VYŠETŘENÍ DÁRCŮ KRVE Mgr. Jana Tylečková VYŠETŘENÍ ODEBRANÉ KRVE A JEJÍCH SLOŽEK ¢Vyhláška o lidské krvi 143/2008 ve znění pozdějších předpisů ¢Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP ¢Vzorek na vyšetření se obvykle získává v souvislosti s vlastním odběrem ¢V odebrané krvi a jejích složkách se vyšetřují: —Markery nejvýznamnějších infekčních — chorob přenosných krví —Základní imunohematologické — parametry — SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ ¢Vyšetření k průkazu známek infekce: —virem HIV 1 a 2: stanovení protilátek a antigenu p24 a nově přímá detekce virové RNA —virem HBV: stanovení povrchového antigenu a nově přímá detekce virové DNA —virem HCV: stanovení protilátky a nově přímá detekce virové RNA —syfilis: stanovení specifické anti-treponemové protilátky — —nově vyš. anti-HBc protilátek – u každého dárce, u kterého dosud nebyly vyšetřeny ¢ při každém odběru SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ - SEROLOGICKÉ METODY ¢Serologické metody - průkaz přítomnosti infekčního agens v krvi dárce je založen na průkazu specifických protilátek (nepřímý průkaz) nebo antigenů (přímý průkaz) —Imunochemické metody - založeny na reakci antigenních determinant s vazebným místem protilátky. ¢U imunochemických metod je dosahováno zvýšení citlivosti značením jedné z reagujících složek – antigenu nebo protilátky látkou, která je v závěru reakce detekována. ¢Příklady používaných metod: EIA (ELISA), chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, … OMEZENÍ SÉROLOGICKÝCH METOD ¢Všechny screeningové laboratorní testy jsou zatíženy rizikem diagnostického okna —Diag. okno = doba od nákazy až do okamžiku, kdy test dokáže infekci spolehlivě detekovat ¢Diagnostické okno sérologických testů: ¢ ¢HIV – 2 až 3 týdny ¢HBV – 4 až 6 týdnů ¢HCV – 2 až 6 měsíců ¢ ØDůraz na vysokou senzitivitu požívaných testů Ømetody NAT (Nucleic Acid Testing) - PCR SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ - PCR ¢Přímý průkaz infekčního agens v krvi dárce je založen na detekci nukleových kyselin infekčního agens (NAT) ¢ ¢Detekce nukleových kyselin —V současné době nabývá na významu především metoda real-time PCR a multiplexní PCR. —Tato moderní technologie umožňuje rychlou a citlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA infekčního agens. ¢ ¢MULTIPLEXNÍ PCR —Současná amplifikace několika cílů najednou (DNA, RNA) —Použito je více párů specifických primerů komplementárních k různým cílovým sekvencím v jedné amplifikační reakci —Reverzní transkripce a PCR amplifikace probíhá v téže reakční směsi — ¢REAL-TIME PCR —Reakční směs je obohacena o detekční sondy značené oznamovacími fluorescenčními barvivy, tyto sondy během PCR hybridizují se vznikajícími produkty —Detekce a rozlišení PCR produktů v reálném čase jsou prováděny měřením fluorescence uvolněných oznamovacích barviv ¢ ¢ ¢ PCR ¢Polymerázová řetězová reakce – metoda, která slouží k namnožení úseků DNA, výsledkem je obrovské množství kopií původní sekvence DNA ¢Tři základní pochody PCR, které se cyklicky opakují: —1. DENATURACE – denaturace DNA vlivem vysoké teploty (92 – 96°C), rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA, rozvolnění dvoušroubovice, vznik jednovláknové DNA —2. HYBRIDIZACE – nasednutí krátkých úseků DNA (primery – 20 až 25 nukleotidů) při teplotě 45 – 65°C —3. ELONGACE – na řetězec DNA je napojena DNA-polymeráza, která zajišťuje připojování nových nukleotidů (syntéza DNA) — SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ - PCR ¢Vyšetření nukleových kyselin (NAT) – v ČR bude povinné od 1.7.2024 (ve většině evropských zemí se provádí): — —HIV-RNA —HCV-RNA —HBV-DNA — — —Dle epidemiolog. situace (příp. dle požadavků zpracovatele plazmy): ¢WNV - RNA (sezonně) ¢HAV – RNA ¢Parvovirus B19 ¢HTLV I/II - RNA (zámoří) ¢ — VÝZNAM NAT ¢ ¢Zkrácení diagnostického okna ¢Je důležité, abychom byli schopni identifikovat dárce, kteří se nacházejí ve velmi časných fázích infekce HCV, HIV nebo HBV. Kritické období před vytvořením protilátek proti viru je označováno jako „imunologické okno“. ¢U HIV a HCV vzniká již během „imunologického okna“ vysoká virémie, kdy pravděpodobnost přenosu nákazy je vysoká. ¢Naopak během infekce HBV je rychlost replikace virů v období imunologického okna nízká. ¢ ¢HIV o 7 – 9 dní ¢HCV o 59 – 65 dnů ¢HBV o 25 – 30 dnů ¢ SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ ¢V případě reaktivity se vzorek vyšetřuje v dubletu, při opakované reaktivitě se vzorek zasílá ke konfirmaci do NRL (povinnost), TP nejsou uvolněny k použití. ¢ (v NR osob trv. vylouč. z DK) IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ DÁRCŮ KRVE A JEJÍCH SLOŽEK ¢Závazná vyšetření dle legislativy: ¢Z každého odběru se provádí: —vyšetření krevní skupiny AB0, RhD —screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům ¢U každého dárce se stanoví Rh fenotyp (C, c, E, e) a antigen Kell (K). V případě nálezu Kell pozitivity se vyšetřuje i antigen Cellano (k). ¢ ¢ STANOVENÍ AB0 ¢Noví dárci: —Vyš. 2x ze 2 nezávislých vzorků — (Za nezávislé vzorky lze považovat např. krevní vzorek odebraný před odběrem pro vyšetření krevního obrazu a/nebo krevní vzorek odebraný při vlastním odběru např. z přídatného váčku odběrové soupravy a/nebo segment hadičky spojené s transfuzní soupravou / transfuzním přípravkem. ) —Z toho alespoň 1x stanovení antigenů erytrocytů i stanovení protilátek proti nim —Druhé vyšetření AB0 může zahrnovat pouze určení antigenů —Minimálně: diagnostická séra anti-A a anti-B, diagnostické erytrocyty A1 a B. ¢Opakovaní dárci: —Vyšetřují se alespoň antigeny erytrocytů (1x) —Za druhé (referenční) vyšetření se považuje výsledek vyšetření v databázi z předchozích odběrů. Je nutné zajištění kontroly shody výsledku vyšetření krevní skupiny s údaji v databázi. STANOVENÍ RHD ANTIGENU ¢Noví dárci: —2 vyšetření, ze dvou nezávislých vzorků —Diagnostická séra: anti-D třídy IgM s 2 různými klony + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“) —Variantní/slabé D: ¢vyšetřuje se u RhD negativních dárců ze 2 nezávislých vzorků ¢Diagnostická séra anti-D s 2 různými klony (IgG), metodou NAT + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“). Diagnostická séra by měla zachytávat minimálně variantu DVI. ¢V případě pozitivního či diskrepantního výsledku s oběma diagnostickými séry pro vyšetření slabého D se dárce označí jako Dw/v, transfuzní přípravek jako RhD pozitivní; při jasné negativitě s oběma séry se dárce i transfuzní přípravek označí jako RhD negativní. ¢Opakovaní dárci: —1 vyšetření, diagnostické sérum anti-D třídy IgM + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“) —Za 2. (referenční) vyšetření se považuje výsledek vyšetření v databázi z předchozích odběrů —Neprovádí se vyšetření slabého D STANOVENÍ RH FENOTYPU A ANTIGENU KELL ¢ ¢Vyš. antigenů C, c, E, e , Cw (dop.) a K (Kell) ¢ U nového dárce 1x + 1x se ještě ověřuje z druhého nezávislého vzorku nebo při následujícím odběru ¢Nevyžadují se 2 různé klony diagnostických sér ¢V případě nálezu Kell pozitivity (K+) se vyšetřuje i antigen Cellano (k). ¢ ¢Další antigenní systémy: ¢především u dárců krevní skupiny 0 je vhodné určit fenotyp i v dalších antigenních systémech (např. Duffy, Kidd, MNSs, Lutheran, aj.) ¢ SCREENING NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM ¢U každého odběru se provádí vyšetření přítomnosti nepravidelných protilátek přiměřeně citlivou metodou se zaměřením na záchyt klinicky významných protilátek, především anti-D. ¢Metoda: NAT (nepřímý antiglobulinový test) ¢Diagnostické erytrocyty: k vyšetření se mohou použít diagnostické erytrocyty ve směsi. ¢ ¢Identifikace nepravidelných protilátek proti erytrocytům: —V případě pozitivního výsledku screeningového vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům je vhodné provést identifikaci protilátky(-ek). —Použití transfuzního přípravku erytrocytů v případě zjištění nepravidelných protilátek proti erytrocytům záleží na klinickém významu zjištěné protilátky DĚKUJI ZA POZORNOST ¢