Jméno a příjmení:



Číslo skupiny:



Studijní obor:



Základy kultivace buněk – cvičení (EMKB0311c)

Textové pole: Náplň cvičení: • Výměna média přisedlých buněk • Stanovení konfluence přisedlých
buněk, focení • Rozmrazení suspenzních buněk • Kultivace rozmrazených buněk • Počítání buněk •
Příprava skel pro fixaci buněk DEN 3
Teoretická příprava

Fáze růstu buněčné kultury:

A) statická fáze (lag): příprava na buněčné dělení

B) exponenciální fáze (log): intenzivní množení buněk do vyčerpání živin

C) stacionární fáze (plató): počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů

 D) fáze odumírání T (osa x) = čas L (osa y) = počet buněk v kultuře

Při kultivaci snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk), při přílišném nárůstu à
kontaktní inhibice – zastavení dělení – před dosažením plató fáze se kultura naředí a nasadí do
nových kultivačních nádob v takové hustotě, aby rostla opět exponenciálně.

Konfluence = stav, kdy je vytvořena souvislá vrstva buněk (monolayer), které se vzájemně dotýkají


DOUBLING TIME

Závisí na vstupní koncentraci buněk, výstupní koncentraci buněk a době kultivace. Vyjadřuje dobu,
za kterou se zdvojnásobí počet buněk. Udává nám informaci o rychlosti růstu.

https://www.doubling-time.com/compute.php

ÚKOL:

·         Výměna média přisedlých buněk.

·         Stanovení konfluence přisedlých buněk, focení.

·         Rozmrazení suspenzních buněk (obdoba dne 2).

·         Kultivace rozmrazených buněk.

·         Počítání buněk.

·         Příprava skel pro fixaci buněk.

Výměna média

Z misky s přisedlými buňkami je odpipetováno médium a je nahrazeno 2 ml čerstvého média (pokojová
teplota). Musí být minimalizována doba, po kterou buňky nejsou v médiu i doba, po kterou jsou mimo
inkubátor.

Rozmrazení suspenzních buněk (PBMC = mononukleárních buněk periferní krve)

1.      Je zkontrolováno zapnutí a nahřátí vodní lázně na 37 °C. V laminárním boxu je nachystáno
médium PB1 (pokojová teplota) a 15ml zkumavka pro promytí buněk. Centrifuga je nastavena na 300 g,
4 minuty, je zkontrolováno umístění správného rotoru a nástavců.

2.      Kryozkumavka s buňkami je vyhledána v kryobance a na ledu urychleně přenesena k vodní
lázni, kde je rozmrazena do doby, kdy je v ní malý kousek ledu. Voda z lázně se nesmí dostat
k závitu zkumavky (riziko kontaminace). Následuje přesun do laminárního boxu.

3.      Buňky jsou pipetou přesunuty z kryozkumavky do 15 ml zkumavky a POMALU doplněny 5 ml PB1
média. Poté jsou centrifugovány.

4.      Peleta je rozsuspendována v 1 ml média. 50 µl je odebráno do zkumavky na počítání množství
buněk. Mimo laminární box je přidáno 50 µl trypanové modři.

5.      Stanovení počtu buněk a viability pomocí automatického počítače buněk (Countess II).

6.      Nasazení 100 tis. buněk do 2 ml media na 1 jamku 6jamkové destičky.

7.      Kontrola přítomnosti buněk pod světelným mikroskopem.

8.      Spočítání stejného vzorku na Bürkerově komůrce.

PROVEĎ A ZAPIŠ VÝŠE UVEDENÉ LABORATORNÍ ÚKONY.