Bílkoviny Mgr. Michaela Pospíšilová Funkce bílkovin •Enzymy •Strukturální –kolagen, keratin •Kontraktilní –aktin, myosin •Protilátky –imunoglobuliny •Transportní –albumin, transferin,… •Proteohormony –inzulín • http://images.slideplayer.cz/9/2592707/slides/slide_6.jpg http://static.akvarista.cz/web/imgs/clanky/tmp/0006906.jpg Udržování osmotického tlaku (z 75 % podíl albuminu), hemokoagulace a fibrinolýza, ochrana před volnými radikály, zábrana jejich tvorby... Bílkoviny •Analyzovaný materiál: sérum, plasma, moč, likvor • •Mezi základní biochemická vyšetření patří stanovení celkové bílkoviny. •Hlavní skupiny bílkovin tvoří albumin (asi 50%) a globuliny •Kromě albuminu a CRP jsou to glykoproteiny (10-25% obsah sacharidů) • –Albumin •tvořen převážně v játrech •udržuje stabilní onkotický tlak (podílí se na něm ze 75%) •významné transportní funkce • –Globuliny •různé typy proteinů •dělí se na alfa, beta a gamaglobuliny •syntetizovány také v játrech, nebo jsou tvořeny imunitním systémem Celková bílkovina •Speciální preanalytické požadavky: nejsou • •Referenční rozmezí: S/P 64-83 g/l • moč 0-0,15 g/l • likvor 0,15-0,45 g/l • Celková bílkovina •poloha při odběru: vstoje -> přesun tekutiny z intravazálního prostoru do intersticia -> zakoncentrování proteinů v krvi – konc. se zvyšuje o 10 – 15 % =>pacient by měl 15 min. před odběrem sedět. U ležících pacientů hodnoty o cca 10 % nižší •zvýšená svalová aktivita -> zvýšení koncentrace až o 12 % •expozice vysoké teplotě ->zvětšení plazmatického objemu a snížení glomerulární filtrace -> celkové proteiny mohou poklesnout až o 10 % •dehydratace vede ke zvýšeným koncentracím •není nutný odběr nalačno •delší stažení paže (nad 3 min) při odběru -> falešné zvýšení až o 10 % •nižší hodnoty - děti, v graviditě (vlivem hemodiluce) •v séru jsou hodnoty CB nižší, v plazmě jsou koncentrace vyšší - odpovídá koncentraci fibrinogenu: o 2,5 g/l - 4,6 g/l • Celková bílkovina - stanovení •Sérum: –Reakce s biuretovým činidlem –Kjeldahlova metoda •Likvor, moč: –Fotometrické metody –Turbidimetrické metody –Další metody: •Metoda s kyselinou sulfosalicylovou •Metody založené na schopnosti proteinů vázat barvivo Celková bílkovina •Metody stanovení: • •Referenční i rutinní metoda (pro CB v séru): reakce s biuretovým činidlem • •Certifikovaný referenční materiál: NIST/SRM 927a (pro CB v séru) • A test tube containing a clear violet solution Fotometrické metody •Metoda s biuretovým činidlem (sérum): • • alkalické •protein + Cu 2+ ----------® Cu- protein complex • prostředí • • • • •Komplex vhodný k fotometrickému stanovení při 540 – 550 nm • •Detekční limit: kolem 2 g/l • •Biuretová reagencie dále obsahuje: • - tartarát sodno-draselný - ke komplexaci měďnatých iontů a zabránění vysrážení hydroxidu měďnatého • - jodid draselný - antioxidant - zabraňuje autoredukci mědi • •Aminokyseliny a dipeptidy nereagují - malé peptidy dávají růžové zbarvení, ale vzhledem k jejich nízké koncentraci v séru je jejich příspěvek nevýznamný • •Interference: Hemolýza (hemoglobin reaguje jako protein), lipémie vadí až při vysokých koncentracích • Fotometrické metody •Metody využívající vazbu proteinu na barvivo: - Coomassie blue, Pyrogallová červeň • - stanovení v moči a likvoru • • • • • Nevýhody: •nedostatečná stabilita činidla •nerovnoměrná schopnost vazby na barvivo pro různé typy bílkovin •falešné snížení koncentrace globulinů • http://data.p-lab.cz/img_big/S0287.JPG https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/12/Coomassie_Brilliant_Blue_R-250.svg/2000px -Coomassie_Brilliant_Blue_R-250.svg.png Turbidimetrické metody •Stanovení s benzethonium chloridem (moč, likvor): •Koncentrace celkové bílkoviny o dva řády nižší •Využívají se citlivější metody • •Doporučená metoda •Celková bílkovina reaguje s benzethonium chloridem za vzniku zákalu, který se měří turbidimetricky při 505 nm •Reakce probíhá v alkalickém prostředí v přítomnosti EDTA, který denaturuje bílkovinu a eliminuje interferenci hořečnatých iontů •Výhoda metody - podobná reaktivita činidla s albuminem • a gama globuliny • - peptidy s krátkým řetězcem neinterferují •Interference: CSF – vadí hemolýza, U – přítomnost solí •Mez detekce: 0,04 g/l Kekulé, skeletal formula of benzethonium chloride Turbidimetrické metody •Metoda využívající precipitace bílkovin s kyselinou trichloroctovou nebo sulfosalicylovou: •vykazuje nestabilitu nebo flokulaci precipitátu a také rozdíly v chování činidla k jednotlivým bílkovinám ve směsi •je nezbytně nutné nepoužívat kalibrátor na bázi albuminu, ale zahrnující spektrum bílkovin tak, jak se vyskytují v moči • Další metody •Metoda s kyselinou sulfosalicylovou: • jako doplňující zkumavkový test pro semikvantitativní stanovení bílkoviny při chemické analýze moče pomocí diagnostických proužků, které zachycují pouze albumin a nikoliv lehké řetězce • •Metody založeny na schopnosti proteinů vázat • barvivo: např. amidočerň, kyselou violeť • Využívají se zejména k barvení po elektroforetickém • rozdělení • • • Další metody •Kjeldahlova metoda: • •Historicky nejstarší metoda ke stanovení celkové bílkoviny •Po mineralizaci vzorku varem s kyselinou sírovou se dusík ze vzorku převede na amoniak, který zůstane vázán ve formě síranu amonného •Alkalizací účinkem hydroxidu se ze síranu amoniak uvolní a stanoví se titračně •V krvi jsou přítomny i dusíkaté látky nebílkovinného původu – je proto za potřebí po stanovení celkového dusíku vysrážet bílkoviny např. kys. trichloroctovou a v supernatantu stanovit také dusík •Dusík bílkovin pak bude rozdílem mezi dusíkem celkovým a nebílkovinným •Nedá se automatizovat, tudíž se v laboratořích klinické biochemie nepoužívá •Má význam při definování referenčních materiálů pro biuretovu metodu Albumin •Analyzovaný materiál: sérum, plasma, moč, likvor •Speciální preanalytické požadavky: nejsou •Referenční metoda: není •CRM: ERM DA 470 •Referenční rozmezí: S/P 34-48 g/l • moč 0-0,03 g/l • likvor 0,12-0,3 g/l • •Albumin v likvoru = vždy z krve, v CNS se netvoří (syntéza v játrech, do mozku se dostává přes hematolikvorovou bariéru => slouží k hodnocení funkčního stavu hematolikvorové bariéry) • • Albumin - stanovení •Sérum: –Stanovení s bromkresolovou zelení (BCG) –Stanovení s bromkresolovým purpurem (BCP) •Moč: –Imunoturbidimetrie –Imunonefelometrie •Likvor: –Imunonefelometrie • Albumin v séru •Ve slabě kyselém prostředí se albumin chová jako kation •Stanovení založeno na reakci s aniontovým barvivem většinou se skupinou – SO3H •Mez detekce: 2 g/l •Využívají se barviva, která se specificky vážou na albumin v přítomnosti ostatních sérových bílkovin •Značný posun absorpčního maxima komplexu albumin-barvivo proti absorpčnímu maximu samotného barviva Stanovení albuminu s bromkresolovou zelení (BCG) v séru a plasmě •Žlutozelený roztok bromkrezolové zeleně tvoří při pH 4,2 s albuminem zelenomodrý komplex s maximem 630 nm •Vazba albuminu na barvivo není zcela specifická - barvivo částečně reaguje také s a1- a a2-globuliny, ale pomaleji než s albuminem •Nespecifickou vazbu je možno minimalizovat odečítáním absorbance krátce (30s) po smíchání séra s barvivem •Jedná se o nejčastěji používanou metodu • http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/f/fe/Bromkresolov%C3%A1_zele%C5%88.png/300px-Bromkresolov%C3 %A1_zele%C5%88.png Stanovení albuminu s bromkresolovým purpurem (BCP) v séru a plasmě •Žlutý roztok bromkrezolového purpuru tvoří při pH 5,2 za přítomnosti povrchově aktivních látek s albuminem zelený komplex s maximem 600 nm •Metoda je vysoce specifická http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/5/5b/Bromkresolov%C3%BD_purpur.png/300px-Bromkresolov%C3%BD_ purpur.png Albumin v moči •Podobně jako při stanovení CB se jedná o mnohem nižší koncentrace než v séru • •Imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie •Se specifickou protilátkou proti lidskému albuminu tvoří albumin precipitát imunokomplexu •Vzniklý zákal se měří imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky •Reakčním prostředím je pufr s obsahem polyethylenglykolu (PEG; podporuje tvorbu suspenze) • •Mez detekce: 2-10 mg/l Albumin v moči •Mikroalbuminurie •Albumin v moči – důležitý marker poukazující na generalizovanou cévní hyperpermeabilitu •Fyziologická albuminurie je < 20 µg/min •Denně – až 30 mg albuminu vylučováno močí •Běžné proužky na stanovení proteinurie – až od 150 mg/l •30-150 mg/l = mikroalbuminurie •Vyšetřování buď v jednorázové ranní moči, pak výsledek vyjádřen v přepočtu na kreatinin •Nebo ve sbírané moči za časovou jednotku (doporučený odběr přes noc, nemocný v klidu, délka sběrného období min. 6 hod, s přesností na minuty) Stanovení dalších proteinů •Další proteiny přítomné v séru v nízkých koncentracích se převážně stanovují imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky (mg/l) •Pro stanovení v séru a moči postačuje imunoturbidimetrie, pro stanovení v likvoru je pro svou citlivost vhodná imunonefelometrie • •Chemiluminiscence (µg/l = ng/ml) • •ELISA (výzkumné parametry) CRP v séru a plasmě •C-reaktivní protein - nejčastěji stanovovaný velmi citlivý protein akutní fáze •Jeho koncentrace se prudce zvedá při zánětu •Není specifický •Imunoturbidimetrické stanovení zesílené na částicích (particle-enhanced) – antigen (CRP) reaguje a protilátkou proti CRP, která je navázaná na latexových mikročásticích. Vzniklý komplex – precipitát • se stanoví turbidimetricky •Mez stanovitelnosti kolem 1 mg/l Imunoglobuliny v séru (plazmě) a likvoru •Imunoglobuliny G, A a M •v séru či plasmě - stanovují se imunoturbidimetricky (imunonefelometricky) •v likvoru pouze imunonefelometricky (dostatečná citlivost, hodnoty v mg/l) • •Referenční meze v S/P pro dospělé: Referenční meze v CSF pro dospělé: • •IgG – 7 - 16 g/l IgG – 10-40 mg/l •IgA – 0,7 - 4,0 g/l IgA - ≤ 1,1 mg/l •IgM – 0,4 - 2,3 g/l IgM - ≤ 5,0 mg/l • •Imunoturbidimetrické i turbidimetrické metody jsou založeny na měření zákalu vytvořeného interakcí měřeného analytu (Ag) se specifickou protilátkou (Ab) •Vznik precipitátu se projevuje vzrůstem zákalu reakční směsi •U imunoturbidimetrických metod reakce často probíhá v přítomnosti PEG, který zvyšuje rychlost reakce, citlivost a výrazně omezuje možnost rozpouštění precipitátu v přítomnosti nadbytku antigenu •Hlavní vlnová délka pro měření absorbance - 340 nm Imunoglobuliny •Analýza jednotlivých polyklonálních imunoglobinů zahrnuje stanovení koncentrace směsi proteinů různé velikosti s podobnou konstantní částí a různou variabilní částí • •Protilátky a referenční kalibrátory jsou postaveny proti normálním lidským sérům složeným ze směsi imunoglobulinových podtříd • •Stanovení jednotlivých polyklonálních imunoglobinů - spolehlivé https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/31/Mono-und-Polymere.svg/200px-Mono-und-Poly mere.svg.png Imunoglobuliny D a E •Imunoglobuliny D a E v séru • •Vyžadují ke stanovení ještě citlivější analytické metody •Obvykle se využívají imunoanalyzátory na principu chemiluminiscence Imunoglobuliny •Zjišťování nadměrné tvorby antigenně strukturálně i funkčně homogenního Ig nebo jeho fragmentu -> monoklonální imunoglobulin (mIg; produkován jedním klonem proliferujících plazmatických buněk) •Stanovení monoklonálních imunoglobulinů – problematické •Monoklonální imunoglobiny mají pouze některé z determinant, s kterými protilátky v antiséru reagují •Dochází k rychlé tvorbě precipitátu, pro vysoké koncentrace monoklonálních imunoglobinů (paraproteinů) jsou výsledky získané zejména po naředění nadhodnoceny •Pro absolutní koncentraci paraproteinů - elektroforéza a denzitometrie •Pro rozlišení jednotlivých tříd mIg (IgG, IgA, IgM, IgD a IgE, λ a κ) - imunofixace • Volné lehké řetězce k a l • •Imunoglobulinové molekuly: • - dva těžké řetězce (a,d,e,g,m, které určují Ig třídu) • - dva identické lehké řetězce • - každý lehký řetězec je kovalentně navázán na těžký řetězec • - těžké řetězce jsou kovalentně spojeny v stěžejní část • •Stanovení volných lehkých řetězců (FLC, free light chains): •- používají se protilátky namířené proti antigenním strukturám dostupným jen na lehkých řetězcích (nikoli na lehkých řetězcích navázaných na těžké řetězce, tj. kompletní molekuly Ig) • •U zdravých jedinců je koncentrace volných lehkých řetězců minimální •Absolutní hodnota FLC souvisí s glomerulární filtrací, vychýlení z normálního poměru koncentrace volných lehkých řetězců signalizuje patologickou klonální tvorbu jednoho typu •V séru je poměr volných kappa ku lambda 0,625 zatímco poměr vázaných volných lehkých řetězců je 2 (volné kappa převážně monomery, volné lambda jako dimery) • •Ke stanovení se používá imunonefelometrická případně imunoturbidimetrická metoda http://www.bmb.leeds.ac.uk/teaching/icu3/selfdir/immunol/igg.gif Další proteiny - sérum transferin 2,0 - 3,6 g/l imunoturbidimetrie ↑= nedostatek železa v organismu ( ↓= přebytek železa v organismu porucha proteosyntézy v játrech, akutní zátěž organismu prealbumin 0,2 - 0,4 g/l imunoturbidimetrie ↓ porucha proteosyntézy v játrech u těžkých hepatopatií nebo proteinové malnutrice haptoglobin 2,0 - 3,6 g/l imunoturbidimetrie ↑= akutní stavy ↓ = poruchy proteosyntézy v játrech, intravaskulární hemolýza orosomukoid 0,25 - 4,0 g/l imunoturbidimetrie ↑ = akutní stavy ↓ = porucha proteosyntézy v játrech Alfa2-makroglobulin 2 – 3,5 g/l imunoturbidimetrie ↑= nefrotický syndrom, chronické hepatopatie, v dětském věku ↓ = akutní pankreatitida alfa 1- antitrypsin 0,9 - 2,0 g/l imunoturbidimetrie ↑= akutní záněty a akutní závažné stavy, těhotenství ↓= těžké hepatopatie, dědičný defekt tvorby API ceruloplasmin 0,22 - 0,6 g/l imunonefelometrie ↑= postupný nárůst v těhotenství ↓= genetická porucha způsobující nedostatečnou tvorbu ceruloplasminu, (Wilsonova choroba) C3 0,9 - 1,8 g/l imunoturbidimetrie ↑ = akutní zátěž ↓= tvorba imunokomplexů (např. autoimunitní choroby) C4 0,1 - 0,4 g/l imunoturbidimetrie Cystatin C 0,63–1,44 mg/l imunoturbidimetrie ↑fce ledvin CRP 0,0 – 5,0 mg/l imunoturbidimetrie ↑= akutní zánět, akutní stavy prokalcitonin 0,0 – 0,5 ug/l chemiluminiscence ↑ sepse transferin 0,2 – 1,2 mg/l imunonefelometrie pro hodnocení proteinurie Alfa2-makroglobulin < 7 mg/g kreatininu imunonefelometrie Alfa 1 -mikroglobulon 2 – 12 mg/l imunonefelometrie kvalitativní analýza elektroforéza Další proteiny - moč transferin 7-22 mg/l imunonefelometrie Zánětlivý marker prealbumin 12- 27 mg/l imunonefelometrie t -protein ELISA diagnostika demence x Alzheimerovi choroby Beta -amyloid ELISA S-100 chemiluminiscence Tumormarker CEA chemiluminiscence B2-mikroglobulin imunoturbidimetrie Volné lehké řetězce kappa imunoturbidimetrie, imunonefelometrie RS ↑ Další proteiny - CSF Elektroforéza bílkovin krevního séra - Gelová elektroforéza – SPE •Každá zóna obsahuje jeden a více sérových proteinů. • •Nejvíce anodicky putuje albumin, následují α1-globuliny α2-globuliny, β1-globuliny, β2-globuliny a gamaglobuliny. • •Šířka proteinového bandu frakce závisí na počtu proteinů, které jsou ve frakci přítomny. Gelová elektroforéza – SPE + imunofixace •Elektroforetické dělení vzorku probíhá simultánně v šesti stopách. Po elektroforéze – první stopa (ELP) slouží jako referenční. Zbývajících 5 stop je použito k nanesení specifických antisér – proti těžkým řetězcům (G, A, M) a anti-kappa a anti-lambda volným a vázaným lehkým řetězcům. • •Imunofixační proužky jsou porovnány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku – odpovídající proužek by měl mít stejnou migrační pozici. Provádí se ve čtyřech krocích: 1.Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu. 2. 2. Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou – příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním roztokem. 3. Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen-protilátka zůstává v gelové matrix. 4. Precipitované proteiny jsou vizualizovány obarvením. •Elektrofoforeogram bílkovin moče je podobný rozdělení bílkovin v séru - intenzita frakcí závisí na filtrační schopnosti ledvin. •K analýze používáme zahuštěné nebo nezahuštěné vzorky moče. • Poskytuje kvalitativní pohled na proteinurii, užitečné informace při diagnostikování selhání ledvin, identifikace hlavních bílkovin v moči pomáhá přesně určit typ poškození ledvin (tubulární, glomerulární nebo smíšený) • Dále pomáhá při identifikaci monoklonálních gamapatií (Bence Jonesovy bílkoviny) Elektroforéza/izoelektrofokuzace mozkomíšního moku •Izoelektrická fokuzace: •metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu, následovanou immunofixací s anti-Ig G antisérem. •Vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány. •Citlivost metody dovoluje analýzu CSF bez předchozího zahušťování • •Test se provádí ve dvou stupních: 1.Izoelektrofokusace na agarózovém gelu k rozdělení proteinů ve vzorcích CSF a séra. 2.Imunofixace s anti-IgG antisérem značeným enzymem (peroxidázou) určeným k detekci IgG oligoklonálních proužků 3.Srovnává se přítomnost či nepřítomnost identických pruhů IgG v séru a moku; počet a lokalizace proužků nemá diferenciálně diagnostický význam. •K potvrzení intratékální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní mok paralelně ve stejných koncentracích, aby byl demonstrován rozdíl v distribuci IgG. • • Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a vyjadřují heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější antigeny, s nimiž se jedinec setkal. • •Intratékálně produkované protilátky se vyznačují pouze omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což se při izoelektrické fokusaci projeví jako izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra. 260px-Oligoklon%C3%A1ln%C3%AD_p%C3%A1sy •Základní typy : •Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález; •Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy); •Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (např. chronická infekce CNS); •Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v séru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS; •Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) 260px-Oligoklon%C3%A1ln%C3%AD_p%C3%A1sy