ELISA
Mgr. Nikola Kučeráková
ELISA
Enzyme-Linked
ImmunoSorbent
Assay
 kvantitativní stanovení analytu v neznámém vzorku
 má vysokou citlivost a specificitu
 ELISA patří do skupiny metod EIA (enzyme immunoassay),
které používají enzym ke značení protilátky (nebo antigenu)
 Jeden z imunoreaktantů je zakotvený na pevnou fázi
(immunosorbent), zpravidla stěny jamek mikrotitrační
destičky
 Jeden z imunoreaktantů je značený enzymem (Enzyme-
linked)
 enzym po přidání substrátu do reakční směsi katalyzuje
reakci, na jejímž konci je barevný produkt vhodný
k fotometrické detekci
 heterogenní imunochemické stanovení - vyžadují separaci
volné a vázané frakce
ELISA techniky
Pro správné provedení ELISA techniky:
 antigen nebo protilátka musí být navázán na povrch
nosiče bez ztráty imunoreaktivity
 stabilita enzymů a také imunologická reaktivita
konjugátu (komplex AbAg) musí být během reakce
stabilní
 aktivita enzymů, které jsou použity při značkování, se
nemůže přirozeně vyskytovat v analyzovaných
biologických tekutinách
Detekce
protilátky
Detekce
antigenu
Konjugáty
Enzymy
používané ke
značení
 Protilátkový konjugát proti:
 určité třídě Ig
 Jinému epitopu antigenu
 konjugovaný s enzymem
 musí být stabilní
 struktura enzymu musí umožnit vytvoření kovalentní vazby s
protilátkou či antigenem
 Produkt enzymové reakce musí být snadno detekovatelný i ve
velmi nízkých koncentracích
 Křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza,…
Kompetitivní
ELISA
Nekompetitivní
(sendvičová)
ELISA
 platí zde nepřímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu
(neznačeného), tím nižší intenzita zbarvení (tím méně navázaného
značeného antigenu)
 nejvíce používaná ELISA metoda
 platí zde přímá úměra: čím vyšší koncentrace analytu, tím vyšší
intenzita zbarvení.
Využití ELISA
metod
 ELISA metody mají široké uplatnění ve zdravotnických
laboratořích hlavně v imunologii a infekční mikrobiologii (méně
v biochemii nebo hematologii), kde se používají pro stanovení
např. infekčních agens nebo protilátek
 Nejčastěji jsou analyzovány vzorky séra, likvoru
Výhody:
 jsou citlivé a specifické
 mají nízké pořizovací náklady na technickou instrumentaci
Nevýhody:
 analýza vzorků pouze v sériích
 časová náročnost
 manuální pipetování
Technická
instrumentace
 Provádí se ve speciálních
nádobkách uspořádaných do
tzv. mikrotitračních destiček.
 Každá destička obsahuje 96
jamek uspořádaných ve 12
řadách po 8 jamkách.
Technická
instrumentace
Promývání:
 osmikanálové pipety
 automatické ELISA promývačky
Pokud to metoda vyžaduje, lze během inkubace mikrotitrační
destičku umístit do třepačky.
Detekce:
 spektrofotometry - ELISA readry
ELISA reader
(spektrofotometr)
Součásti vertikálního fotometru:
 zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová
výbojka.
 Interferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle
se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm).
 Optický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a
zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického
prostředí (jamka mikrotitrační destičky).
 Detektor: používají se fotodiody.
Rychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička – 96 jamek).
 Kalibrační křivka: Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a
koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti
standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank (slepý
pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce.
ELISA
automatická
linka
Automatická linka provádí:
 automatické pipetování vzorků, reagencií,
kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího
systému
 Má zabudovanou čtečku čárového kódu,
což umožňuje automatickou identifikaci
pacientských vzorků.
 Linka má obvykle 3-4 místa pro umístění
mikrotitračních destiček.
 Dále sestává z inkubátoru (místo pro
inkubaci vzorků), promývačky a readeru
mikrotitračních destiček.
 Transport destiček mezi jednotlivými
částmi provádí pomocí robotického
ramene.
 Systém provádí automatické ředění vzorků
a je opatřen softwarem pro automatické
vyhodnocení měření.
ELISA
automatická
linka
Výhody:
 čtení čárových kódů
(zabránění záměny mezi
vzorky)
 přesnost pipetování vzorků a
reagencií
 vysoká kapacita přístroje
Nevýhody:
 vyšší spotřeba používaných
reagencií
Příklad:
vyšetření
protilátek IgM
protiTTG
TTG TTG TTG TTG TTG
Konjugát a-IgM
+ enzym
Konjugát a-IgM
+ enzym
Děkuji za
pozornost