Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p1 Fyziologie oocytu, ovulace, kapacitace spermií, oplození Marie Nováková Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p2 Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p3 Fyziologie oocytu Metabolismus oocytu Mitochondrie ER Centrioly Transzonální výběžky Membránové transportéry Receptory Chromatin a transkripce Translace a sekreční aktivita Cytoskelet a buněčné dělení Zdroj: is.muni.cz Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p4 Metabolismus oocytu – lidský oocyt je tzv. alecitální OOCYT • Neobsahuje energetické zásoby (glykogen, lipidy) • Zanedbatelná role b-oxidace • Nízká aktivita fosfofruktokinázy + nutnost aktivně transportovat glc (kumulární bb, GLUT) FOLIKULÁRNÍ BUŇKY • Vysoká aktivita fosfofruktokinázy – konverze glc na pyruvát, laktát a NADPH • Transport do oocytu (transzonální výběžky, difuze přes zonu a perivitelinní prostor) • Citrátový cyklus – pyruvát a laktát metabolizovány, oxidativní fosforylace, tvorba ATP Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p5 Mitochondrie oocytu – klíčová úloha v oocytu (100 tis. ve zralém oocytu, tj. 1:50, 200 tis. kopií mtDNA) ENERGETIKA • Efektivní konverze energie (1 glc = 18x více ATP než při glykolýze) • Vznik ROS – nebezpečí poškození mitochondriální DNA STRUKTURA • Mitochondrie oocytu vs. mitochondrie somatické • Menší počet kopií mtDNA (1-2) • Kulaté, malé • Přesuny v rámci oocytu podle energetických potřeb díky cytoskeletu • V různých fázích vývoje oocytu různá pozice a kumulace mitochondrií • Shlukování s ER na konci procesu maturace oocytu Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p6 METABOLISMUS KALCIA • Vápníkové kanály na mt membráně – vnitřní (MCU) i vnější (VDAC) • OSCILACE koncentrace kalcia POŠKOZENÍ MITOCHONDRIÍ • Malý mitochondriální genom + vysoká koncentrace ROS • Přirozená eliminace poškozených mitochondrií Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p7 Endoplazmatické retikulum Pouze hladké ER, zásobárna kalcia, transportéry jako v jiných buňkách, při dozrávání se shlukuje s mitochondriemi Inaktivace mateřských centriolů ??? Přítomny pouze do pachytenního stadia meiózy I. ??? Význam Transzonální výběžky Kumulární bb. – zona pellucida – oolema (ev. cytoplazma) Opora v cytoskeletu oocytu Gap junctions + zonula adherens Preovulační nárůst počtu – postovulační pokles FUNKČNÍ JEDNOTKA: folikulární bb.(gap junctions) + oocyt (transzonální výběžky) Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p8 Membránové transportéry • Konexiny a panexiny (gap junctions) • Kanál HVCN1 (voltage-gated protonový kanál, basifikace cytoplazmy oocytu) • Transportéry monokarbonových kyselin (pyruvát+laktát, MCT1 a MCT2) • Vápníkové kanály a výměníky (TRPM7, TRPV3, NCLX, Ca-T kanály, IP3-R) • ATP-dependentní K+ kanál (regulace MP a Ca2+ i) Receptory oocytu • Receptory neurotropních faktorů (NGF, neurotropiny, atd. - embryonální vývoj ovarií, folikulů, vitalita oocytů, exprese FSH-R..) • Receptory endokanabinoidů (CB2R – zrání oocytu?) Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p9 Chromatin a transkripce • Období klidu (minimální disperze chromatinu, minimální transkripce) vs. období dozrávání oocytu (maximální disperze chromatinu, intenzivní transkripce) • Po ukončení růstu – kondenzace chromatinu (lem okolo jadérka), minimalizace transkripce • Různé geny více nebo naopak méně transkribovány v porovnání se somatickými bb. • Maternální RNA slouží k translaci ve stadiu oocytu, po oplození jako spící RNA, odstraněna po aktivaci embryonálního genomu Translace a sekreční aktivita • Během růstu oocytu – transkripce i translace, intenzivní i během časné embryogeneze • mRNA v komplexech s různými proteiny (RBP) Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p10 Cytoskelet a buněčné dělení • Významná úloha aktinových mikrofilament (mikroklky, migrace mitochondrií, zajištění tvaru oocytu, meiotické dělicí vřeténko…) • Mikrotubuly v dělicím vřeténku Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p11 Ovulace Nábor folikulů Vznik Graafova folikulu Diferenciace kumulárních buněk Mechanismy spuštění ovulace Aktivace signálních drah Prostaglandiny Matrix kumulu Rekonstrukce folikulu Vlastní ovulace Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p12 Převzato z: Daan and Fauser, Maturitas 82 (2015) 257–265 Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p13 Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce VZNIK GRAAFOVA FOLIKULU • Urychlení růstu (cca 6 dní před ovulací) • Komplexní mezibuněčná komunikace • Vznik komplexu KUMULUS-OOCYT • Folikulární tekutina – filtrace plazmy • Oocyt (profáze I meiotického dělení) + 3 linie somatických bb • Diferenciace folikulárních bb. během růstu: 1) granulózové bb. (v kontaktu s lamina basalis) 2) kumulární bb. (v kontaktu s oocytem) kumulus (2 tis.bb.) membrana granulosa theca folliculi interna ovariální stroma theca folliculi externa PARAKRINIE Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p14 TŘI PODMÍNKY OVULACE 1. Linie kumulárních bb. odlišena od granulózových bb. + vzájemná komunikace s oocytem 2. Peak LH – mnohočetné kaskády v granulózových bb. – paralelní zrání oocytu a exprese ovulačních genů 3. Granulózové bb. a kumulární bb. spustí procesy rozrušení apexu folikulu a uvolnění komplexu ZRALÝ KUMULUS-OOCYT Zdroj: danielokiror.com Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p15 Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p16 DOMINANTNÍ FOLIKUL 1. Vysoká hladina estrogenů z nejrychleji rostoucího folikulu 2. Negativní zpětná vazba na produkci FSH z adenohypofýzy 3. Pokles sekrece FSH 4. „Dominantní folikul“ roste dále díky své vnitřní pozitivní zpětné vazbě 5. Ostatní folikuly rostou pomaleji a postupně podléhají atrezii Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p17 DIFERENCIACE KUMULÁRNÍCH BUNĚK • Původ somatický – folikulární bb. preantrálních folikulů • Přímý kontakt s oocytem • Udržují zástavu meiózy, reagují odlišně na endokrinní regulační vlivy • Diferenciaci granulózových buněk na kumulární přímo řídí oocyt • Morfogeny (GDF9 a BMP15) – řízení exprese genů v kumulárních bb. • Potlačení exprese LH-R • Stimulace exprese genů pro řadu enzymů (glykolýza, syntéza cholesterolu) • Vtok cAMP z kumulárních bb. do oocytu udržuje zástavu meiózy + cGMP blokuje fosfodiesterázu 3A GAP JUNCTIONS (connexin-37) Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p18 MECHANISMY SPUŠTĚNÍ OVULACE • Minimální velikost Graafova folikulu – 15 mm • Pozitivní zpětná vazba estradiolu, pokles hladiny těsně před ovulací (down-regulace receptorů, inhibice syntézy progesteronem) • Postovulační pokles hladiny estradiolu • Vrchol LH – pokračování meiózy, luteinizace granulózových bb., syntéza progesteronu AKTIVACE SIGNÁLNÍCH DRAH • Aktivace řady signálních drah (PKA, ERK1/2 kináza, PKC, Ras) vede k zrání a ruptuře folikulu • Aktivace adenylátcyklázy (LH-R) uzavře gap junctions – resumpce meiózy • Aktivace ERK1/2 kináz - ruptura folikulu (peak LH, PG-R, progesteron, syntéza enzymů…) Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p19 PROSTAGLANDINY • Peak LH – aktivace prostaglandin-syntázy2 (cyklooxygenáza 2) v granulózových bb. • Majoritně produkován prostaglandin E2 (EP2R) • Indukce ruptury folikulu a angiogeneze MATRIX KUMULU • Expanze matrix díky produkci proteinů, proteoglykanů a glykosaminoglukanů • Hlavní složkou expandovaného kumulu je hyaluronan • Regulováno parakrinně z granulózových bb. (kumulární bb. nemají LH-R) • Klíčová úloha v postovulační fázi – adheze kumulu k řasinkovému epitelu vejcovodu - TRANSPORT Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p20 MECHANISMUS OVULACE LH PROGESTERON Hyperémie folikulu Sekrece prostaglandinů Oslabení stěny folikulu PROTEOLYTICKÉ ENZYMY (kolagenázy z theca externa) Degenerace stigmatu Ruptura folikulu Uvolnění vajíčka Transudace plazmy do folikulu Zduření folikulu Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p21 REKONSTRUKCE FOLIKULU • Před samotnou ovulací – kompletní přestavba folikulu • Digesce stěny proteázami (PG-R aktivuje gen ADAMTS-1 kódující metaloproteinázu) • Angiogeneze v okolí folikulu – VEGF (sekrece v odpovědi na peak LH) • Vazokonstrikce – endoteliny • Zánětu podobné procesy – PG-R (infiltrace stěny folikulu imunitními bb.) VLASTNÍ OVULACE • Pokles cAMP v oocytu, resumpce meiózy, jaderné a cytoplazmatické dozrání oocytu – plně KOMPETENTNÍ OOCYT • Exprese dalších proteáz (mmP-2, mmP-9, mmP-14, MMP-19, katepsin, kallikrein, kolagenáza typ I) • Imunitní bb. (makrofágy, neutrofily) – elastáza • Zvýšení intrafolikulárního tlaku – OVULACE (cumulus oophorus) Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p22 10-12 hod Převzato a upraveno z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce A = LH pík B = ovulace FSH estradiol progesteron LH 34-36 hod 12 hod Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p23 Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p23 Oplození Kapacitace spermií Průběh oplození: 1. Spermie ve vejcovodu 2. Akrosomová reakce 3. Interakce spermie s oocytem 4. Aktivace oocytu 5. Ochrana proti polyspermii 6. Děje před sjednocením genomů 7. Sjednocení parentálních genomů 8. Přínos gamet embryuZdroj: targetzink.com Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p24 KAPACITACE SPERMIÍ (intraindividuálně stabilní, interindividuálně odlišná) • „Kapacitace spermií je transformační proces zahrnující funkční změny spermií začínající odstraněním a/nebo redistribucí molekul, které spermie získaly v seminální plasmě, pokračuje během průchodu ženským pohlavním traktem a je završen, když spermie získají schopnost prodělat akrosomální reakci v odpověď na ligandy zona pellucida.“ Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce • Probíhá jinak in vivo a in vitro KAPACITOVANÉ SPERMIE JSOU SCHOPNÉ CHEMOTAXE A CHEMOREPULSE • Inicializace kapacitace - periovulační cervikální hlen (90 sec, složení populace spermií a jejich membrány) • Zvýšení obsahu cholesterolu po kontaktu spermie se seminální plazmou brání kapacitaci a akrosomální reakci vs. pokles obsahu cholesterolu díky albuminu a LTP-1 v sekretu vejcovodu • Zvýšení membránové fluidity + laterální pohyb cholesterolu • V lipidových raftech cholesterol zůstává! • Phospholipid scrambling díky zvýšení intracelulární koncentrace HCO3 - (aktivace PAK – odplavení cholesterolu albuminem) Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p25 • Změny pH a koncentrace HCO3 - v různých částech mužského i ženského reprodukčního systému • pH: 6,8 (epididymis) – 4,4 (vagina) – 7 (děloha) • V reprodukčním traktu ženy je vyšší pH, vyšší koncentrace HCO3 - a vyšší koncentrace albuminu • Alkalinizace intracelulárního prostoru spermie – Hv1 (pH 6,94 ejakulované vs. 7,08 kapacitované spermie) • Klíčová úloha PKA v regulaci pH spermie (CFTR, SLC26A3, …A6, …A8) • Klíčová úloha vápníkových iontů v kapacitaci: součást řady signálních drah, rovnováha v koncentraci vně a uvnitř spermie, Ca2+-kalmodulin spouští hyperaktivovanou motilitu spermií • Vápníkové transportéry ve spermii: membránová Ca2+-ATP-áza a Na+/K+-výměník, CatSper vápníkový kanál v bičíku (aktivován progesteronem, aktivace dráhy cAMP/PAK), IP3R v krčku a akrosomu, RYA v krčku, SERCA2 v akrosomu a středním oddílu, vápníková pumpa SPCA v akrosomu. • ROS v kapacitaci spermií: aktivace adenylcyklázy, oxidace cholesterolu (a vyplavení z membrány), aktivace tyrosinfosfatázové aktivity, oxidace thiolových skupin proteinů, atd. Nejreaktivnější peroxynitrit a peroxid vodíku. Spermie si „vyrábí“ ROS samy anebo ROS pochází z leukocytů. Spermie jsou na ROS velmi citlivé (malý objem a přitom velké množství cytoplazmy) a mohou být poškozeny - apoptóza. Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p26 • Kapacitace je spuštěna společným působením koncentrace HCO3 -, Ca2+, ROS a změn ve složení membrány • Alkalizace intracelulárního prostředí různými mechanismy • cAMP, aktivovaná PKA • AKAP (A-kinázu kotvící proteiny, typ 3 a 4) zabezpečí zacílení fosforylace • Exchange proteins (EPAC1 a 2) v hlavičce spermie, cAMP • Fosforylace tyrosinu (ovlivnění intracelulárního pH) • Chaperon Hsp90 a jeho kochaperon Cdc37 regulují aktivitu další kináz (ERK1/2 a p38) • Membránový potenciál je -36mV u nekapacitované a -60mV u kapacitované lidské spermie (hromadění cAMP) • Hyperaktivní pohyb spermií – vyšší rychlost, větší amplituda vlnění, kruhový pohyb, ovlivněn membránovým potenciálem, intracelulárním pH a intracelulární koncentrací Ca2+ (Ksper, Hv1, CatSper). Nejprve aktivace kanálu Dsper/TRPV4 vede k depolarizaci membrány spermie, což podpoří funkci Hv1 a CatSper a vede k hyperaktivaci spermie. • Časový průběh kapacitace: spermie kapacitují „po skupinách“, což vede ke konstantní frakci kapacitovaných spermií, spermie nevyužité pro oplození podléhají apoptóze a jsou fagocytovány ☺ Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p27 PRŮBĚH OPLOZENÍ • Interakce mezi kapacitovanou spermií a komplexem kumulus-oocyt (humorálně aktivní – progesteron, prostaglandiny, cytokiny – chemotaxe a chemorepulze) • In vivo ve vejcovodu • Úzké časové okno pro oplození!!! (vitalita spermie max. 140 hodin, ideální doba pro oplození do 48 hodin od ejakulace, spermie s rychlým progresivním pohybem + vitalita oocytu) • Spermie ve vejcovodu – očištěné, selektované, kapacitované, vázané na řasinkový epitel vejcovodů • Akrosomová reakce – aktivace vazbou spermie na receptory v zona pellucida a současně vazbou progesteronu na jeho receptor na spermii (předtím akrosom stabilizován vazbou přes CD46 na integrin); zahrnuje 1) zvýšení intracelulární koncentrace Ca2+ 2) aktivace fosfolipázy C 3) produkce IP3/DAG 4) uvolnění gelsolinu 5) depolymerizace vláknitého F-aktinu 6) monomerní G-aktin 7) IP3 otevře Ca2+ vnější akrosomové membrány, a sníží tak obsah Ca2+ v akrosomu 8) aktivace Ca2+ dependentního Ca2+ kanálu v cytoplazmatické membráně zvýší obsah Ca2+ ve spermii 9) to spolu s DAG aktivuje PKC a vede k akrosomové reakci Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p28 • Interakce spermie s oocytem je umožněna depolymerací F-aktinu, kdy splyne vnější akrosomová membrána s cytoplasmatickou membránou za vzniku pórů a rozpuštění membrán – odhalí vnitřní akrosomovou membránu, kde je vázán enzym akrozin a proteiny umožňující penetraci oocytu • Pevnou vazbu spermie na zona pellucida zajišťuje řada různých ligandů, hlavně ZP2 (druhově specifické!) • Průnik spermie zajištěn mechanicky, působením akrosomových proteáz a vazbou na ZP2 • Vazbu spermie na oolemu umožňuje řada receptorů na ní (JUNO), na které se váže celá řada proteinů přítomných v membráně spermie (např. IZUMO1) • Po splynutí membrán oocytu a spermie je spermie internalizována – aktivace oocytu • Hlavička spermie – mužské prvojádro, centrioly – do další generace bb. embrya, mitochondrie aktivně zničeny, zbytky spermie autofagovány • V oplozovaném oocytu osciluje intracelulární koncentrace Ca2+ (kompartmentově i časově, 1x za 30-60 min) díky CICR (IP3 a RYR v ER), klíčovou roli hraje fosfolipáza C zeta asociovaná k vnitřní akrosomové membráně, ale také cGMP, NADP, NO Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p29 • Blok proti polyspermii zajišťuje především kortikální reakce, i když také Zn ionty mohou distančně blokovat spermie blízké oocytu. • Kortikální granula (proteázy, glykosidázy, lektiny, Zn ionty, aj) pod cytoplazmatickou membránou zvyšují mechanickou pevnost zona pellucida a odstraňují receptory pro spermie v zoně – 10 sekund po oplození, později štěpení ZP2 ovastacinem, deglykosylace ZP3, zesítění glykanů lektiny a inkorporace Zn do zony • Původní membrána tvoří měchýřky pokryté receptorem JUNO, je nahrazena membránou z kortikálních granul, měchýřky vážou nadbytečné spermie • Děje před sjednocením parentálních genomů zahrnují vývoj prvojader (6-14 hodin od splynutí gamet, reprogramování genomu a S-fáze cca 7-9 hodin od splynutí gamet), reprogramování genomu (aktivní demethylace DNA v mužském prvojádře, pasivní v ženském, cca 4 hodiny pro splynutí gamet), centrioly ze spermie (oocyt je nemá!), sjednocení parentálních genomů (prvojádra na periferii zygoty, migrace do centra – dynein, mikrotubuly, komplexy jaderných pólů, centrosom, poté rozpad jaderných obalů, mitóza). Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p30 mikrotubuly dyneinový motor jaderný pór a chromosom centrosom chromosom připojený na komplex jaderného póru Převzato z: Pavel Trávník, Klinická fyziologie lidské reprodukce Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p31 Zdroj: cs.wikipedia.org • Přínos gamet embryu je asymetrický: spermie – haploidní počet autochromosomů, X nebo Y chromosom, centrioly, proteiny, RNA, aktivuje přeměnu oocytu v zygotu a zygoty v časné embryo, oocyt - haploidní počet autochromosomů a X chromosom, cytoplasma, zásoba ribonukleových kyselin pro první tři dny vývoje, enzymy, mitochondrie, organely. Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p32 Fyziologie těhotenství a porodu Marie Nováková Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p33 HORMONÁLNÍ PROFIL GRAVIDITY I. II. III. trimestr hCG P E PROL RX inhibice kontrakcí myometria hCS OX 0 10 20 30 40 týdnů gestace STH TSH ACTH INS KORT ALD T4 PTH Placentární – maternální – fetální zdroj Corpus luteum graviditatis, placenta luteinizační a luteotropní účinky těhotenský růstový hormon příprava laktace indukce porodu (8. týden!!!) hCG, E, P, hCSE, P, relaxin Klinická reprodukční fyziologie, EMRF0711p34 INDUKCE PORODU P > E E > P maternální placentární fetální CHOLESTEROL HT ACTH OXYTOCIN DHEA PREGNENOLON CRH EP KORTIZOL PG 100x oxyt.rec. Conexin (gap junctions) Tight junctions kolagenáza aferentace z mechanoreceptorů Nedostatečnost fetálního respiračního systému