ELEKTROFORETICKÉ METODY Mgr. Nikola Kučeráková 1 Elektroforéza  je analytická separační metoda  k dělení látek dochází díky jejich rozdílné pohyblivosti vlivem vnějšího elektrického pole (stejnosměrný el. proud) Princip:  využití rozdílné pohyblivosti (migrace) nabitých částic (iontů) v elektrickém poli. Při elektroforéze se jedná o mechanický přenos hmoty vlivem působení elektrického pole. Rozdělení elfo metod: • Volná elektroforéza  provádí se ve vodných roztocích, kde částice putují směrem k elektrodě s opačnou polaritou. • Zónová (zonální) elektroforéza na nosičích • agarózový (AGE) nebo polyakrylamidový gel (PAGE) 2 Zónová elektroforéza  Rychlostmigrace proteinůzávisí na těchto faktorech:  Elektrickýnáboj molekuly  Velikost a tvar molekuly – větší se pohybují pomaleji  Sílaelektrického pole  Vlastnostinosnéhomédia  Teplota  Proteiny s rozdílnou pohyblivostí migrují v gelu jako pásy (bandy). 3 Hlavní typy gelové elektroforézy Gelová nedenaturační elektroforéza • Nativnígelová elektroforéza  probíhá bez denaturačních činidel  migrace proteinů gelem závisí na jejich náboji, velikosti a tvaru  citlivost elektroforézy je dána charakterem póru gelu Gelová denaturační elektroforéza • SDS gelová elektroforéza  proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a β-merkaptoetanolem  Proteiny jsou separovány podle své molekulové hmotnosti 4 SDS gelová elektroforéza • SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně vysoký náboj, a proto ve vazbě na bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin, které se potom pohybují v gelu jen podle velikosti.  Vzorek proteinu se zpracuje s tzv. vzorkovým pufrem - obsahuje SDS a redukční činidlo β-merkaptoethanol.  Působením těchto látek dojde k rozrušení kvarterní, terciární a do značné míry i sekundární struktury.  Všechny bílkoviny váží SDS v konstantním poměru, asi 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny, a tím charakteristicky mění svou konformaci.  VýslednékomplexySDS-bílkovina:  mají stejnou hodnotu povrchového náboje  konformace bílkovin se do jisté míry unifikuje 5 Zpracování gelu po separaci  Po proběhnuté elektroforéze je nutné gel sušit nebo fixovat fixačnímroztokem (obsahuje kyselinu, např. kys. octová) dojde k denaturaci proteinů a jejich imobilizaci v nosném médiu, aby se zabránilodifúzi jednotlivých zón.  Dále je nutné gel obarvit, aby došlo k vizualizaci jednotlivých proteinových frakcí. Po promytí přebytku barviva, se gel suší. Barvy – amidočerň, kyselá violeť,…  Množství barviva, které se během barvení váže na proteiny záleží na mnoha faktorech. Je ovlivněno typem proteinu nebo stupněm denaturace při fixaci. 6 Vyhodnocení: Detekce a kvantifikace  Po elektroforetické separaci a barvení, je možné kvantifikovat jednotlivé zóny jako procentuální podíl přímou denzitometrii.  Denzitometr je přístroj, který slouží k vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání. Jedná se o postup, který je podobný fotometrickému stanovení, zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení.  Při denzitometrii se měří intenzita záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam fotometrovaného úseku.  Plocha po křivkou těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi.  Elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (400 – 700 nm), v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při dopadu na detektor.  Po zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí. 7 Gelová elektroforéza v praxi (SPE)  při běžné elektroforéze se sérum rozdělí na frakci albuminu, α1, α2, β1, β2 a ɣ-globulinů  proteiny migrují v gelu jako pásy (bandy)  stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít orientační význam při hodnocení stadia zánětlivého procesu (akutní zánět - ↑ α1 a později i α2; chronický zánět - ↓albumin, ↑ gamma globuliny) 8 Gelová elektroforéza v praxi (SPE): Frakce ALBUMIN  55-65 % z celkových proteinů plasmy  denně produkce v játrech až 12 g  elipsoidní tvar – nezvyšuje viskozitu plasmy  funkce:  proteinová rezerva (zdroj AMK)  transport – bilirubin, hem, steroidní látky, kovy, léky  vazba vody – ztráty albuminů při poruchách ledvin vedou k přestupu vody do tkání → otoky 9 Gelová elektroforéza v praxi (SPE): Frakce ɑ1 GLOBULINY  prakticky jediná bílkovina, která ovlivňuje tvar a intenzitu alfa 1 zóny – alfa1-antitrypsin  chrání před enzymy zánětlivých buněk, inhibitor proteáz  dále kyselý alfa-1 globulin, transkortin, transkobalamin ɑ2 GLOBULINY  intenzitu a morfologii bandu ovlivňují stejným dílem alfa2makroglobulin a haptoglobin • Haptoglobin: • vazba hemoglobinu z rozpadlých erytrocytů (zabraňuje ztrátám Fe) • ↑ při akutním zánětu a při zátěži • ↓ při rozpadu velkého množství erytrocytů 10 Gelová elektroforéza v praxi (SPE): Frakce β GLOBULINY  Β1 = transferin – vazba a transport železa  β2 = C3 γ GLOBULINY  IgG, IgM, IgA, IgD, IgE  lehké řetězce κƛ  Produkovány B-lymfocyty (plazmatickými buňkami) 11 Protilátky: struktura 12 Detekce paraproteinu  imunoelektroforéza je v současné době používána téměř výhradně k průkazu monoklonálního imunoglobulinu = paraproteinu  paraprotein (PP, MIg) je produkován klonem nádorových plasmatických buněk = plazmocytom, plazmocytární myelom  Mnohočetný myelom = nádor vycházející z plazmatických buněk  CRAB symptomy  přítomnost MIg = výrazný nefyziologický band obvykle v gama zóně  příčinou jasného pruhu je fakt, že se PP pohybuje velmi uniformě, protože každá molekula má stejné aminokyselinové složení (tudíž stejný náboj a molekulovou hmotnost) 13 CRAB symptomy 14 Elektroforéza s následnou imunofixací Provádíse ve čtyřech krocích:  Separace proteinů elektroforézou na agarózovém gelu.  Imunofixace (imunoprecipitace) proteinů rozdělených elektroforézou – příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Proteiny v referenční stopě jsou jsou fixovány fixačním roztokem.  Neprecipitované, rozpustné proteiny jsou z gelu odstraněny odsátím a promytím. Komplex antigen- protilátka zůstává v gelové matrix.  Precipitované proteiny jsou vizualizoványobarvením 15 Gelová elektroforéza: zpracování 16 Imunofixace: zpracování 17 Imunofixace: zpracování 18 Hodnocení elektroforézy: Pentafixace Imunofoxace 19 Hodnocení elektroforézy  Hemolýza = 1250 mg/l (norma 0-50)  Fibrinogen (plazma) 20 Hodnocení elektroforézy  NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA Imunoparéza • izolované zvýšení jednoho typu imunoglobulinu (paraproteinu) se současným snížením ostatních imunoglobulinů Hemolýza • při silné hemolýze se vytváří samostatný band mezi α2 a β1 zónou 21 Hodnocení pentafixace 22 Hodnocení imunofixace 23 Izoelektrická fokusace  elektroforetická separační metoda, při níž dochází k dělení biomolekul v gradientu pH dle jejich izoelektrického bodu  gradientu se dosahuje pomocí amfolytů obsahujících směsi NH2+ a -COOH-, které se ve stejnosměrném elektrickém poli seřadí podle svého izoelektrického bodu a vytvoří tak gradient pH (cca 5- 10)  izoelektrický bod = hodnota pH při níž je pro danou látku vyvážen počet kladných a záporných nábojů, takže se molekula jeví navenek jako neutrální = izoelektrické pH = pI  pI je hodnota pH, při které se molekuly vlivem elektrického pole nepohybují  dělené látky v průběhu IF putují fo svých izoelektrických bodů, kde fokusují = koncentrují se 24 Izoelektrická fokusace  proteiny vykazují značné rozdíly v izoelektrických bodech: většina má pI v pH 4 – 7  obecně by se vzorky neměly aplikovat na plochy, kde se očekává jejich fokusace  aby se proteiny chránily před působením extrémních hodnot pH, neměly by se aplikovat blíže než 1 cm od elektrod  proteiny můžeme před extrémy pH chránit také tím, že gradient pH vytvoříme před aplikací vzorku (pre-migrace) 25 Izoelektrická fokusace: použití  Přítomnost intrathekálního IgG je významnou informací k diagnóze zánětlivého onemocnění CNS, jehož příčinou je např. rostroušená skleróza. Oligoklonální pásy nacházíme u více než 95 % těchto pacientů.  Oligoklonální proužkování není ani diagnostické ani specifické pro toto onemocnění, ale je široce používáno jako podpůrná informace a považováno za základní vyšetření dle konsenzu Evropské komise pro sklerózu multiplex. Potvrzuje diagnózu u pacientů s klinickými příznaky choroby a pomáhá při diagnostice pacientů s nepřesvědčivými klinickými projevy.  Dále lze pásy prokázat u chronických zánětů CNS, neuroborelióze, neurosyfilis atd. 26 Izoelektrická fokusace: hodnocení Typ 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález; Typ 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy); Typ 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (systémové onemocnění) Typ 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v séru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS; Typ 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) – paraproteinový obraz. 27 Izoelektrická fokusace: hodnocení  Metoda zahrnuje izoelektrofokusaci na agarózovém gelu, následovanou immunofixací s anti-IgG antisérem.  Vzorky CSF a séra od téhož pacienta jsou pak vizuálně porovnány.  Citlivost metody dovoluje analýzu CSF bez předchozího zahušťování.  K potvrzení intratékální syntézy Ig je nutno analyzovat sérum a mozkomíšní mok paralelně ve stejných koncentracích, aby byl demonstrován rozdíl v distribuci IgG.  Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a vyjadřují heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější antigeny, s nimiž se jedinec setkal. 28 Izoelektrická fokusace: hodnocení  Intratékálně produkované protilátky se vyznačují pouze omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což se při izoelektrické fokusaci projeví jako izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra.  Z toho vyplývá nutnost provádět současně analýzu imunoglobulinů likvoru i séra.  Srovnává se přítomnost či nepřítomnost identických pruhů IgG v séru a moku; počet a lokalizace proužků nemá diferenciálně diagnostickývýznam. 29 Detekce likvorey  Likvorea = výtok mozkomíšního moku/likvoru, k němuž dochází při poranění lebky  Někdy je důležité určit, zda u pacienta po úrazu hlavy je sekret vytékající z nosu jen zánětlivý exsudát z nosní sliznice nebo mozkomíšní mok  V takovém případě se jedná o závažný stav s komunikací likvorových cest a nosní dutiny, ohrožující pacienta přestupem bakteriální flóry na mozkové blány (meningy)  Likvor může odtékat např. z dutiny nosní či ucha  Pro průkaz 2 specifické parametry: beta-trace protein, beta-2- transferin  Srovnání hladin v séru pacienta a v jiné biologické tekutině (sekrety, výtoky z nosu, tekuté, nebo nasáté do tamponů) 30 Beta-trace protein  Prostaglandin D syntáza  V likvoru jsou koncentrace 20-30 x vyšší než v séru  U nás stanovení nefelometricky (Atellica, Siemens)  BTP v sekretu:  < 0,7 mg/l – přítomnost likvoru nepravděpodobná  ≥ 1,3 mg/l – přítomnost likvoru pravděpodobná  0,7-1,29 mg/l -> poměry  BTP sekret/sérum <2 - přítomnost likvoru nepravděpodobná  BTP sekret/sérum ≥ 2 - přítomnost likvoru nepravděpodobná 31 Beta-2 transferin  Detekce pomocí elektroforézy, Sebia, Hydrasys  Beta-2-transferin je desializovaná forma transferinu a nachází se pouze v likvoru (ani v séru, ani v slzách, ….). Přítomnost beta-2transferinu lze pokládat za specifický průkaz likvoru nebo jeho příměsi  Ze sérového transferinu se v likvorových prostorách odštěpí zbytky kyseliny sialové (mozkovou neuraminidázou), vzniká asialotransferin  Vyhodnocení:  Vizuální pozorování elektroforetického záznamu umožňuje detekci desialylované frakce transferinu (nebo-li 0-sialo frakce) ve vzorcích sekretu.  Když je desialylovaná frakce transferinu více vizualizovaná, než frakce disialo transferinu, je vzorek pozitivní. 32 Beta-2 transferin: hodnocení  Vizuální pozorování elektroforetického záznamu umožňuje detekci desialylované frakce transferinu (nebo-li 0-sialo frakce) ve vzorcích sekretu.  Když je desialylovaná frakce transferinu více vizualizovaná, než frakce disialo transferinu, je vzorek pozitivní. 33 Beta-2 transferin: hodnocení Disialo-transferin Asialo (desialo)-transferin 34 Děkuji za pozornost 35