlivá • Výhody – jednoduché a levné vybavení – velmi zkušená laborantka je přesná • Nevýhody – potřeba velmi zkušeného personálu – subjektivní ovlivnění – velký vliv koncentrace fibrinogenu – velká spotřeba reagencií Háčkové koagulomery • Využívají vyšší vodivosti fibrinového vlákna • Dvě elektrody, alespoň jedna ve tvaru háčku • Vzniklé fibrinové vlákno vodivě spojí elektrody – zaznamená se čas • Výhody: – relativně přesné – málo citlivé na koncentraci fibrinogenu – detekují opravdu první fibrinové vlákno • Nevýhody: – komplikovaná jemná mechanika – pracné čištění – velký objem reagencií Koagulometry vibrační • Princip – v kyvetě umístěn vibrující plátek s elektromagnetickou detekcí – Při tvorbě fibrinu dochází ke zvýšení viskozity a zpomalení vibrace kovového plátku – Vyhodnocení změny frekvence vibrací se současným zastavením ukazatele času • Výhody – poměrně citlivý, není prakticky citlivý na koncentraci fibrinogenu • Nevýhody – obtížná manipulace s vibr. plátky a možnost kontaminace vzorku Koagulometry kuličkové • Kuličkové • Měří se změna viskozity – Viskozita reakční směsi ovlivňuje pohyb detektoru • Detektor je kulička – většinou ocelová, někdy se specifickým potahem na povrchu – riziko zmagnetizování kuliček - nereprodukovatelné výsledky • Po startu mají mrtvý čas – nutné k nastavení přístroje pro příslušný vzorek Viskozitní koagulometry • Citlivost – Je nepřímo úměrná momentu hybnosti detektoru p = m * v (m=hmotnost,v=rychlost) • Přesnost – Je přímo úměrná frekvenci pohybu detektoru • frekvence pohybu je úměrná rychlosti • Zvýšení citlivosti - snížení momentu hybnosti detektoru – Snížení hmotnosti • má limity, příliš nízká hmotnost detektoru znamená větší možnost rušení – Snížit rychlost • menší rychlost znamená menší přesnost Koagulometr Amelung • Rotující kyveta s kuličkou • Magnetický senzor • Poměrně velká kulička • Poměrně pomalý pohyb • Výhody – kulička prochází většinou objemu • Nevýhody – velký objem reagencí – nižší citlivost • První masově rozšířený koagulometr Koagulometr Benck CL • Kuličkový koagulometr • Malá kulička, rychlá rotace • Optický senzor • Měří změnu frekvence průchodů kuličky před detektorem • Výhody – Malý objem reagencíí – Průměrná citlivost • Nevýhody – problémy se vzorky s dlouhým nebo velmi krátkým koagulačním časem • kulička tuneluje f t f t f t Koagulometr Stago • Kuličkový koagulometr • Malá kulička, kývavý pohyb • Elektromagnetický senzor • Měří změnu frekvence a amplitudy kuličky • Zpomalení, zastavení pohybu kuličky je detekováno jako koagulační čas Koagulometry Stago • Výhody – kývavý pohyb kuličky – mění se rychlost • v úvratích má kulička nulovou rychlost • velice vysoká citlivost • měření fibrinogenu od 0,2 g/l – chylózní, ikterické, hemolytické vzorky • Nevýhody – velký objem reagencií pro fotometrické testy z důvodu přítomnosti kuličky Optické koagulometry • Měří vznik zákalu nikoli přímo koagula – Problém vyhodnocení naměřené reakční křivky – Různí výrobci mají rozdílné řešení • určení rozdílu před a po koagulaci • derivace koagulační křivky • určení počáteční rychlosti Optické koagulometry • Citlivé na rychlost tvorby koagula – nízký fibrinogen – přítomnost inhibitorů (heparin) • Citlivé na zabarvení plasmy – ikterická plasma – chylózní plasma – hemolytická plasma A t A t A t A t Derivace A t Rozdíl A t Rozdíl A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl 50 % A t Rozdíl A t Derivace Rozdíl a Derivace • Není problém u normálních vzorků • U pomalu koagulujících vzorků významně prodlužují koagulační časy A t Počáteční rychlost A t Počáteční rychlost A t Počáteční rychlost Počáteční rychlost • Není problém u normálních vzorků • Pomalu koagulující vzorky významné zkrácení času Optické koagulometry • Výhody – Jednodušší konstrukce – Snadná implementace do automatů • Nevýhody – Nelze analyzovat zabarvené vzorky – Problémy při pomalém vzniku koagula – Nutno udržovat optiku v perfektní čistotě Dělení testů dle principu • Fotometrické – sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) • end point“ (A) • kinetické (A/min) – limitace -hemolytické a ikterické vzorky • Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) – sledování změn zakalení • detekce změn transmise (propustnosti T) • detekce změn absorbance – limitace- chylózní vzorky Chromogeny • Chromogenní substrát – uměle připravený NO3NHArg bezbarvý paranitroanilid velkoobjemová koncovka aminokyselinové raménko zakončené Argininem Chromogeny • Princip – enzymy štěpí substrát – vzniká žluté zbarvení – měříme při 405 nm NO3NH2 Arg NO3NH paranitroanilin Kinetické měření čas měření (min) A 405 nm 1 min  A/min Dělení testů dle principu • Imunochemické – sledování reakce antigenu s protilátkou • aglutinace • LIA • ELISA • EID Aglutinační metody • sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání makroskopicky – pozitivní( +, ++, +++)/negativní – semikvantitativní metody (udaná mez detekce) • metody – latexaglutinační (např. FDP, D-Di) – hemaglutinační (např. FM) Antigen Latex + Příklad vyšetření D-Dimerů – semikvantitativní výsledek Mez detekce = 0,5 mg/l Neředěný vzorek Vzorek ředěný 1:6 Výsledek aglutinace - - < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody • sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigenu • odečítání optickým systémem koagulometru – změna zakalení (A/min) • kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag…) • Limitace – Chylozita vzorku – Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) LIA testy • Provedení (STA© Liatest© D-Dimer) 100 ml pufru 50 ml vzorku inkubace 240 s 150 ml latexového činidla měříme změnu absorbance mezi 12 s – 140 s LIA testy • kalibrace – sigmoidní – polynom 3. řádu – minimálně 5 bodů – platí pro celou šarži 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 2 4 6 A mg/l LIA kalibrace ELISA metody • stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) • kvantitativní metoda – inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab – odsátí vzorku + promytí – inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag – odsátí AbE a promytí – detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) • přímá úměra: enzym. aktivita x množství Ag + + Elektroimunodifúze - EID metody • vyšetřovaný antigen reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku – délka píku je přímo úměrná koncentraci antigenu • kvantitativní metoda Princip EID kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů • Vyšetření funkční aktivity – koagulační metody – fotometrické metody • Vyšetření antigenu – imunochemické metody – umožňují odlišení defektů • kvalitativních • kvantitativních