Bílkoviny krevní plazmy Význam plazmatických bílkovin • •transport opředevším látek nerozpustných ve vodě, případně i léků oAlbumin – Ca , Mg, Zn,thyroxin, bilirubin, léky oPrealbumin – thyroxin oTransferin –Fe oApoproteiny - lipidy • • •obrana proti infekci oImunoglobuliny, komplement Význam plazmatických bílkovin •udržování onkotického tlaku oalbumin •hemokoagulace a fibrinolýza okoagulační faktory a faktory zajišťující rozpouštění trombu •enzymy ocholinesteráza a ceruloplazmin •inhibitory proteáz obránící napadení poškozených a zanícených tkání proteolytickými enzymy o1-antitrypsin, a1-antichymotrypsin a a2-makroglobulin • ochrana před volnými radikály, resp. zábrana jejich tvorby (albumin, ceruloplazmin, haptoglobin, hemopexin) •acidobazická rovnováha • Albumin (35-53g/l) •Hlavní plazmatická bílkovina,biologický poločas 20 dní •tvoří se v játrech, molekulová hmotnost 68 000, • ze 75% se podílí na onkotickém tlaku plazmy •transportní bílkovina pro nekonjugovaný bilirubin, hormony štítné žlázy, vápník, hořčík, zinek a jiné minerály. Váže i některé léky. •Součást extracelulárního antioxidačního systému v ochraně proti volným radikálům. • •¯ = snížená syntéza u těžké hepatopatie či proteinové malnutrice, zvýšený katabolizmus u akutních zánětů a nádorů • Zvýšené ztráty ledvinami (nefrotický syndrom), do GIT, kůží •Fyziologicky v těhotenství –roste objem cirkulující tekutiny Popáleninový úraz •Poškození kůže teplem, chemickými látkami, elektrickým proudem, zářením • Popáleniny 1.stupně – zčervenání • 2.stupně – puchýře • 3.stupně –nekróza • 4.stupně - zuhelnatění • • • • •Popáleninová reakce •Při postižení více jek 15% tělesného povrchu • Popáleninová nemoc •Ztráty bílkovin poškozením kožním krytem (zničení anebo poškození kapilár, zvýšená kapilární permeabilita) o oZtráta tekutin, solí, bílkovin do interstitia oHypovolémie, hypoxie tkání oPoškození orgánů – ledviny, srdce oInfekční komplikace oHypovolemický šok • Nefrotický syndrom •Soubor klinických a laboratorních nálezů vznikající v důsledku velké proteinurie (více jak 2g/m²) •Následná hypoalbuminemie (pod 30g/l) •Otoky •Hypercholesterolémie • • •Zvýšená permeabilita glomerulární membrány • selektivní proteinurie – albumin • neselektivní - i bílkoviny s vyšší molekulární hmotností ( IgG) • •Etiopatogeneze: • Primární: genetické faktory, imunitní, infekční • Sekundární: diabetická glomeruloskleróza, lupusová • nefritis, amyloidóza ledvin Nefrotický syndrom (Celkový cholesterol – 8 -15 mmol/) Malnutrice(podvýživa) •Nepoměr mezi množstvím živin, které tělo potřebuje a které přijímá •Nedostatečný příjem, zvýšené ztráty • •Dětství, dospívání, těhotenství • •Akutní stavy – chirurgické výkony, infekce, úrazy • •Chronická onemocnění postihujících zažívací trakt, např. céliakie, cystická fibróza, nedostatečnost pankreatu nebo perniciózní anemie. Crohnova choroba •Tzv. idiopatický střevní zánět •Postihuje jakoukoliv část trávicí trubice •Dg. oKlinické příznaky (bolesti břicha, průjmy) oLaboratorní nález (zánětlivé markery, hypoalbuminémie, sideropenická anémie) oEndoskopie (kolonoskopie, gastroskopie,enteroskopie) Reakce akutní fáze •Nespecifická obranná reakce na poškození organismu akutním zánětem • •Projevy: horečka, leukocytóza, hormonální odpověď, změna koncentrace tzv. bílkovin akutní fáze • •Proteiny akutní fáze oTvorba v jaterním parenchymu (de novo)- po vyplavení cytokinů IL 6, TNF oRegulátory zánětlivého procesu oMediátory biologických reakcí oInhibitory vázající proteolytické enzymy o o o o o CRP •Indikace: oVčasná diagnostika bakteriálních infekcí oSledování průběhu léčby oOdlišení bakteriální a virové etiologie o oNovorozenci, kojenci – syntéza snížená o o oAdekvátní syntéza u imunosuprimovaných pacientů o oPozdní reakce na SIRS oNepřispívá k odlišení SIRS a sepse • • Prokalcitonin •Struktura identická s prohormonem kalcitoninu • •PCT, který je produkován při zánětu nedochází ke konverzi na kalcitonin (sekrece –játra,plíce, ledviny, tenké střevo) • •Tvorba PCT při zánětu úzce svázána s bakteriálním endotoxinem a s prozánětlivými cytokiny • •Vzestup PCT zejména u bakteriálních infekcí, při sepsi Prokalcitonin Ref.meze do 0,5 ug/l Chronický zánět 0,5-1ug/l Lokalizovaná bakteriální infekce 0,5-2ug/l SIRS 5-10ug/l SEPSE nad 10,20 ug/l Alfa 1 antitrypsin • • •Ochrana tkání před destrukčním působením proteáz (elastázy, kolagenázy) uvolňovaných při zánětlivé reakci z neutrofilů. • • = akutní záněty a akutní závažné stavy, těhotenství • •¯ = těžké hepatopatie • dědičný defekt tvorby • • Deficit alfa1-antitrypsinu •Geneticky podmíněná choroba •Postižení plic, jater •Manifestace v novorozeneckém věku nebo i později • Deficit alfa1-antitrypsinu Kasuistika •Žena 21 let •Od dětství léčena pro astma bronchiale •Od 18 let kouřila 10 cigaret denně • •Prodělala virózu s postižením dýchacích cest, vysoké horečky •Zjištěn vzestup jaterních enzymů ALT 8,42 ukat/l, AST 5,25ukat/l - přijata na interní odd. spádové nemocnice •Byla vyloučena infekční etiologie onemocnění i obstrukce žlučových cest • • Deficit alfa1-antitrypsinu Kasuistika •Ultrazvukové vyšetření – lehce zvětšená játra •Biopsie jater – hepatopatie při deficitu alfa1 antitrypsinu •DNA analýza mutací – fenotyp Pi ZZ •Alfa1-antitrypsin 0,35 g/l (0,9-2,0 g/l) • •Léčba- parenterální výživa, klidový režim, vitamíny doporučeno zanechat kouření •Pacientka je dále sledována, epizody zánětu vedou ke zvýšené syntéze AAT •Vyšetřena matka a sestra – u obou prokázán fenotyp PiMZ (hraniční hladina alfa1 –antitrypsinu) • Transferin •Jaterní b1-globulin, molekulová hmotnost 76 500, může vázat dva atomy železa (Fe3+), transportní bílkovina pro železo • • = nedostatek železa v organismu (při malnutrici nedojde ke zvýšení); • •¯ porucha proteosyntézy v játrech, akutní zátěž organismu • • •Bezsacharidový transferin – transferin se sníženým podílem cukerné složky (carbohydrate-deficient transferin, CDT) Ref.meze 2,0-3,6 g/l Ref.meze 2,0-3,6 g/l •Snížené množství Fe brzdí produkci hemoglobinu oSnížená hladina hemoglobinu,hematokritu,mikrocytóza oSnížená hladina Fe, zvýšená hladina transferinu, zvýšená hladina solubilních transferinových receptorů, snížený ferritin • •Klinické příznaky oÚnava , slabost, menší fyzická výkonnost, bolesti hlavy, závratě oPokročilé formy ragády ústních koutků, glositidy, vypadávání vlasů.. • •Diagnostika oKompletní vyšetření krevního obrazu oFe, transferin, ferritin, s-transferinové receptory • • • o • Sideropenie Anémie chronických chorob • Tarnay Martin 970630/5598 28.2.2019 Ref.meze 0,3-2,0 g/l g/l Hemolytická anémie •Dítě, 8 měsíců, několik týdnů větší únava a ospalost •Pro bledost a únavu vyšetřen krevní obraz •Výsledky – hemoglobin 44g/l •Odeslána k hospitalizaci • •Dif. dg – hemoblastóza • hemolytická anémie •Vyšetření kostní dřeně •bez nálezu maligních buněk •Antierytrocytární protilátky pozitivní o Ceruloplazmin • •Hlavní transportní protein mědi (8 atomů mědi) •Redukovaná forma Cp představuje 1/3 antioxidační aktivity séra •Mobilizuje a oxiduje Fe2+ na Fe3+ s následnou inkorporací do transferinu • •Vzestup koncentrace těhotenství • •Pokles koncentrace – Wilsonova choroba • Kasuistika Wilsonova choroba •2 sestry – 6,11 let •Sledovány v dětské nemocnici pro hepatopatii (zvýšení jaterních testů) •Vyloučeny infekční příčiny (hepatida A,B), stav po mononukleóze? • •Stanovení ceruloplazminu • •U obou hladina pod mezí detekce •Zvýšené vylučování mědi v moči • image.png Wilsonova choroba jaterní selhání • •Dívka 17 let •Dlouhodobě více unavená •Zvýšené teploty, zvracela, zežloutla • •Vyšetřena v nemocnici v Novém Městě •Odeslána pro podezření na hemolytickou anémii image.png 38 Imunoglobuliny • Sekreční produkty diferencovaných plazmatických buněk • • Složení 2 těžké(H) a 2lehké řetězce(L) • Typy lehkých řetězců kappa,lambda • Třída (izotyp) IgG,A,M,D,E • Část konstantní, část variabilní • • Polyklonální imunoglobuliny • různé idiotypy • • Monoklonální imunoglobulin • produkt jednoho klonu plazmatických buněk • stejný izotyp a idiotyp • molekula stejných fyzikálních i chemických vlastností • 4c6e40ea8b9d0 Všechny imunoglobulinové molekuly se skládají ze dvou identických těžkých řetězců gama, alfa,mí, delta, epsilon a dvou identických lehkých řetězců kappa nebo lambda. Každý z řetězců má konstantní část a část variabilní, která se účastní rozpoznání a vazbě antigenu. Imunoglobuliny jsou sysntetizovány a secernovány plazmatickými buňkami.Za fyziologického stavu jsou v séru přítomny polyklonální imunoglobuliny , je přítomno až 10 na 11 různých typů variabilních oblastí protilátek. Monoklonální imunoglobulin je produkt jednoho klonu plazmatických buněk.Pokud dojde k maligní přeměně plazmocytu, většinou je zachována schopnost secernovat protilátky, kteréjsou pak monoklonální. Maligní chování tohoto klonu se projeví tím, že infiltruje kostní dřeň vyhubí fyziologické plazmocyty, v krvi jsou polyklonální protilátky nahrazeny obvykle nefuknkčími monoklonálními imunoglobuliny. 39 Monoklonální gamapatie •Maligní monoklonální gamapatie o oMnohočetný myelom oMéně časté formy myelomu oMaligní lymfoproliferativní onemocnění oAmyloidóza • •Monoklonální gamapatie neznámého významu (MGUS) obrázek-06 Monoklonální gamapatie představují velkou skupinu lymforpoliferativích onemocnění B-lymfoidní řady v kostní dřeni jsou maligní nebo potenciálně maligní. Ve většině případů jsou provázeny syntézou a sekrecí monoklonální imunoglobulinu nebo jeho strukturní částí. Dělí se na dvě velké skupiny.Monoklonální gamapatie nejasného významu se považuje nález přítomnosti monoklonálního imunoglobulinu bez přítomnosti známek maligního onemocnění.V současné době se považuje za první fáyi mnohočetného myelomu. Medián doby do rozvoje MM je asi 10 let. 40 Laboratorní metody pro průkaz monoklonálního imunoglobulinu • •Elektroforéza séra a moče • •Elektroforéza s následnou imunofixací v séru a v moči • •Stanovení volných lehkých řetězců v séru • • Souprava hydragel je určena pro elektroforézu bílkovin krevního séra a moče. Separace bílkovin probíhá na alkalicky pufrovaných agarózovém gelu o konc. 8 g/l, pH 8,5. Při tomto pH nesou všechny hlavní proteiny krevní plazmy negativní náboj, jsou nanášeny katodicky a pohybují s směoem k anodě. Při těchto podmínkách migrace dojde k rozdělení bílkovin krevního séra do 6 frakcí. 41 Průkaz monoklonálního proteinu ELFO sérum a moč Úlohou laboratoře je identifikovat monoklonální protein při diagnostice MG. Mohoklonálním proteinem rozumíme kompletní molekulu imunoglobulinu nebo její fragmenty. Pro vyhledávání kompletní molekuly slouží desítky let klasická elektroforéza bílkovinv séru. My provádíme elektroforézu bílkovin na agaróze, používáme diagnostický set Hydrogel 30 od firmy SEBIA, beta zóna se dělí na beta1 a beta2 zónu.Mez detekce dle našich zkušeností je 500-2000mg podle pohyblivosti monoklonální komponenty.Moč zahušťujeme centrifugací 40x v zahušťovacích zkumavkách Vivaspin.Mez detekce dle našcich zkušeností je 10-40 mg) 42 UCB=1,76 g/l UCB=0,08 g/l UCB=0,22g/l UCB=0,79 g/l Elektroforéza sérum,moč Elektrofoforeogram bílkovin moče je podobný rozdělení bílkovin v séru - intenzita frakcí závisí na filtrační schopnosti ledvin. K zakoncentrování vzorku moče používáme koncentrátory vivaspin od fyrmy santorius. Tyto zkumavky obsahují speciální membránu vyrobenou z polyethersulfonátu, s cut off hodnotou 5 kDa. Všechny vzorky moče zahušťujeme 40x. Centrifgace při 4000 ot. Po dobu 20min.(2,5 ml na 50 ul) 43 Elektroforéza s následnou imunofixací v séru a v moči Proteiny separované elektroforézou na alkalicky pufrovaných agarózových gelech jsou inkubovány se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům Ig G, Ig A, Ig M a lehkým volným i vázaným kappa a lambda řetězcům. Po odstranění nezreagovaných bílkovin jsou precipitáty obarveny kyselou violetí. Elektroforeogramy se hodnotí vizuálně a pátrá se po přítomnosti monoklonálních bílkovin. Pro typizaci monoklonálního imunoglobulinu a screening v nízkých koncentracích slouží ELFO s následnou imunofixací. Používáme soupravu též firmy Sebia. Mez detekce je 150-500 mg 44 Elektroforéza s následnou imunofixací v séru a v moči-pentavalentní antisérum Pro screening paraproteinu používáme tzv. screeningovou imunofixaci, která se provádí za použití pentavalentního antiséra, kdy v jedné dráze jsou protilátky proti těžkým řetězců G,A,M a volným i celkovým kappa a lambda. Mez detekce uvádí výrobce 340 mg/l. Free light chains •Set FreeLite firmy BindingSite •Analyzer IMMAGE 800 (Beckman Coulter) imunoturbidimetrie (NIPIA) •antibodies are directed against internal epitopes light chains, which are hidden in the complete molecule • • •Kappa free 3,3-19,4mg/l •Lambda free 5,7-26,3 mg/l •ratio κ/λ 0,26-1,65 • • • • • • • Kopie - obrázek-08 Lehké řetězce jsou součástí molekuly imunoglobulinů, fyziologicky jsou vša produkovány v mírném nadbytku nad řetězci těžkými a jsou proto nacházeny i v krevním séru. Při nádorových proliferacích vycházejících z plazmatických buněk můžeme najít v krevním séru výrazně (až o několik řádů) zvýšené koncentrace volných lehkých řetězců jednotho typu, kromě absolutních koncentrací sledujeme také poměr (free kappa/free lambda)Jejich stanovení vyžaduje použití protilátky specifické proti tzv. skrytým determinantám, keré jsou skryty v komůetní molekule imuoglobulinu. Stanovení volných lehkých řetězců provádíme pomocí diagnostické soupravy firmy Binding Site na přístroji Immage, detekční limity se posunujeme na jednotky mg/l. 46 CB=89,6 g/l Inkubace s BME, 37 ºC Inkubace s BME,37 ºC Přítomnost kryoproteinu Kryoproteinémie je schopnost některých plazmatických proteinů při ochlazení séra (plazmy) reverzibilně precipitovat nebo gelifikovat. Kryoprecipitace je popisována u infekčních (bakteriálních, virových, parazitárních, mykotických), autoimunitních (SLE, reumatická artritida aj.) a u různých lymfoproliferativních onemocnění (MM, Waldenströmova makroglobulinémie, chronická lymfatická leukémie aj.) Kryoproteinémie lze rozdělit na 3 typy: Typ I: způsobené kryoprecipitací monoklonálních imunoglobulinů Typ II: smíšené –způsobené kryoprecipitací komplexů monoklonálních imunoglobulinů s polyklonálními imunoglobuliny Typ III: způsobené kryoprecipitací polyklonálních imunoglobulinů Kryoproteinémie může být příčinou falešných výsledků celé řady vyšetření( KO, elektroforéza aj.) Kasuistika Mnohočetný myelom Anamnéza •Muž 60 let •Asi 7 měsíců bolesti žeber, i při nádechu – uzavřeno jako Tietzův syndrom,klasifikace bolesti dle VAS 6-7, dále bolesti zad,užíval analgetika, běžná analgetika bez efektu,Doreta ( paracetamol+tramadol) s částečným efektem,přidala se výrazná únava • •Léčí se s hypertenzí • •FA: Prestarium o Laboratorní vyšetření • •Nárůst retence N látek v séru •Hyperkalcémie •Diskrepantní nález bílkoviny v moči : okvantitativně výrazná proteinurie okvalitativně pomocí suché chemie -1 (POZOR - průkaz pouze albuminu) •Prohloubení anémie • • • Další postup? Laboratorní vyšetření Elektroforéza Imunofixace –sérum Imunofixace moč sérum moč S-ifix: průkaz FLC ĸ v séru U-ifix: FLC ĸ 2,9g/24 hod FLC ĸ kvant. v séru > 18000 mg/l (3,3-19,4g/l) FLC ʎ kvant. v séru 1,0 mg/l (5,7-26,3mg/l) IgD IgE ĸ celk. ĸfree Další vyšetření • •RTG skeletu ovícečetná lytická ložiska ve skeletu lebky, obou klavikul, humerů, lopatek, žeber bilat., v menším rozsahu postiženy i oba femory • •Trepanobiopsie omasívní infiltrace plazmatickými buňkami patologické morfologie,redukce granulopoezy Stanovení diagnózy –terapie,sledování •Mnohočetný myelom III A (DS) •Symptomatický – anémie, hyperkalcémie, hrozící renální poškození • • Terapie: •6 cyklů CHT (efekt - dosaženo VGPR- velmi dobrá parciální odpověď – více jak 90% pokles ve 24 hod vylučování FLC •v moči) •1.autologní transplantace – CR (kompletní remise)-nepřítomnost průkazu monoklonálního proteinu v séru nebo v moči a normalizace FLC v séru •