1 Lipidy Lipoproteiny Apolipoproteiny 2 3 4 Lipidy • Lipos = tuk •Význam lipidů v organismu • 1) Zdroj zásobní energie alternativní ke glukóze (triacylglyceroly) • 2) Součást buněčných membrán (cholesterol, fosfolipidy) • 3) Biokatalyzátory, hormony • 4) izolační vrstva, ochrana orgánů •Stanovení koncentrace lipidů v krvi nyní bez významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l) • 5 Transport lipidů • I. Krev a lymfatický systém •Vazba na specifické proteiny • (mastné kyseliny na albumin) •Tvorba makromolekulárních komplexů • •lipidy + apolipoproteiny = lipoproteiny * • II. Zásobní lipidy a v buněčných membránách 6 Odběr krve • •pacient lačný 12-14h •2-3 dny má být vynechán alkohol, •krev odebrána bez dlouhé venostázy, •pacient má dodržovat alespoň 2 týdny stávající životní styl • • Diagnostické rozhodnutí o přítomnosti zvýšeného rizika je možné pouze na podkladě průměru dvou následných měření z dvou odběrů u jednoho pacienta, provedených v intervalu 1-8 týdnů, nejlépe v téže sérii měření. • Standardizace Standardizace Standardizace postupu Analyt Referenční metoda Návaznost na OKB FNUSA CHOL ID-GC/MS Abell-Kendall a také ID-GC/MS TG ID-GC/MS ID-GC/MS HDL, LDL Ultracentrifugace v hustotním gradientu Hodnota standardu stanovena dle National Reference System Cholesterol APO AI, APO B Není CRM SP1-01, CRM SP3-07 Lp(a) Není IFCC SRM2B pro nmol/l 10 LPlvelikost Rozdělení lipoproteinů LPchylovrstva Lp(a) 11 Chylomikrony (CM) • vznikají v absorpčních buňkách střevní sliznice • nesou TG, CH a lipofilní vitaminy přijaté potravou • obsahují apo-B48, stopy apoA (jiné neumí střevní buňka syntetizovat) • syntéza apo-B 48 limituje tvorbu CM • pronikají do lymfy • prostřednictví lymfatických cév jsou transportovány do krve 12 Jaký je osud chylomikronů v krvi ? • do krve vstupují 1-2 h po jídle • z HDL jsou na CM přenášeny Apo E a Apo CII • v krevních kapilárách na CM působí lipoproteinová lipáza 13 VLDL • vznikají v hepatocytech • nesou cholesterol převážně přijatý potravou a triacylglyceroly syntetizované v játrech • obsahují ApoB100, malá množství ApoA a ApoC-I a ApoE 14 • V krevních kapilárách působí na VLDL lipoproteinová lipasa • Triacylglyceroly jsou štěpeny na mastné kyseliny a glycerol • Z HDL jsou na VLDL přenášeny Apo E a Apo CII • VLDL se mění na IDL • IDL jsou vychytány játry nebo přeměněny na LDL Jaké jsou další změny VLDL? 15 • vznikají z VLDL a IDL LDL 16 • oxidované LDL dlouhý poločas LDL částic způsobuje, že: LDL mohou pronikat cévní stěnou ® ukládají se v intimě ® dochází k jejich oxidaci ® oxidované LDL jsou silně aterogenní •„small dense LDL particles“ (malé denzní LDL částice) LDL-III, 1,04-1,06 g/l, <25 nm - silně aterogenní, snadněji pronikají arteriální intimou - špatné rozpoznávání a vychytávání LDL receptory, - - snadno se oxidují 17 • IDL i LDL částice mohou být obohacovány estery cholesterolu z HDL • IDL částice jsou vychytávány játry pomocí Apo-E receptoru • LDL jsou vychytávány periferními tkáněmi a játry receptorově zprostředkovanou endocytozou (Apo-B 100) Jaký je osud IDL a LDL? 18 HDL • vznikají v hepatocytech (částečně i v enterocytech) • HDL přijímají cholesterol z periferních tkání a zprostředkují jeho transport do jater • pro jejich funkci je důležitý enzym LCAT lecitincholesterolacyltransferáza – esterifikace cholesterolu • existuje několik typů HDL (HDL1 – HDL3), které se liší velikostí a obsahem lipidů 19 • LCAT přenáší mastnou kyselinu na OH skupinu cholesterolu • Cholesterol se esterifikuje, esterifikovaný cholesterol je méně polární a zanořuje se do nitra HDL Funkce LCAT - 20 Lp(a) • Lipoprotein o nízké hustotě • Kromě Apo B100 má navíc Apo(a) • Apo(a) je podobný plasminogenu • Polymorfismus (hustotní a délkový) • Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky Lp(a)2 22 MEZI LIPOPROTEINY PROBÍHÁ VÝMĚNA LIPIDŮ I PROTEINŮ 23 Stanovení lipoproteinů 1) ULTRACENTRIFUGACE LPultracentrifugace 24 2) ELEKTROFORÉZA 25 3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE LP rutinni 26 Apolipoproteiny • PROTEINOVÁ SLOŽKA LIPOPROTEINŮ • FUNKCE: AKTIVÁTORY A INHIBITORY ENZYMŮ interakce s RECEPTORY tvorba buněčných STRUKTUR účast na přenosu nebo výměně lipidových částic 27 ApoAI apolipoprotein v HDL ApoB-100 apolipoprotein v LDL a VLDL ApoB-48 apolipoprotein v chylomikronech Apo(a) apolipoprotein v Lp(a) • 28 Význam stanovení ApoB-100 * Informace o počtu LDL částic Ø1 částice LDL obsahuje 1 částici Apo-B100 a různé množství cholesterolu a triacylglycerolů ØPři stejné hodnotě LDL cholesterolu vyšší hodnota Apo-B100 svědčí o větším počtu LDL částic (převaha malých hustších částic) ØPosouzení rizika kardiovaskulárních následků aterosklerózy 29 Stanovení ApoAI a ApoB 1) IMUNOTURBIDIMETRIE 2) IMUNONEFELOMETRIE • Referenční metody nejsou definovány • CRM: SP1-01 a SP3-07 •Apolipoprotein AI g/l •Apolipoprotein B g/l Lipoprotein(a) •Nedostatečná úroveň standardizace •Měření v molárních jednotkách nebo hmotnostních jednotkách (druhé je v současnosti častější) •Měření v hmotnostních jednotkách a přepočet na molární? Nemělo by se provádět. 32 Cholesterol • • • • chol bílá krystalická látka 34 Cholesterol celkový = Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný 35 Stanovení cholesterolu •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • • kalibrátor NIST-SRM 911b • vnitřní standard (3,4-13C2) cholesterol • derivatizace TMS(trimethylsilylether) • m/z analyt 458 • m/z vnitřní standard 460 • CV(průměr) 0,8% • bias -0,5% (-1,4 až + 0,5%) • •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 36 Cholesterol • • 2. Enzymové stanovení • •Hydrolýza esterů cholesterolu • (CHE, cholesterolesterasa) •Oxidace cholesterolu • (CHOD, cholesteroloxidasa) •Barevná reakce (oxidační kopulace) • (POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce) • 37 • • • •estery cholesterolu + H2O « cholesterol + mastné kyseliny (CHE) • cholesterol + O2 « Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD) • • • H2 O2 + chromogen « H2 O2 + barvivo (POD) • • • •H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • • • • • 38 Stanovení HDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL ze séra ultracentrifugací • 2) odstranění IDL,LDL, a Lp(a) precipitací činidlem MnCl2+heparin a centrifugací • 3) stanovení cholesterolu v supernatantu • referenční metodou Abell-Kendall • • • Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 39 HDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ (přímé) metody • a)Imunoseparace (Wako) • (protilátky proti lidským ß-lipoproteinům b)Maskování (Daiichi) • (polyanionové polymery) c)Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) • (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) 40 Stanovení LDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL a chylomikronů ze séra ultracentrifugací (v supernatntu zůstane směs LDL+HDL o hustotě nad 1,006 kg/l) • 2) stanovení cholesterolu v supernatantu (LDL+HDL) Abell-Kendallovou metodou • 3) odstranění LDL precipitací činidlem MnCl2-heparin • v druhé části supernatantu • 4) stanovení cholesterolu po centrifugaci v supernatantu (HDL) Abell-Kendallovou metodou • 5) výpočet LDL cholesterolu podle vztahu: • LDLChol=(LDL+HDL)Chol - HDLChol •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 41 LDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ(přímé) metody • •a) metody s maskováním non-LDL částic • •maskování VLDL a chylomikronů cyklodextrinsulfátem •oddělení HDL od LDL detergentem •stanovení cholesterolu v LDL •detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení • 42 •b) metody s odstraněním non-LDL částic • •Rozložení non-LDL částic za přítomnosti detergentu a polyaniontu, za přítomnosti CHE a CHOD proběhne stanovení cholesterolu na peroxid vodíku, který je rozložen katalasou bez tvorby zbarvení •po přidání 2.reagencie obsahující detergent dojde k solubilizaci LDL a enzymovému stanovení cholesterolu z LDL částic (detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení) • Obtíže stanovení LDL •Nedostatečné maskování non LDL částic v prvním kroku – nadhodnocení výsledku LDL cholesterolu •HDL + LDL musí být nižší než celkový cholesterol •Nedostatečná specificita detergentu 1 pro maskování LDL částic 44 •3. Výpočet koncentrace LDL cholesterolu(Friedewald) • •LDLChol(mmol/l) = Celkový Cholesterol - HDLChol - 0,45.TG • •nutné stanovit HDLcholesterol, celkový cholesterol a TG •neplatí při hyperTG •požadavek 12-14h lačnění • • • • • Výpočet LDL_Martin •LDL chol. = celkový chol. – HDL chol. - TG/F •F – proměnlivý faktor odvozený z hodnot Tg a non HDL cholesterolu (celkem 180 komponent) •Minimalizace interference zvýšených TG • Výpočet LDL_ Martin Omezení •Výpočet i přímé měření LDL nejsou spolehlivé při velmi nízké koncentraci LDL •Výpočet i přímé měření LDL nejsou spolehlivé při vysokých koncentracích Tg 48 Triacylglyceroly • • • Triacylglyceroly = estery glycerolu Problémy při stanovení: volný glycerol diacylglyceroly monoacylglyceroly Odběr krve musí být nalačno (12 až 14h) 49 Stanovení triacylglycerolů •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • kalibrátor NIST-SRM 1595 tripalmitin • vnitřní standard (13C3) tripalmitin • derivatizace N-ethyl-N-trimethylsilylfluoroacetamid) • m/z analyt 215 hlavní měření • 185,231(konfirmační měření) • m/z vnitřní standard 218-187,234(konfirmační měření) • CV(průměr) 0,57% nativní sérum-0,72% lyof. sérum • bias(diference od SRM 909) 0,10-0,25% lyofilizované sérum • 0,14-0,45% nativní sérum •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 50 Triacylglyceroly •2. Enzymové stanovení •Hydrolýza (vznik glycerolu) •Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu) • a)Oxidace glycerol-3-fosfátu • barevná reakce b)Stanovení ADP • stanovení pyruvátu (optický test) • – 51 • •triacylglyceroly + 3H2O « glycerol + 3 mastné kyseliny • LIPASA •glycerol + ATP « glycerol-3-fosfát + ADP • GLYCEROLKINASA (GK) • •glycerol-3-fosfát + O2 « dihydroxyacetonfosfát +H2O2 • GLYCEROLFOSFÁTOXIDASA (GPO) • •2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • PEROXIDASA (POD) • 52 • • •glycerol + ATP « glycerol-3-fosfát + ADP • GLYCEROLKINASA (GK) • •ADP + fosfoenolpyruvát « ATP + pyruvát • PYRUVÁTKINASA (PK) •pyruvát + NADH +H+ « laktát + NAD + • LAKTÁTDEHYDROGENASA (LD) • 53 Doporučené hodnotící meze Analyt Muži Ženy Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00 HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70 Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90 Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00 Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46