Zuzana Holubcová zholub@med.muni.cz PROPEDEUTIKA ASISTOVANÉ REPRODUKCE (podzim 2024) 4. Terminologie a organizace ART praxe Doporučený postup dle ČGPS ČLS 21.1.2021 Indikace ART - indikováno z párů, u kterých nedošlo k otěhotnění po 12 měsících pravidelného, nechráněného pohlavního styku (2-3. týdně!) - u žen nad 35 let je vzhledem na věkem podmíněný pokles plodnosti vhodné zahájit léčbu už po 6. měsících - rychlejší zahájení léčby doporučeno i při ➢ podezření/prokázání snížené plodnosti muže ➢ endometrióze ➢ oligo-amenorrhoe ➢ tuboperitoneálním faktoru sterility Vyšetření poruch plodnosti ❑ Anamnéza - vstupní konzultace páru rodinná a osobní zdravotní historie s ohledem na možné rizikové faktory neplodnosti: - brzká menopauza v rodině - vrozené vývojové vady v rodině - historie neplodnosti v rodině - předchozí těhotenství/poporodní komplikace - doba trvání poruch plodnosti - pravidelnost a délka menstruačního cyklu - bolestivost menstruace a pohlavního styku - chirurgické zákroky v dutině břišní - úrazy varlete nebo malé pánve - výskyt pohlavně přenosných chorob - prodělané urogenitální infekce - užívání léků a návykových látek - životní styl - věk partnerů - ... Vyšetření poruch plodnosti ❑ Diagnostika 1. vyšetření ovariálních funkcí a stanovení ovariální rezervy - hormonální profil: FSH + LH + estradiol (2.4. den cyklu), progesteron (odběr v druhé polovině cyklu), AMH, TSH, PRL, vitD,.. (kdykoli v cyklu) - ultrazvuk vaječníku a endometria 2. vyšetření andrologického faktoru - spermiogram (opakovaný s odstupem 3 měsíců) - případně hormonální profil (FSH, LH, testosteron, TSH, PRL) 3. vyšetření děložního faktoru (vrozené vývojové vady dělohy) - utrazvuk vaginální sondou, sonohysterografie, hysterosalpingorafie, diagnostická hysteroskopie 4. vyšetření tubárního a tuboperitoneálního faktoru - vyšetření průchodnosti vejcovodů (hysterosalpingografie, laparoskopie) - vyšetření přítomnosti periadnexiálních adhezí a endometriózy (laparoskopie, transvaginální hydrolaparoskopie) 5. genetické vyšetření páru - průkaz nosičství monogenní poruchy nebo strukturálních aberací → etiologie neplodnosti + indikace ke genetickému vyšetření embrya 6. vyšetření imunologického faktoru - až v případě 2 neúspěšných cyklů a při známé diagnóze poruchy imunity některého z partnerů 7. další vyšetření v rámci léčby v programu asistované reprodukce - např. trombofilní mutace, integrita DNA spermií, příprava receptivního endometria Vyšetření poruch plodnosti ❑ Základní rozvaha po obdržení výsledků vyšetření ANO NE Vše OK? věk ženy hormonální profil UZ vyšetření spermiogram anamnéza KONZERVATIVNÍ PŘÍSTUP: • Monitoring ovulace • Časovaný pohlavní styk • Farmakologická podpora ovulace • Gestagenní podpora implantace • Test průchodnosti vejcovodů ASISTOVANÁ REPRODUKCE (ASSISTED REPRODUCTION TECHNINOLOGY - ART) • Intrauterinní inseminace (IUI) • In vitro fertilizace • Hormonální stimulace Nejrychlejší cesta k dítěti komorbidity Test průchodnosti vejcovodů ❑ Hysterosalphingography - HSG - radiologická (RTG) procedura s použitím jódové kontrastní látky - zobrazení tvaru dutiny dělohy a (ne)průchodnosti vejcovodů - může odstranit malou blokádu vs. dočasné poškození sliznice? - často bolestivý zákrok, nutná dilatace čípku Test průchodnosti vejcovodů ❑ Hysterosalphingo Contrast Sonography - HyCoSy - sonografická (UZ) technika s použitím kontrastního solného roztoku nebo olejové emulze vytvářející pěnu („foam“, HyFoSy) - zobrazení tvaru dutiny dělohy a (ne)průchodnosti vejcovodů - zavedení katetru do dělohy pod UZ bez nutnosti fixovat čípek - novější, levnější, bezpečnější, stejná výpovědní schopnost Fyziologická ovulace • Monoovulace = v rámci měsíčního cyklu je pod vlivem hormonů hypotalamohypofyzární osy uvolněno z dominantního folikulu jedno zralé vajíčko (MII oocyt) Ovárium LH GnRH FSH ❖ Klomifen (p.o.) - selektivní nesteroidní modulátor estrogenových receptorů v hypotalamu - stimuluje uvolňování GnRH (↑FSH, LH) - dlouhý poločas, negativní vliv na sliznici - předepisován ženám s poruchami ovulace (anovulační/oligoovulační sterilita, např. PCOS) - riziko vícečetného těhotenství ❖ Letrozol (p.o.) - inhibitor aromatázy (blok syntézy estrogenů) - negativní zpětnou vazbou zvýšena produkce GnRH a tím FSH a LH - protinádorové léčivo,+ léčba gynekomastie - indukce ovulace experimentální, resp. „off-label“ - Nemá tak velký vliv na sliznici, družší ❖Bromokriptin (p.o.) - agonista dopaminu redukuje prolaktin - léčba hyperprolaktinemické amenorhei ❖Metformin (p.o.) - Antidiabetikum, léčba inzulinové rezistence (DM2) - Empiricky používáno pro stimulaci ovulace u žen s PCOS Farmakologická podpora ovulace Letrozole Androgens aromatase In vivo fertilizace • vnitřní oplození (teplota, pH, osmolarita, oxygence 2-5%, parakrinní signály..) • fyziologický filtr spermii • přežití spermií až 5-7 dní • fúze gamet v ampule vejcovodu • 6-7 dní sestup do dělohy • enzymatický hatching • implantace do endometria v sekreční fázi cyklu - úprava ejakulátu (promytí a zakoncentrování) v laboratoři a zavedení katetrem do dutiny děložní v době ovulace (dle UZ monitoringu/ovulačního testu) - bezbolestný výkon (ambulantně, bez anestezie) - nejjednodušší, nejlevnější a nejméně invazivní metoda asistované reprodukce (ART – assisted Reproduction Techniques) - nízká úspěšnost (max. 15% na 1 IUI) Intrauterinní inseminace - IUI - procedura, při níž jsou odebraná vajíčka a spermie jen krátce koinkubovány a společně laparoskopicky umístěny do vejcovodu - oplození i embryonální vývoj se odehrávají in vivo - historická metoda (1. „dítě ze zkumavky“ v ČSSR) Gamete intrafallopian transfer - GIFT Sperm + egg X Zygotic Intrafallopian Transfer (ZIFT) – do vejcovodu je umístěna zygota vzniklá in vitro In vitro fertilizace Ovariální hyperstimulace - indukce uvolnění více než jednoho oocytu během cyklu - monitoring rostoucích folikulů pomocí ultrazvuku = hormonální stimulace, superovulace, (medical) Controlled Ovarian Stimulation (COS) - podání exogenních hormonů - individualizované stimulační protokoly proteinové hormóny subkutánní injekce (s.c.) Ovariální hyperstimulace o GnRH agonisti/GnRH antagonisti suprese hytotalamo-hypofyzární osy o Gonadotropiny - FSH, LH stimulace růstu folikulů (resp. potlačení dominance a inhibice atrézie) - hMG - human menupausal gonadotropin - směs FSH+LH - rFSH – rekombinantní FSH - někdy +LH o hCG (místo fyziologického LH) indukce (trigger) oocytární maturace Ovariální hyperstimulace ❖ Stimulační protokoly Vývoj většího počtu folikulů Prevence spontánního peaku LH/FSH a spontánní ovulace Podpora luteální fáze Cíle: Ovariální hyperstimulace ❖ AGONISTICKÝ PROTOKOL - ireverzibilní agonista obsadí GnRH receptory v hypofýze, což vede k jejich downregulaci a tím ke snížení produkce FSH a LH z hypofýzy - iniciální stimulace GnRH receptorů má za následek rapidní zvýšení LH a FSH (tzv. flare-up effect) - blok hypofýzy dosažen po několika dnech, následuje suplementace gonadotropiny umožňující řízený růst většího množství folikulů - rovnoměrný růst folikulů, ale defektní luteální fáze - starší typ prokolu, známý také jako dlouhý protokol (cca 40 injekcí), dříve považován za zlatý standart - při stejné dávce gonadotropinů vyšší zisk oocytů než v antagonistickém protokolu Ovariální hyperstimulace ❖ ANTAGONISTICKÝ PROTOKOL - kompetetivní inhibitor dočasně obsadí GnRH receptory v hypofýze - okamžitý krátký efekt, spolehlivější blokace než agonista - někdy nerovnoměrný růst folikulů - luteální fáze není ovlivněna - někdy nedostatečná podpora růstu děložní sliznice - novější typ prokolu, známý také jako krátký protokol (cca 14 injekcí), v současnosti nejrozšířenější typ stimulace - suplementace gonadotropiny od dne 1 umožňuje řízený růst většího množství folikulů bez rizika flare-up effektu a spontánní ovulace Ovariální hyperstimulace - vliv mají - Věk - BMI (Body Mass Index) - AMH (AntiMüllerian Hormone) - ukazatel množství malých časných folikulů (= ovariální rezerva) - AFC (Antral Follicle Count) - počet ultrazvukem viditelných antralních folikulů - ovariální odpověď na stimulaci je individuální 8-12 vajíček (MII oocytů) >18 vajíček (MII oocytů) >4 vajíčka (MII oocyty) Kolik vajíček potřebujeme? Esteves et al Front Endocrinol 2019 - vyvíjeny (AI-)algoritmy pro volbu protokolů Nežádoucí reakce na stimulaci Nežádoucí reakce na stimulaci ❑Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS) - nejvýznamnější iatrogenní komplikace COS - příčinou vrozená tendence tvorby více oocytů (PCOS) nebo neadekvátní dávka FSH při stimulaci - UZ nález zvětšených ovárií a volné tekutiny - dušnost, bolest hlavy, nevolnost a závratě, bolest podbřišku, hypalbuminémie, hemokoncentrace, oligurie, riziko trombózy,.. Léčba: - analgetika, punkce ascitu, doplňování tekutin a bílkovin, prevence trombózy - výskyt snížen s nástupem antagonistických prokolů - z důvodu rizika OHSS se nedoporučuje agonistický protokol u žen s PCOS - malé dávky stimulujících hormónů - méně nežádoucích účinků hormónů - riziko neúspěšného odběru vajíček - zisk menšího množství vajíček na oplození - menší šance na transfer embrya a těhotenství - menší cena léčby Minimální ovariální stimulace = mild IVF/mini IVF Nativ IVF = natural cycle, drug-gree IVF - bez stimulujících hormónů* - u přilozeně ovulujících žen - ultrazvukem monitorovaný růst folikulu a odběr vajíčka PŘED ovulací - miniinvazivní, žádná nebo pouze lokální anestezie - bez nežádoucích účinku - vysoké riziko selhání odběru vajíček - zisk 1-2 vajíček na oplození - malá šance na transfer embrya a těhotenství - malá cena léčby *případně GnRH antagonista ke snížení endogenní hladiny LH k indukci ovulace = „modified natural IVF“ Odběr vajíček denudace - ultrazvukem naváděná transvaginální punkce ovarií - odběr oocytů z velkých antrálních preovulačních folikulů - obvykle 36-38 hodin po hCG injekci - zisk kumulů (cumulus-oocyte complexes - COCs) = egg retrieval, oocyte pick-up (OPU), egg aspiration, ovariální punkce denudace (stripping) = odstranění foliklárních buněk nezralé oocyty Oplodnitelné vajíčko = MII oocyty = s polárním tělískem (polar body - PB) - ambulantní výkon - nalačno, 5-20 min - v celkové anestezii „one-day surgery“ In vitro maturace (IVM) - odběr nezralých oocytů z malých antrálních folikulů a jejich prodloužená inkubace in vitro - meiotická maturace (GV→MI →MII) odebraných nezralých oocytů v kumulu (COC) za přítomnosti hormónů (FSH, hCG, AMH) - minimální nebo žádná ovariální stimulace - pro pacientky s rizikem OHSS nebo onkologických pacientek, u kterých není bezpečná hormonální stimulace In vitro maturace čas GV MI MII „Rescue in vitro maturation“ = maturace vývojově zpožděných oocytů („late-maturing oocytes“) - hormonální „priming“ in vivo - spontánní dokončení maturace in vitro v médiu bez hormonů - krátkodobé dozrávání plně vyrostlých (full-sized, fully-grown) nezralých oocytů z velkých antrálních folikulů - vývojově zpožděné oocyty jsou klinicky využitelné pokud před oplozením dosáhnou zralosti - kontrola zralosti = neinvazivní zobrazení MII vřeténka pomocí polarizační mikroskopie (PolarizedLight Microscopy - PLM) Polarizační mikroskopie - využíváno ve výzkumu (studium meiotické maturace in vitro) Příprava spermií - zbavení ejakulovaného vzorku seminální plazmy, která obsahuje dekapacitační faktory - nutno minimalizovat riziko poškození spermií - životaschopnost a pohyblivost spermií ve vzorku je časově omezená! 1) promytí 2) migrace (swim-up) 3) Hustotní gradient (density gradient centrifugation) 4) Mikrofluidní systémy 5) MACS Magnetic Activated Sperm Sorting - značení anexinu V magnetickou značkou → separace poškozených spermií Fertilizace in vitro „Konvenční“ IVF Intracytoplasmatická Spermatická Injekce (ICSI) koincubace COCs + spemie denudovaný MII oocyt + 1 spemie Fertilizace in vitro IMSI Intracytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection PICSI Physiological Intracytoplasmic Sperm Injection - selekce zraých spermií pro ICSI na základě vazby k hyaluonové kyselině Fertilizace in vitro - azospermie (aspsence spermií v ejakulátu) - mikrochirurgický odběr tkáně z nadvarlete nebo varlete - izolace spermií z bioptátu Kultivace embryí fertilizace kultivačníplastik den 0 den 1 den 2-3 den 3 den 4-5 den 5-6 preimplantační vývoj individuální kultivace kultivačnímédia jednostopá (single-step) média sekvenční (sequential) média CO2- MOPS/HEPESpufrovaná média 5 % 02 6 % CO2 37oC skupinová kultivace zygota 2 blastomery 4 blastomery morula kompaktovaná morula blastocysta Inkubační podmínky TLT – time-lapse technique TLM – time-lapse monitoring Asistovaný hatching - umělé vytvoření otvoru* v Zona Pellucida (ZP) ➢ mechanicky (jehlou) ➢ laserem ➢ chemicky - cílem usnadnění hatchingu embrya - benefit? * případně mechanické vytažení embrya ze ZP Kryoprezervace Mrazit lze: ▪ Embrya - pomalé mražení/vitrifikace ▪ Oocyty - vitrifikace ▪ Spermie - pomalé mražení ▪ Reprodukční tkáně - pomalé mražení/vitrifikace - hluboké zamražování při zachování životaschopnosti po rozmražení - dlouhodobé skladování v -196oC (tekutý dusík - LN2) - voda vytěsněna kryoprotektanty ➢ Zachování plodnosti (fertility preservation) ➢ Medical freezing – zdravotní důvody (onkologická diagnóza) ➢ Social freezing – důvody sociální (reprodukční stárnutí) ➢ Léčba neplodnosti (mražení nadbytečných embryí, freeze all) ➢ Banky gamet (sperm banky, egg banky) ➢ Genetické testování (čas pro analýzu DNA) Preimplantační genetické testování Biopsie pólového tělíska GENETICKÁ ANALÝZA Biopsie trofoektodermuBiopsie blastomer FISH aCGH NGS BIOPSIE Preimplantační genetické testování Preimplantační genetická diagnostika (PGD)Preimplantační genetický screening (PGS) Selekce embrya bez strukturních přestaveb/mutace → zabránění vzniku (resp. zdědění) nemoci Selekce embrya s nejvyším implatačním potenciálem → zkrácení doby k otěhotnění Příprava endometria Implantační okno (window of implantation-WOI) -optimální časové období pro implantaci embrya - analýza endometriálního faktoru prováděna při opakovaných implantačních selháních/časných potratech geneticky normálních embryí - biopsie endometria ➢ Expresní profil - DNA microrray (ERA) - micro-RNA (MIRA) ➢ Endometriální mikrobiom - kultivace (EMMA) - molekulární (ALICE) MIRA Transfer embryí - přenos embrya/embryí do dělohy - provádí se katetrem - naváděno ultrazvukem - tloušťka endometria 7-12mm - obvykle bez sedace nebo anestezie, 10 min klidový režim - single/double/triple...embryo transfer - preferován přenos pouze embrya! (ostatní případně zamraženy) - multiple-embryo transfer = riziko vícečetného těhotenství a případné fetoredukce - luteální podpory užívání progesteronu min. 14 dnů - přenašené embryo: - D3-D7 (obvykle D5-D6) - čerstvé (ET) nebo po rozmražení (FET/KET) Těhotenský test - imunologická detekce hCG - provádí se nejdříve 12. den po přenosu - opakovaně těhotenský test z moči (>30 IU) - biochemické těhotenství potvrzeno testem z krve (100 IU a víc) - nízké hodnoty značí rizko těhotenské ztráty, abnormálně vysoké hodnoty možný výskyt moly • při negativním výsledku vysazení léků • při pozitivním výsledku luteální podpora pokračuje Souvislost hCG a nauzea? Hodnocení úspěšnosti léčby ❖ Fertilization Rate (FR) = počet oplozených oocytů (2PN embrya D1)/počet oplozovaných oocytů ❖ Blastulation Rate (BR) = počet blastocyst /počet oplozovaných oocytů ❖ Utilization Rate (UR) = počet transferovaných + mražených embryí /počet oplozovaných oocytů ❖ Survival Rate (SR) = počet úspěšně rozmražených (a viabilních) embryí(nebo oocytů)/počet rozmražovaných embryí (nebo oocytů) ❖ Implantation Rate (IR) = počet přenášených embryí/počet implantovaných embryí ❖ Pregnancy Rate (PR) = počet přenosů/počet biochemických těhotenství (hCG detekce) ❖ Clinical Pregnancy Rate (CPR) = počet přenosů/počet klinických těhotenství (detekce gestačního váčku a/nebo akce srdeční plodu- ASP) ❖ Ongoing Clinical Pregnancy Rate (oCPR) = počet přenosů/počet pokračujících klinických těhotenství (těhotenství po 12.týdnu) ❖ Live Birth Rate (LBR) = počet přenosů/počet živě narozených dětí ❖ Cumulative Live Birth Rate (CLBR) = počet živě narozených dětí/počet léčebných cyklů Key performance indicators = KPIs Komplikace ART ➢ Ovarialní hyperstimulační syndrom (OHSS) ➢ Krvácení z pochvy po doběru oocytů ➢ Krvácení do dutiny břišní po odběru oocytů ➢ Mimoděložní gravidita ➢ Vícečetná těhotenství ➢ Těhotenské ztráty a potraty ➢ Předčasný porod ➢ Patologie těhotenství Pracovníci IVF kliniky ❖ Lekaři - odborné konzultace s pacientem + komunikace případu s dalšími odborníky (laboratoř, genetik, urolog, imunolog..) - obvykle hlavní lékař (+ sloužící) - LF + atestace v oboru gynekologie (vedoucí lékař navíc atestace z reprodukční medicíny +3-5 let praxe) Činnosti: - konzultace léčebné strategie a výsledku léčby - vedení případové dokumentace - sběr rodinné a osobní anamnézy - hodnocení hormonálního profilu - ultrazvukové vyšetření - návrh stimulačního režimu - předpis léků - folikulometrie - odběr oocytů (spolupráce s anesteziologem) - příprava endometria - transfer embrya - případně další sledování těhotenství Organizace IVF kliniky ❖ Sestry - SŠ, případně Bc VŠ - asistence lékaře (ultrazvuk, punkce, transfer) - odběr krve, vážení, měření tlaku,.. - vysvětlení předepsaných léků - péče o pacientku po anestezii - péče o dárkyně - administrativa a archivace lékařské dokumentace ❖ Koordinátoři/koordinátorky - nezdravotnické povolání - jazyková vybavenost + znalost IVF praxe) - laický „průvodce IVF léčbou“ pro pacienty ze zahraničí - komunikace neodborných otázek v cizích jazycích (např. organizace cesty/ubytování, zajištění léků) - psychická opora - dlouhodobé sledování (follow-up) případů „IVF turism“ Organizace IVF kliniky ❖ Andrologové - komunikace odběru ejakulátu s pacientem - vyšetření spermiogramu - příprava vzorku spermatu pro oplození - mražení/rozmražování spermií - vedení dokumentace o laboratorních výkonech - konzultace výsledku vyšetření s pacientem ❖ Embryologové - vyhledávání COC v punktátu - IVM - denudace oocytů - hodnocení morfologie a zralosti oocytů - oplozovací techniky (ICSI, IVF, IVM, PICSI, IMSI) - kultivace embryí a hodnocení vývoje - asistovaný hatching - výběr embryí k transferu přenosu a mražení - transfer embrya (nasátí do katetru) - mražení/rozmražování embryí/oocytů/reprodukčních tkání - biopsie pro účely genetického vyšetření - vedení dokumentace o laboratorních výkonech - konzultace s lékařem/pacientským párem Organizace IVF kliniky ❖ Andrologové + Embryologové - absolventi VŠ přírodovědného směru (PřF, LF, FaF, FVL,...) + AKK nebo akreditovaného VŠ programu (LF)* - dle dálky praxe junior/senior embryolog - povýšení ovlivňuje i ziskání zahraničních vzdělavacích certifikátů (např. ESHRE certifikát clinical embryologist/senior clinical embryologist) - atestace = specializační vzdělávání v oboru klinická embryologie - minimálně 1 pracovník laboratoře (obvykle vedoucí a nebo jeho zástupce) ❖ Embryologický laborant - embryolog/androlog v zácviku (ang. trainee) před absolvování kurzu AKK - případně SŠ s dlouholetou praxí - vykonává pomocné práce pod dozorem odborně způsobilé osoby* (např. příprava misek, roztoků, sterilizace, udržování skladových zásob, ukládání vzorků do kryobanky,...) *96/2004 Sb. Organizace IVF kliniky ❖ Lékařský genetik - lékař s atestací v oboru Lékařská genetika (min. 5 let praxe) - konzultace pacienta nebo dárce/dárkyně - osobní a rodinná anamnéza - hodnocení genetického vyšetření (genetika páru, PGT) ❖ Genetická laboratoř - odborní pracovníci absolventi VŠ přírodovědného směru + SŠ laboratorní technik - specializovaná genetická analýza (krev, biopsie) - in-house x společná laboratoř pro více klinik ❖ Urolog - lékař s atestací v oboru urologie - spolupracující ordinace nebo docházející lékař - řešení urologických problémů mužů (infekce, chirurgie) - mikrochirurgický odběr spermií ❖ Imunolog/imunologická laboratoř - spolupracující atestovaný lékař/laboratoř - diagnostika imunologických poruch plodnosti Organizace IVF kliniky ❖ Psycholog (příp. „fertility coach“) - Psychologická podpora pacientů (případně i zaměstnanců) - Interní zaměstanec nebo externí spolupráce ❖ Provozní oddělení - personalistika - účetnictví - ekonomie - administrativa - kontrola kvality - archivař - recepční - IT podpora,.. ❖ Logistické firmy (medical couriers) - vnitrostátní a mezinárodní trasport mražených vzorků (gamety/embrya) - v rámci kliniky/konsorcia neo externí Další „ IVF jobs“ Statistik Reprodukční imunolog Sales representative Kryobanky Fertility coach Veterinární embryolog Manager kvality PR & marketing Kontrolor SÚKL Popularizace vědy Vědecký konzultant Reprodukční genetik Vědec Monitor klinických studií