Kalibrace analytických metod Miroslava Beňovská 2 ØMěřící zařízení + přístroje pro měření fyzikálních veličin musí být výrobci kalibrovaná Objem: pipety Teplota (+37°C ± definovaná přesnost) Hmotnost: váhy ØPro účely akreditace:verifikace (ověření) - certifikát (Český metrologický institut) - v laboratoři 3 Směrnice rady IVD 98/79/ES • Soubor pravidel pro způsobilost výrobců laboratorních diagnostik a zařízení • • Je vyžadována návaznost hodnot pracovních kalibrátorů a povinnost poskytnutí dat výkonnostních charakteristik měřících postupů, včetně postupu kalibrace •Grafickým symbolem shody vlastností výrobku s požadavky formulovanými Směrnicí 98/79/ES je „CE“ značka (realizace návaznosti je popsána v normě ISO 18153) 4 • Definice: • Soubor úkonů, kterými se za specifických podmínek stanoví vztah mezi hodnotami veličin, které jsou indikovány měřícím přístrojem nebo měřícím systémem nebo referenčním materiálem a odpovídajícími hodnotami kalibrátorů • Kalibrace 5 • Zjednodušeně: • Kalibrace určuje vztah mezi měřeným signálem (např.absorbancí) a množstvím (koncentrací) zjišťované látky (analytu). • Tento vztah je definován matematickým modelem (kalibrační funkcí) • •Zajišťuje přenos hodnot z referenčních materiálů/metod do rutinní laboratoře •Je nástrojem návaznosti •Ne pro všechny analyty existují referenční materiály 6 Kalibrátory •Primární kalibrátory - připraveny z čisté substance • •Sekundární kalibrátory - hodnota přiřazena pomocí referenčního měřícího postupu (např. multikalibrátory v klinické laboratoři jsou sekundární matricové kalibrátory pro základní analyty) • 7 Kalibrátory •Primární kalibrátory - připraveny z čisté substance • •Certifikované referenční materiály (CRM) – návaznost, nejistota • •Pracovní kalibrátory výrobce • •Kalibrátory dodávané výrobci - včetně multikalibrátorů • 8 • Ideální kalibrátor v laboratoři • •Hodnoty odvozené srovnáním s CRM (certifikovaný referenční materiál) nebo stanovenými referenčními metodami •Komutabilní (matrice shodná s matricí biologických vzorků) •S udanou nejistotou hodnot 9 Nejčastější nedostatky kalibrátorů pocházející od výrobce •Hodnoty bez návaznosti na referenční materiál (metody) •Návaznost není řádně provedena a dokumentována •Rozdíly mezi šaržemi •Různé hodnoty v závislosti na použité metodě 10 • Kalibrační funkce * * Lineární * Nelineární • • Vyhodnocení: •Manuální •Software Způsoby kalibrace •Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy •kalibrace: • •Lineární dvoubodovou – pro fotometrické metody •Nelineární – pro turbidimetrické, imunoturbidimetrické, • imunonefelometrické a imunoanalytické • metody • Příklady: Logit-log 4P • Logit-log 5P • RCM2T2 exponenciální funkce • Spline •ISE (tříbodová) • •Na analyzátor je třeba nainstalovat každou šarži kalibrátoru • •Kalibrátory Roche a Siemens mají pro každou šarži jedinečné čárové kódy využívané při analýze • Kalibrační křivka •Je grafickým znázorněním závislosti měřeného signálu na měřené vlastnosti analytu (např. koncentraci) 12 13 •Přednost se dává lineárním funkcím • •Průběh křivky se vypočítá regresní analýzou • 14 Kalibrace_lineárni 1bod Ca = Ckal . Aa/Akal = Aa . faktor e =A/c.l 15 • • Rovnice lineární regresní analýzy • Y = a + b.X • Y…. signál (např.absorbance) • X…. koncentrace analytu • a…. úsek na ose y (intercept) • b…. směrnice přímky(slope) • (a…by měla být blízká nule) • 16 F:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2015-09-30T204240.png 17 • Lineární regresní analýzou můžeme kontrolovat (ověřovat) linearitu kalibrace • • Pomáhají i metody korelační analýzy (= metoda, která studuje vztah mezi dvěma proměnnými hodnotami) •Pasing-Bablokova regrese •Demingova regrese sejmout0007 sejmout0004 sejmout0009 sejmout0005 F:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2015-09-30T192754.png 23 •Nelineární funkce •Typická pro imunoanalytické metody – imunoturbidimetrie, imunonefelometrie,imunoanalýza • •Kalibrace v klinické laboratoři obvykle realizována šesti kalibrátory •Proložení kalibrační křivky • spline • logit-log-1, logit-log-2, logit-log-3 • RCM2T2 exponenciální funkce • kvadratický model • kubický model 24 ppp 25 rrrr sejmout0017 27 F:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2015-09-30T204116.png •Kalibrace na imunochemických analyzátorech • (Roche) • •K výpočtu koncentrace stanovovaných analytů - nelineární kalibrační závislosti •Využití kubických polynomů •Master křivka od výrobce - zákazník ji při kalibraci pouze koriguje na aktuální podmínky (dvě hladiny) • 32 F:\Roche\Export\Screenshots\cobas c 8000 DM 2015-09-30T203942.png Nové pojetí nelineární kalibrace na klinických modulech/analyzátorech (včetně ISE) •Na přístroji cobas pro – cobas Autocal pro turbidimetrické • metody • •Při první instalaci metody – provede se šestibodová kalibrace (full kalibrace) • •S každou novou šarží se kalibrační křivka automaticky upraví pomocí tzv. podílu šarže • • Omezení počtu kalibrací, úspora testů 33 34 • Rozsah kalibrace • (pracovní rozsah měření) • • Interval koncentrací, v němž lze dosáhnout požadované hodnoty přesnosti a pravdivosti měření • • Meze: dolní a horní mez stanovitelnosti • 35 • Rekalibrace • • - nová šarže reagencií • - doporučené údaje výrobce • - výsledky kontrolních vzorků mimo povolené rozmezí, … • - výměna některých částí měřícího zařízení (např. dávkovače,elektrody) • 36 Kontrola kalibrace a četnost kalibrací (rekalibrace) •Analýza kontrolních materiálů •Dodržovat doporučení výrobců •IKK •Kontrolní grafy (regulační diagramy) 37 Počet a rozmístění kalibrátorů, rozsah kalibrace •dodržovat postup kalibrace výrobcem IVD MD 98/79 EC • •Počet kal. bodů: lineární1-3 (L-M-H); nelin. 6 • (při validaci 10 – 15) Zamítnutí kalibrace •Naměřené signály/měřené veličiny kalibrátorů nesplňují předepsané hodnoty od výrobce • •Častá chyba - Duplicate limit error (všechny kalibrační body se měří 2x (až 4x) – příliš velký rozdíl vede k chybovému hlášení a zamítnutí kalibrace 38 39 Analyt Typ kalibrace Počet bodů (při kalibraci v klinické laboratoři) ALT transferin fosfáty IgG troponin T urea bilirubin folát 40 Analyt Typ kalibrace Počet bodů (při kalibraci v klinické laboratoři) ALT lineární 2-3 transferin nelineární 6 fosfáty lineární 2-3 IgG nelineární 6 troponin T nelineární 2 (Siemens, Roche); 6 (ost.) urea lineární 2-3 bilirubin lineární 2-3 folát nelineární 2 (Siemens, Roche); 6 (ost.)