Jméno a příjmení:



Číslo skupiny:



Studijní obor:



Základy kultivace buněk – cvičení (EMKB0311c)

Textové pole: Náplň cvičení: • Sběr suspenzních buněk • 2D fixace • 3D fixace • Barvení jader DAPI
• Fluorescenční mikroskopie DEN 4

Teoretická příprava

2D fixace

1.      Centrifugace 4 min/300 g, slijeme supernatant.

2.      Resuspendujeme pomocí vortexu a za přidání KCl předehřátého na 37°C.

3.      Inkubace 15 min.

4.      Centrifugace 4 min/300 g, slijeme supernatant.

5.      Po kapkách přidáme roztok fixační směsi (kyselina octová/methanol 1:3) o teplotě -20 °C.

6.      Centrifugace 4 min/500 g, slijeme supernatant.

7.      3× opakujeme.

8.      Naneseme na podložní sklo vychlazené na -20 °C.


3D fixace (udržuje prostorovou strukturu vzorku)

1.      Centrifugace 4 min/300 g, slijeme supernatant.

2.      Resuspendujeme pomocí vortexu a za přidání PBS.

3.      Inkubace 1 min.

4.      Centrifugace 4 min/300 g, slijeme supernatant.

5.      2× opakujeme.

6.      Buňky rozsuspendujeme v malém množství PBS (zbylé po slití supernatantu) a nakapeme na
čistá odmaštěná podložní skla.

7.      Skla fixujeme v 4% paraformaldehydu v PBS po dobu 15 min.

8.      Propláchneme 3×4 min v PBS.

9.      Permeabilizace 5 min v 0,2% Tween a 5 min 0,2% Triton X v PBS.

10.  Propláchneme 2 min v PBS.

11.  Pokračujeme barvením.



FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE

Ve fluorescenční mikroskopii se využívá kratších vlnových délek v oblasti UV záření, kdy látka
absorbuje ultrafialové paprsky a emituje viditelné světlo delších vlnových délek, které je pak
pozorovatelné světelným mikroskopem. Dochází k ozáření atomu, kde za normálních okolností obíhají
elektrony kolem jádra ve vrstvách (orbitalech) s určitou energetickou hladinou. Při UV záření
elektrony absorbují energii a jsou vybuzeny (excitovány) do vyšší energetické hladiny. Elektrony
jsou na vyšší energetické hladině nestabilní a vracejí se zpět do základního stavu. Přesun
elektronu z vyšší energetické hladiny do nižší je doprovázen vyzářením fotonu

ÚKOL: PŘÍPRAVA MIKROSKOPICKÉHO PREPARÁTU, ZÁPIS VYHODNOCENÍ

Sběr suspenzních buněk, automatické počítání buněk a určení viability, 3D fixace suspenzních buněk,
včetně permeabilizace (viz výše).

1.      3D fixované buňky ponoříme do DAPI o koncentraci 1 µg/ml.

2.      5 minut inkubujeme ve tmě.

3.      Propláchneme 2 min v PBS.

4.      Naneseme krycí sklo a zalepíme.

ÚKOL: PROVEĎ A ZAPIŠ VÝŠE UVEDENÉ LABORATORNÍ ÚKONY