EMBRYOTECHNOLOGIE VE VETERINÁRNÍ PRAXI Doc. Ing. Jiří Šichtař, Ph.D. EmbryoLab s.r.o. Doc. Ing. Jiří Šichtař, Ph.D. ■ Česká zemědělská univerzita v Praze – Obor Reprodukční biotechnologie (Ing.) – Katedra veterinárních disciplín: reprodukce zvířat ■ management reprodukce, ultrasonografie, ovariální dynamika, IVPE ■ FarmVet s.r.o. – biotechnolog ■ EmbryoLab s.r.o. – In vitro produkce embryí skotu a koní (z živých dárkyň, vaječníků) Vývoj embrya ■ Vývoj lidského i zvířecího embrya má samozřejmě mnoho společných znaků ■ Existují však mezidruhové rozdíly ■ Nejprobádanější jsou embrya a plody hospodářských zvířat (skot, prasata, koně, velbloudi, …) ■ Ve veterinární praxi se nejčastěji pracuje s rannými vývojovými stádii embryí (drtivá většina moruly nebo blastocysty) ■ S tím jde ruku v ruce studium ovariální dynamiky – Synchronizace folikulárního vývoje – Manipulace s životností žlutého tělíska Tradiční průběh… živočich fertilita spermie v oviduktu myš 6 hod člověk 24-48 hod skot 28-50 hod ovce 30-48 hod kůň 144 hod netopýr 135 dní živočich doba mezi kopulací a dosažením oviduktu spermií skot 2-3 min prase 15 min myš 15 min pes min – několik hod ovce 6 min – 5 hod člověk 5 min – 7 hod (68 min) ■ spermie doputují z pochvy až do vejcovodu během několika minut ■ přežívají několik hodin (insem. dávka) nebo dní (nativní sperma) ■ pro uplatnění oplozovací schopnosti musí spermie projít kapacitací a akrozomální reakcí Vývoj nového jedince ■ 1. Časné embryo ◼ 2. Pozdní embryo ◼ 3. Plod Mezidruhové rozdíly v ranné fázi vývoje Kde najdeme embryo? ■ Skot – „Sedí“ ipsilaterálně k ovulujícímu vaječníku – V kraniální části děložního rohu – 13. den 3 mm, další 4 dny 250 mm ■ Prase – Rovnoměrná distribuce po celé děloze – 10. den 2 mm, 24-48 h 200, 16. den 800-1000 mm 8.-9. den 9. den Cca 16. den Kde najdeme embryo? ■ Klisna – Nedochází k elongaci – Migrace po celé děloze až do doby fixace ■ 16-18 dní po fertilizaci kapsula Velikost embrya a vztah k RDB Praktická veterinární embryologie ■ In vivo situace – Hospodářská zvířata: obrovský selekční tlak na reprodukční znaky ■ Proto se řeší hlavně ovariální aktivita a načasování inseminace – Vlivy zootechnické, zdravotní; výživa a management ■ Krávy, prasnice, (klisny) – Domácí mazlíčci ■ Psi, kočky, minoritně hlodavci, ptactvo ■ Embryo technologie naprosto minimálně využívány v chovu (klonování savců) ■ Spíše se řeší základní management samce a samice a využití inseminace Praktická veterinární embryologie ■ In vitro situace – Krávy, klisny, … ■ Základem je management získávání oocytů ■ In vitro zpracování je obecně stejné (IVF, IVC) s rozdíly v „hodinách“ a složení médií – Záchrana ohrožených druhů ■ Severní bílý nosorožec – Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research (Leibniz-IZW), Safari Park Dvůr Králové, Kenya Wildlife Service and Ol Pejeta Conservancy – Avantea (Itálie) – Zebry, antilopy, divoké kočky, … IETS: International Embryo Technology Society Používané embryotechnologie v praxi ■ In vivo – Embryotransfer ■ In vitro – IVPE ■ Genomická testace – Klonování – Genetické modifikace (SCNT) – Sexace embryí – Půlení embryí EMBRYOTRANSFER Historie ET Chirurgické získávání a transfer E u Bo Výběr dárkyně embryí ■ „ET neudělá z průměrné krávy dobrou, nebo z dobré lepší.“ ■ ET zasahuje do procesu reprodukce a šlechtění převážně vysokoužitkových jedinců ■ Cíl je produkce více potomstva od vynikajících rodičovských párů, zkrácení generačního intervalu a také např. tvorba a udržení zajímavých linií ■ Získaná embrya od vysokoužitkových krav lze přenést do jalovic s nižší plemennou hodnotou ■ Zvýšení příjmů za prodej embryí ■ Zisk embryí pro – Genomické testování – Půlení embryí Fáze embryotransferu ET harmonogram ■ Jednotlivé kroky stejně důležité!! ■ Konzervativní aplikační schéma – 8 injekcí během 4 dní 2 aplikace FSH místo 8 Příprava dárkyně ■ Předchází vlastní aplikaci „superovulačních“ hormonů (FSH a LH) ■ Důvod: aplikaci FSH a LH musíme načasovat do určité fáze folikulární vlny – bez velkých folikulů ■ Používají se analogy PGF2alfa – Rozmezí 1. a 2. aplikace: 14 dní, po druhé aplikaci kontrola říje – PROTOŽE NEMUSÍ NASTAT ZA 3 DNY!!! Superovulace ■ Některé krávy reagují dobře, jiné ne – Cca 80 % reaguje • Nechirurgický zákrok pod lokální anestezií • Použití sterilních, jednorázových pomůcek, embryonálních filtrů • Synteticky vyrobených vyplachovacích médií s přídavkem ATB • Atraumatický proces trvající co nejkratší dobu s co největším efektem vybavení embryí z rohů děložních • Ošetření dárkyně po odběru Výplach embryí z děložního rohu Výplach embryí z děložního rohu ■ 6,5-7 dní po „standind heat“ ■ Před vlastním výplachem vyšetření vaječníků ■ Dárkyně s 1 – 2 CL se zpravidla nevyplachují ■ Fixování dárkyně ■ Zavedení katetru krčkem dělohy do děložního rohu kde se fixuje nafouknutým latexovým balonkem Výplach systémem „dovnitř“ a „ven“ „Laboratorní čistota“ Třídění a klasifikace embryí ■ Dle IETS ■ Použití binokulární lupy se zvětšením 16x (vyhledávání) – 60x (hodnocení) ■ Neoplozené oocyty ■ Degenerovaná embrya ■ Embrya s různým podílem odloučených buněk (1,2,3,4) ■ Embrya v různém vývojovém stupni (4,5,6,7) ■ Ošetření povrchu zona pellucida opakovaným oplachem v trypsinu Konzervace embryí ■ Krátkodobé uchování při řízené teplotě – Holding medium (2-4! hodiny při pokojové teplotě) ■ Kryokonzervace hlubokým mražením na - 196°C dlouhodobá konzervace – 1,5M EthylenGlycol – 10% Glycerol ■ Vitrifikace ? Úspěšnost výplachu embryí ■ Asi 20 % dárkyň nereaguje na hormonální léčbu ■ Klíčový aspekt: superstimulační odpověď vaječníků dárkyně ■ Variabilita v odpovědi na superstimulaci studována z pohledu: – Vyrobená várka FSH a LH – Poměr FSH/LH – Délka trvání podávání FSH a LH – Načasování jednotlivých injekcí – Místo depozice hormonů – … ■ Zásadní je ale načasování aplikace z pohledu vývoje folikulární vlny Odstranění DF ■ Dva největší folikuly; nebo vše > 5 mm ■ Začátek hormonální stimulace 1-2 dny po ■ Lepší výsledek superovulace ■ Některé práce zmiňují podobné počty přenosuschopných embryí Počet antrálních folikulů (AFC) ■ Celkový počet antrálních folikulů na vaječníku v určitém čase ■ Sčítají se folikuly viditelné pomocí ultrazvuku na obou vaječnících – >2-3 mm ■ I když ovlivněné jednotlivcem, stádiem cyklu, kondicí a nutričním stavem – Opakovatelnost měření překvapivě vysoká: 0,8-0,9 ■ Řadí se mezi nejlepší prediktor superovulační odpovědi – Krávy s vyšším AFC produkují více embryí ■ Heritabilita – 0,3 u dojených krav – 0,25 u jalovic Výběr příjemkyně ■ Přenáší se do příjemkyň 7. den po říji! – Nutno odsledovat říji (pedometry + vizuální detekce) ■ Lepší připravit více příjemkyň ■ Kráva nebo jalovice? – Jalovice lepší zabřezávání X použitý býk a snadnost telení – Krávy jistější volba, druhá třetí laktace…? ■ Zdravotní stav – Ideálně: zdravá v průběhu předchozího půl roku ■ BCS – 2,5 – 3,5 (pokud mimo, pak se zabřezávání snižuje) ■ Pravidelné říjové cykly, vyšetření ultrazvukem (vaječníky ale i děloha!) Přenos embryí ■ Nechirurgický, atraumatický přenos embrya do děložního rohu s detekovaným CL ■ Přesnost, šetrnost, rychlost ■ U konzervovaných embryí to platí dvojnásob (rychlost- DT) ■ Kvalita embryí NE vždy přímo koresponduje s úspěšností zabřezávání ■ Přenos čerstvých a konzervovaných embryí stejné kvality cca – 10% zabřezlých Co ovlivňuje zabřezávání po přenosu? Zabřezávání po ET Čerstvá embrya (9023 ks) ■ 68,3 % Kryokonzervace (5297 ks) ■ 58,4 % Přenos embrya u přebíhalek? Orientační finanční náklady ET Dárkyně ■ Prostaglandiny: cca 300 ■ Superovulační hormony – Pluset: cca 9600 (1 dárkyně 4800) ■ Inseminace: 300 2x, 600 4x ■ Výplach: 1000 ■ Vyplachovací médium: 700 ■ Kryokonzervace embrya: 700 Příjemkyně ■ Prostaglandiny: cca 250 – 300 ■ Přenos embrya: 600 ceny bez DPH Průměrně se vypláchne 5 přenosuschopných embryí 1x dárkyně = 7400 5x příjemkyně = 4500 Orientační finanční náklady ET - zahraničí Champion Genetics Dolar CZK Dárkyně Synch. a superovulace 290 6960 Výplach 250 6000 Insem. 50 1200 Embryo 65x5 325 7800 21960 Příjemkyně (5x) Synchronizace 225 5400 Přenos 375 9000 14400 Hurkmans (NL) EUR CZK Dárkyně bez léků!!!! Výplach 295 7670 Kryo za 5 ks (<10 ks) 162,5 4225 11895 Příjemkyně (5x) bez léků!!! Přenos 275 6600 6600 LABORATORNÍ PRODUKCE EMBRYÍ IETS: International Embryo Technology Society In vitro produkce embryí ■ časově, finančně a technicky náročná procedura ■ zahrnuje několik na sebe navazujících kroků ■ výběr dárkyně ■ sedace a fixace ■ sběr oocytů ■ in vitro zrání ■ in vitro fertilizace ■ in vitro kultivace embryí ■ přenos nebo kryokonzervace Jakou dárkyni vybrat? ■ velmi důležitý výchozí bod – ne každá samice je vhodná dárkyně ■ nutno věnovat dostatečnou pozornost výběru – musí být zohledněno několik aspektů, které se posuzují jako celek ■ zdravotní stav ■ věk ■ velikost ■ temperament ■ reprodukční stav (jalovice, kráva po porodu, březí, acyklická,..) ■ reprodukční výkonnost (zabřezávání, porody) Jsme pořád na cestách… Zázemí pro provádění OPU ■ Fixace zvířete – trefujeme se jehlou do několikamilimetrových folikulů – prakticky neznatelný pohyb dárkyně pohybuje i s vaječníkem – bez fixační klece to opravdu nejde ■ Oocyty jsou velmi vnímavé na teplotní šok – zásadní je zachování 37°C po celou dobu manipulace – teplotní podmínky alespoň >15°C ■ Čistota „laboratoře“ v terénních podmínkách Ovum Pick Up ■ Ultrazvukový přístroj ■ Vakuová pumpa ■ Termoblok Na dárkyni záleží… ■ D38 – D30 – Čísla krav ■ V závorce – Počet opakování Kdy se dají získávat oocyty? ■ Jalovice (lepší v pubertě – přirozená hormonální stimulace oocytů) ■ Krávy: anestrické, acyklické, cyklující, březí (1. trimestr) ■ Obecně 1 x týdně (někdy i 2 x – v rozmezí 3-4 dní) ■ 1 x 14 dní (stimulace s FSH) – Přesto se dá získat více oocytů z 1 x týdně protokolu (!více návštěv, více fertilizačních a inkubačních cyklů…cena?) ■ Jatečný materiál – jednorázově desítky oocytů Co se děje s oocyty v laboratoři ■ aspirované oocyty neschopné oplození ■ nutno maturovat do MII fáze v in vitro podmínkách ■ převoz do laboratoře – snaha simulovat in vivo podmínky ■ In vitro zrání oocytů – Ne všechny oocyty jsou vhodné – Kontroluje se kvalita – Cca 24 hodin při 38°C v 5% CO2 Oplození a kultivace embryí ■ K dostání semeno býků vhodných k IVP – „Výhoda“: každý oocyt může být oplozen jiným býkem ■ Spermie + oocyty na 24 h při 38°C do CO2 ■ Kultivace embryí – 7 dní, 38°C, 90 % N2, 5 % CO2 Výtěžnost ■ OPU – 20-90 % – Cca 50 % ■ Zrání do M II – 60-80 % ■ Vývoj embrya – 60-80 % ■ Do blastocysty – 40-50 % Kryokonzervace = vitrifikace ■ Existuje několik možných postupů a metod ■ Oproti pomalému mražení vystavení vysokým koncentracím kryoprotektantu – Nutnost promytí po rozmražení (limitující prvek?) Kryokonzervace IVP embryí ■ 823 embryí, kryokonzervace ■ Přenos D7 nebo D8 po říji ■ 48% březost ■ IVP embrya – není rozdíl Výhody in vitro produkce embryí ■ Kratší interval mezi jednotlivými odběry (oocytů) – Oocyty lze získávat až do konce prvního trimestru březosti ■ Hormonální (ne)stimulace – možnost volby pro chovatele s menším či větším počtem dárkyň ■ Mladé jalovice – Alespoň 10 měsíců – Nicméně horší výsledky ■ Březí dárkyně ■ Široké využití spermatu TOP býků – Teoreticky zle oplodnit každý oocyt jednou ID (nebo její částí) Liší se in vitro a in vivo embrya? ■ ANO – Exprese genů, abnormality chromozomů, přežitelnost mražení, ultrastrukturální změny, metabolismus embryí, morfologie ■ V zásadě je na vině rozdíl mezi inkubačními podmínkami – Dynamický vývoj ve vejcovodu vs. Statické podmínky v inkubátoru ■ Z toho důvodu se věnuje optimalizaci inkubačních podmínek velké úsilí „Půlení“ embryí ■ 1982-2006: 2664 telat z půlených embryí ■ Průměrně 100 za rok ■ 15000-20000 ročně klasickým ET ■ 1988 půlených embryí = 50,2% březost – 100,4 % pro „embryo“ Určování pohlaví embryí ■ V počátcích slibná a vítaná technologie ■ Embryotransfer na komerční úrovní zvládnutý ■ Problém ale v terénních podmínkách ■ V dnešní době spíše použití sexovaného ejakulátu ■ Sexace embryí se nabízela i v ČR! Genotipizace IVP embryí…budoucnost! ■ Biopsie mikronožem – nejčastěji používaná v praxi ■ Biopsie aspirací ■ Aspirace jehlou ■ 30-60% březost – DT po kryo Embryotechnologie u koní Klasický ET Co hledáme? ■ Hodnocení dle IETS ■ Morula nebo blastocysta ■ O dalším osudu embrya rozhoduje stádium vývoje a tím pádem i velikost Proporcionální změny embrya dny po ovulaci počet E průměr (mm) rozpětí (mm) 6 121 0,208 0,132-0,756 7 144 0,406 0,136-1,460 8 142 1,132 0,120-3,980 9 41 2,220 0,730-4,520 průměrná velikost se zdvojnásobuje každý den!!!! IVPE – in vitro produkce embryí ■ časově, finančně a technicky náročná procedura – zahrnuje několik na sebe navazujících kroků ■ výběr dárkyně ■ sedace a fixace ■ sběr oocytů ■ in vitro zrání ■ in vitro fertilizace ■ in vitro kultivace embryí ■ přenos nebo kryokonzervace Klisny: aspirace = proplach ■ oocyt pevně přichycen ke stěně folikulu ■ proplach a seškrábnutí nezbytné (6 – 10x) ■ odlišná aparatura než u Bo ■ bez proplachu o 50-70% méně oocytů Bo Eq IVF – in vitro fertilizace ■ Komerčně se využívá POUZE metoda ICSI Milník pokořen… ■ Standardní IVF ■ U koní se nedařilo (proto ICSI) ■ Koncem roku 2022 se v USA zablýskalo na lepší časy… ■ 90 % fertilization rate ■ 74 % oplozených oocytů = blastocysta ■ 3 ET = 3 narozená hříbata ■ Evropa rok poté… A jedeme dál!! JSME TÝM! Ing. Ondřej Šimoník, Ph.D. Ing. Anna Boušová MVDr. Jana Drašnarová MVDr. Tomáš Haloun, Ph.D. Děkuji za pozornost!