Martin Vrba OKMI FN Brno Specifika odběrů pro bakteriologická vyšetření —Správný výsledek mikrobiologického vyšetření začíná správným odběrem biologického materiálu a jeho správným transportem do mikrobiologické laboratoře! Odběr biologického materiálu —Ze správného místa – např. z okraje rány, z místa akutně probíhajícího zánětu apod. —Ve správnou dobu – např. hemokultury při třesavce, před podáním antibiotik —Opakovaně – zvýší se pravděpodobnost záchytu infekčního agens —Zabránění kontaminace Odběr biologického materiálu —Odběry do komerčních odběrových souprav —Pro různé materiály různé odběrové soupravy —Správná identifikace materiálu Obecné zásady transportu — —Co nejrychleji po odběru do laboratoře —Stěry na suchém tampónu a moče do 2 hodin po odběru Uchování materiálu —Pokojová teplota: —Stěry a výtěry v transportní půdě —Hemokultury —Likvory —Hnisy a punktáty —Chladničková teplota (4-8°C): —Moč —Stolice na průkaz toxinu C.difficile —Krev na sérologická vyšetření — Stěry a výtěry — —Výtěr z krku, nosu, ucha, oka, z rány, z kůže, z konečníku, z uretry, z pochvy atd. —Sterilní vatový tampon —Suchý – zpracování do 2 hodin po odběru —S transportní půdou —bez aktivního uhlí —s aktivním uhlím —Možnost uchování až 24 hodin při pokojové teplotě Stěry a výtěry —Co nejdříve zpracovat v laboratoři —Bez mikroskopie —Anaerobní kultivace — Odběrová souprava P1010155 Sputum — —Odběr ráno, na lačno, někdy po provokaci expektorace —Sterilní široká zkumavka ,,sputovka“ —Ne sliny, ale sputum z dolních cest dýchacích —Nutno zpracovat do 2 hodin po odběru —Uchování při pokojové teplotě Odběrová souprava _A223328 Sputum - zpracování —Mikroskopie —Kultivace semikvantitativní —Postupné ředění sputa —Signifikantní nález v ředění 10-7 — pro semikvantitativní vyšetření se nehodí sliny – zavádějící výsledek Moč —Odběr většinou ráno —Odběr za aseptických podmínek po předchozím umytí, případně dezinfekci do sterilní užší zkumavky —První porce při zánětech močové trubice —Střední proud při infekci močového měchýře —Poslední porce při infekcích prostaty a vyšších etáží močové soustavy — Odběr moče —5 – 7 ml moči —Uchování při chladničkové teplotě —Zpracovat do 2 hod po odběru —Vysoké riziko kontaminace Zkumavky na odběr moče P1010161 Vyšetření moče — —Semikvantitativní —Vyočkování kalibrovanou kličkou 1 µl —Postupné ředění a vyočkování moče —Přístrojové vyhodnocení množství leukocytů a bakterií —Signifikantní množství 105/ml Hnis, punktát —Tekutý materiál vždy, pokud je to možné —Mikroskopie —Širší škála kultivačních půd —Odběr pomocí stříkačky —Transport —Ve stříkačce bez přístupu vzduchu —Ve sterilní zkumavce —Uchování při pokojové teplotě — Odběr tkáně —Odběr za aseptických podmínek —Odběr do sterilní širší zkumavky —Uchování při pokojové teplotě Likvor (mozkomíšní mok) — —Odběr asepticky lumbální punkcí nebo z drénů —Transport ve sterilní zkumavce s pevným uzávěrem —Odběr 2 – 3 ml likvoru —Uchování při pokojové teplotě —Možnost odběru a transportu v lahvičce na hemokultury Krev — —Hemokultivace — —Odběr pro sérologická vyšetření průkazu protilátek Odběr krve na hemokultivaci —Diagnostika sepse —Odběr —při nárůstu teploty, při třesavce —Při kontinuální teplotě kdykoli —Vždy venepunkcí —Při přítomnosti katetru zároveň venepunkcí i z katetru, možnost diagnostiky katetrových sepsí —Odběr za aseptických podmínek — Odběr krve pro hemokultivaci —Počet odběrů: 2x – 3x denně —Kultivace aerobní a anaerobní —5 – 10 ml krve u dospělých —0,5 – 3 ml krve u dětí —Uchování při pokojové teplotě — Lahvičky pro odběr, transport a kultivaci hemokultur lahvičky Stolice —Výtěr z konečníku do transportní půdy na obligátní střevní patogeny —Kousek stolice pro parazitologické vyšetření do širší zkumavky, nemusí být sterilní —Odběr kousku stolice pro průkaz toxinu Clostridium difficile —Lepex – otisk perianálních řas na lepící pásku, průkaz vajíček roupů Urogenitální trakt —Výtěr z uretry —Výtěr z pochvy —Výtěr z cervixu —Při podezření na GO i výtěr z rekta a krku (transportní půda) — Urogenitální trakt —Výtěr do transportní půdy —Běžná aerobní kultivace —Anaerobní kultivace —Kultivace na GO —Diagnostika Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis —Kultivace kvasinek Urogenitální trakt —Výtěr z pochvy doplnit nátěrem na 2 skla —Nátěr nechat zaschnout, nefixovat, nelepit —Mikroskopický průkaz infekce nebo změny ve složení vaginální flóry —Přítomnost leukocytů —Přítomnost laktobacilů —Možnost barvení na Trichomonas vaginalis — Odběry pro mykologická vyšetření — —Šupiny kůže z okraje ložiska sterilním skalpelem do sterilní zkumavky —Mokvající plochy – stěr do transportní půdy —Nehty – seškrab sterilním skalpelem z okraje ložiska — Odběr k vyšetření molekulárně – genetickou metodou (PCR) — — —Tekutý materiál —Stěr suchým vatovým tampónem —Odběr bez příměsí chemických látek (heparin, agar) Vyšetřovací metody v mikrobiologii — —Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií nebo virů– bakteriologie, virologie — —Nepřímý průkaz – průkaz reakce makroorganizmu na přítomnost bakterií nebo virů - sérologie Vyšetřovací metody v bakteriologii — —Mikroskopie —Kultivace —Průkaz antigenů —Průkaz metabolitů —Průkaz nukleových kyselin Mikroskopie — —Preparát nativní —Preparát barvený —Barvení dle Grama —Barvení dle Giemsy —Barvení dle Ziehl – Nielsena — — — C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\Olympus-CX-43[1].jpg Nativní preparát —Suspenze materiálu nebo kultury ve fyziologickém roztoku —Pro pozorování živých mikroorganizmů, posouzení jejich pohyblivosti —100 – 400násobné zvětšení —Využití: —bakteriologie – sledování typického pohybu bakterií (listerie, cholera) —parazitologie – průkaz střevních parazitů ve stolici —mykologie – sledování růstu a množení kvasinek — Nativní preparát –pučení kvasinek nativní preparát kvasinky Barvení podle Grama —Hans Christian Joachim Gram, 1884 — —Dělí bakterie do dvou základních skupin dle složení buněčné stěny (Gram pozitivní a Gram negativní) —Mikroskopie při 1000násobném zvětšení s použitím imerzního oleje mezi preparátem a objektivem Barvení podle Grama - postup —Zhotovení nátěru na sklíčko —Fixace plamenem nebo metanolem —Barvení: —Krystalová violeť (20 - 30 s) —Lugolův roztok (20 - 30 s) —Oplach vodou —Odbarvení acetonalkoholem (10 s) —Safranin (1 min) — — Barvení podle Grama —G+ koky ve dvojicích —G- tyčinky Pneumokok_spu C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010227.jpg Barvení podle Grama - význam — —Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií — —Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie Barvení podle Giemsy — —Slouží k diferenciaci buněčných struktur —Použití hlavně v parazitologii: —Mikrobiální obraz poševní – průkaz Trichomonas vaginalis —Diagnostika malárie —Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů —Fixace metanolem Barvení podle Giemsy — —Azur a eosin rozpuštěný ve směsi glycerinu a metanolu —Ředěn neutrální destilovanou vodou —Roztok není stabilní, používá se vždy čerstvý Barvení podle Giemsy —Plasmodium falciparum – tlustá kapka —Plasmodium falciparum – tenký roztěr Barvení podle Ziehl - Nielsena — —Barvení acidorezistentních tyčinek —Špatně barvitelné —Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně — —Nejčastěji Mycobacterium sp. Barvení podle Ziehl - Nielsena — —Fixace teplem —Barvení karbolfuchsinem —Zahřátí —Odbarvení kyselým alkoholem —Oplach vodou —Dobarvení malachitovou zelení — Barvení podle Ziehl - Nielsena — — — — —Mycobacterium tuberculosis Kultivační průkaz — —Základní mikrobiologický postup —Cílem je získat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře —Identifikace mikroba —Určit citlivost k antibiotikům — Kultivační půdy — —Dělení podle konzistence: —Tekuté – k pomnožení bakterií —Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií —Tuhé, pevné Kultivační půdy —Dělení podle funkce: —Základní – masopeptonový bujon, krevní agar —Diagnostické – obsahují látky, které se mění vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení laktózy) —Selektivní – k výběrovému růstu bakterií, obsahují látky, které potlačují některé bakterie —Selektivně diagnostické Kultivační půdy — —Dělení podle funkce (pokračování) —Transportní - k transportu (bez množení) – umožňují přežití bakterií při transportu —Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií ve vzorku, mohou být i selektivní Podmínky kultivace — —Dostatečná vlhkost prostředí —Optimální teplota: 37°C (4°C, 42°C) —Optimální pH půdy: 7,2 – 7,4 —Vhodná izotonie média: 0,5 – 1% NaCl —Dostatek vhodných živin —Vhodné plynné prostředí Dělení bakterií podle vztahu ke kyslíku — —Striktně aerobní —Fakultativně anaerobní —Striktně anaerobní —Anaerobní aerotolerantní —Mikroaerofilní —Kapnofilní — Nádoba pro anaerobní kultivaci P1010166 Anaerostat P1010162 Termostat se zvýšenou tenzí CO2 P1010116 Hlavní druhy kultivačních půd —Masopeptonový bujon —Krevní agar —Čokoládový krevní agar —MacConkey agar —Sabouraudův agar —XLD agar (xylóza – lyzin - deoxycholát) —Mueller – Hintonův agar —Chromagary — Masopeptonový bujón P1010159 Krevní agar – nárůst S.aureus S MacConkey agar a krevní agar nárůst E.coli ESCO- izolace na KA+McC XLD agar – nárůst Salmonella sp. C:\Users\41730\Documents\P5310275.JPG Karmali agar - nárůst Campylobacter sp. — C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_1117.JPG Identifikace bakterií —Podle morfologie —Podle růstových vlastností —Hmotnostní spektrometrie – metoda MALDI TOF —Podle biochemických vlastností —Selektivní půdy —Komerční diagnostické soupravy —Podle antigenní struktury —Latexová aglutinace — — Biochemické určení bakterií P1010151 Stanovení citlivosti na antibiotika —Disková difúzní metoda —Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana růstu bakterií — —Diluční testy —Stanovení koncentrace antibiotika, která je ještě na mikroba účinná Disková difúzní metoda přelévaný test Diluční metoda – mikrotitrační destičky destička MIC 2 Diluční metoda – E-test C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010087.JPG Průkaz antigenů z materiálu —Latexová aglutinace — vyšetření likvoru, moče —Imunochromatografie — vyšetření moče – Legionella pneumophila, —Streptococcus pneumoniae — vyšetření stolice - Clostridium difficile, střevní viry, Helicobacter pylori —Latexová aglutinace —Imunochromatografie P1010143 C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_4333.JPG Průkaz metabolitů —Těžko kultivovatelné bakterie — —Rychlý průkaz —Např. infekce Helicobacter pylori — průkaz produkce ureázy Průkaz nukleových kyselin —Průkaz přítomnosti nukleové kyseliny mikroorganizmu v klinickém vzorku — —Druhová identifikace izolovaného mikrobiálního kmene