Na, K, Cl, Ca, Mg, vitamíny, stopové prvky Ondřej Wiewiorka Natrium, kalium, chloridy – S,P,U •Význam –udržují vnitřní prostředí, osmolalitu, chemicky řízený potenciál na povrchu buněčných membrán (vč. Přenosu nervového vzruchu), membránové kontransportéry –S/P v organismu přísně regulovány, U dle příjmu –Základní a levné vyšetření – vychýlení mimo referenční rozmezí může mít mnoho důvodů (hormonální porucha, porucha příjmu, průjmy, zvracení, onemocnění ledvin, jater, dehydratace, podávání diuretik, diabetes, nesprávné dávkování infuzí....) Natrium, kalium, chloridy – S,P,U •Dříve stanovení Na, K pomocí plamenové emisní fotometrie (společně s Li, Ca, Mg) –Náročné na provoz – zajištění odtahu plynů, práce s tlakovými lahvemi, zvyšování teploty v laboratoři.... • •Dnes je stanovení Na, K, Cl v S/P/U realizováno na ISE modulech potenciometricky –Přímá potenciometrie: •Měření probíhá v neředěném vzorku plné krve – analyzátory ABR –Nepřímá potenciometrie: •Měření probíhá v naředěném vzorku séra/plasmy/moči – automatizované biochemické analyzátory •Každý prvek má svou ISE elektrodu + referenční (argentchloridová) elektroda; měří se rozdíl potenciálu mezi IS elektrodou a referenční elektrodou •ISE elektroda měří aktivitu, přepočet na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu ISE elektrody •Jednotlivé ISE elektrody •Elektrody integrované - integrovaná chipová technologie •Na basi tenkovrstvé ionoforové technologie (ionofory umožňují transport iontů přes membránu) •Makrocyklické ionofory - molekuly s dutinou, ve které jsou pevně vázané ionty - crown etery K+ Metoda nepřímá •Analýza vzorku značně naředěného (např. 30x) diluentem o vysoké iontové síle •Generovaný elektrický potenciál porovnáván s potenciálem standardních roztoků – korekce na teplotu nebo elektrické nestability •Koncentrace iontů se počítá podle Nerstovy rovnice Metoda nepřímá •Výsledky odpovídají měření plamenovou emisní spektrofotometrií •Chyba způsobená přítomností proteinů a lipidů v plasmě (7%) •Naměřené hodnoty se počítají na celkový objem plasmy •Např. koncentrace 145 mmol Na+/l bude ve vodné fázi (počítáme-li 93% vodné fáze) ve skutečnosti 156 mmol Na+/l •Negativní chyba známa po řadu let •S miniaturizací elektrod - přímá metoda - neprosadila se – pouze u ABR Sodík ( Natrium) •Doporučená rutinní metoda: ISE direct, ISE indirect • Referenční metoda: ID-MS, FAES, • IC (navržená) •Hlavní extracelulární kationt – reprezentuje 90 % všech kationtů v plasmě •Hraje centrální roli v distribuci vody •Výrazně se podílí na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině • • Sodík ( Natrium) • •Referenční rozmezí: • •S/P 136-145 mmol/l •moč dospělí 70-270 mmol/24 hod • děti do 1 roku 10-30 mmol/24 hod •Stanovení Na pomocí ISE: •skleněná sodíková elektroda •nebo crown éterový případně crown malonátový ionofor integrovaný do iontověselektivní plastové membrány (PVC, teflon) • •Enzymatické stanovení Na (nedoporučuje se): •Metoda založena na aktivaci enzymu b-galoktosidasy ionty sodíku •Hydrolýza chromogenního substrátu 2 – nitrofenyl - b - D - galaktopyranosidu na galaktosu a 2-nitrofenol •Rychlost hydrolýzy se měří kineticky při 420 nm Draslík (Kalium) •Doporučená rutinní metoda: ISE direct, ISE indirect •Referenční metoda: ID-MS, FAES, • IC (navržená) •Hlavní intracelulární kationt - koncentrace v erytrocytech je 23x vyšší než v plasmě •Vysoká koncentrace uvnitř buňek zajištěna pomalou difuzí přes buněčnou membránu ven •Na+,K+ - ATPasová pumpa transportuje kalium do buněk proti koncentračnímu gradientu •Interference: Hemolýza zvyšuje hodnoty draslíku Draslík (Kalium) • •Referenční rozmezí: • •S/P 3,5-5,1 mmol/l •moč dospělí 25-125 mmol/24 hod • děti do 1 roku 15- 40 mmol/24 hod •Stanovení K pomocí ISE: •PVC membrána, v ní zabudován valinomycin (na principu iontové výměny) • •Stanovení K plamenovou emisní spektrofotometrií: •Excitované atomy K emitují spektra s ostrou čarou při 589 nm •Rutinně se nepoužívá • •Enzymatické stanovení K: •Metoda založena na aktivaci vhodného enzymu ionty draslíku •Např. tryptofanasa se substrátem tryptofanem •Metoda není doporučena Chloridy •Doporučená rutinní metoda: Coulometrie, ISE direct, ISE indirect • •Referenční metoda: Coulometrie • •Hlavní extracelulární aniont - největší frakce anorganických aniontů v plasmě •Zásadní role v normální distribuci vody •Výrazný podíl na osmotickém tlaku v extracelulární tekutině Chloridy •Referenční rozmezí: • •S/P 98-109 mmol/l • •moč dospělí 110-250 mmol/24 hod • děti do 1 roku 3-10 mmol/24 hod •Stanovení Cl pomocí ISE: •Polymerní membrána – v ní kvarterní amoniové soli •Např. trioktylpropylamonium chlorid dekanol •Membrána zajišťuje iontovou výměnu solí z membrány s chloridovými ionty •Některé firmy používají chloridovou elektrodu v pevné fázi (AgCl) • •Coulometrie: •Stanovení chloridů založeno na generaci Ag+ ze stříbrné anody konstantní rychlostí (konst. proud) •Ionty stříbra reagují s chloridy à chlorid stříbrný •V bodě ekvivalence se generace stříbrných iontů zastaví •Obsah chloridů přímo úměrný času Spektrofotometrické stanovení Cl- • • •2Cl- + Hg(SCN)2 àHgCl2 + 2 SCN- •3SCN- + Fe3+ à Fe (SCN)3 • •červený thiokyanatan železitý se fotometruje •v současnosti se nedoporučuje Natrium, kalium, chloridy- B • •Stanovení v plné krvi •Provádí se na přístrojích na měření ABR pomocí ISE elektrod na Na, K a Cl v heparizovaných stříkačkách nebo kapilárách Vápník •Význam –Zásadní význam pro funkci svalů (troponin C) –Vnitrobuněčná signalizace (kalmodulin) –Mezibuněčná signalizace (Ca-dependentní neurony) –Stavba kostí ( Ca3(PO4)2, hydroxyapatit) –Nezbytný faktor pro srážení krve (II, VII, IX, X) Vápník •Poruchy –Snížená hodnota Ca při onemocnění ledvin –Hormonální dysbalance (PTH, CT a jejich regulace) –Sarkoidóza –Malnutrice (vč. Celiakie, Crohnovy choroby, fytáty) –Nedostatek vitamínu D –Alkoholismus – – Stanovení vápníku v S,P,B : •Tři formy vápníku v krvi •½ vázána na bílkoviny (80% na albumin, zbytek na globuliny) •6-10% - ve formě komplexních sloučenin ( citrát, laktát, hydrogenuhličitan, fosfát). •necelá 1/2 vápník ionizovaný (volný - aktivní) • •Fyziologicky aktivní pouze ionizovaný vápník •Jeho koncentraci regulují hormony PTH a 1,25-dihydroxyvitamin D. •Stanovení ionizovaného kalcia se masově neprovádí •Hodnoty celkového Ca ovlivněny koncentrací albuminu (Ca2+ se výrazně nemění), pH má vliv na koncentraci Ca2+ Vápník (Kalcium) •Doporučená rutinní metoda: • FAAS, FAES, ISE direct, ISE indirect, fotometricky s o-kresolftalexonem, s arsenazo III • •Referenční metoda: ID-MS, FAAS, • IC (navržená) Vápník (Kalcium) •Referenční rozmezí: •Vápník celkový •S/P 2,15-2,55 mmol/l •moč M 2,4-7,5 mmol/24 hod • Ž 2,4-6,2 mmol/24 hod • •Vápník ionizovaný •krev 1,12-1,32 mmol/l a)Celkový vápník – S,P: •Fotometrické metody: •Stanovení s o-kresolftaleinkomplexonem: •Při pH 12 reagují vápenaté ionty s o-kresolftaleinkomplexonem •Vznik stabilního purpurového komplexu s abs. max. 600 nm •Magnesium maskováno s 8-hydroxychinolinem •Metoda citlivá na vzdušný CO2 - komínky a) Celkový vápník – S,P: •Fotometrické metody: •Stanovení s arsenazo III: •Imidazolový pufr, pH 6 •vápenaté ionty + arzenazo III à modrý komplex •činidlo má specifickou afinitu k vápníku (pH 6) •Stanovení s NM-BAPTA: •Vápenaté ionty + 5-nitro-5’-metyl-BAPTA (pH10) • komplex Ca-NM-BAPTA – ten reaguje s EDTA (pH7,3)à komplex Ca-EDTA • Úbytek absorbance při 600 nm je úměrný koncentraci vápníku •Nová vysoce stabilní metoda Roche a) Celkový vápník – S,P: •Stanovení pomocí AAS: •Naředění (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí (uvolnění Ca z fosfátů) •Plamen acetylén-vzduch, Ca-lampa •Naředění podpoří disociaci à uvolnění z fosfátů, snížení viskozity •Stanovení se běžně neprovádí • b) Volné (Ionizované) kalcium - B •Pomocí ISE na speciálním přístroji nebo přístroji na ABR •Měří se rozdíl potenciálu mezi Ca ISE, resp. pH elektrodou a referenční elektrodou •Vydává se i výsledek přepočítaný na pH 7,4 •ISE elektroda měří aktivitu – ta je přepočítávána na koncentraci pomocí aktivitního koeficientu •Kalibrátory musí mít stejnou iontovou sílu (koncentrace sodných a chloridových iontů) •Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár Stanovení vápníku v moči • •Fotometrické stanovení ze sbírané moče •Specifičtější stanovení pomocí AAS •Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí •U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče •AAS v některých laboratořích v moči rutinně Hořčík ( Magnesium): •Význam –Svalová kontrakce –Funkce nervů –Intracelulární iont •Poruchy –Onemocnění ledvin (např. diabetes) –Užívání diuretik –Malnutrice (např. Crohnova choroba, dlouhodobé průjmy) –Deregulace (spojená s Ca, P – hypo/hyperparathyrooidismus, hypo/hyperthyroidismus) –Zvýšená spotřeba (těhotenství) • Hořčík ( Magnesium): •Doporučená rutinní metoda: FAAS, enzymová UV metoda, fotometrické metody •Referenční metoda: FAAS, IC (navržená) • •Stanovení v séru nebo v plasmě: •V séru nebo plasmě se magnesium vyskytuje ve třech formách. 55% hořečnatých iontů je volných, asi 30% je vázáno na bílkoviny, zejména na albumin a 15% - se vyskytuje ve formě komplexních sloučenin ( citrát, fosfát atd.). Hořčík ( Magnesium) •Referenční rozmezí: •hořčík celkový • S/P 0,65-1,05 mmol/l • moč 3,0-5,0 mmol/24 hod • •hořčík ionizovaný • krev 0,40-0,65 mmol/l a) Celkové magnesium: •Fotometrické metody: •Stanovení s xylidylovou modří (magon): •Mg2+ + xylidylová modř v alkalickém prostředí •Vznik purpurové diazoniové soli, abs. max. 600 nm •Ca2+ maskovány s EGTA (kyselina etylen glykol – bis(aminoetyl) tertraoctová) • •Stanovení s Arzenazo: •Mg2+ reagují v alkalickém prostředí s chromogenem arzenazo •Vznik fialového komplexu, abs. max. 570 nm •Interferenci vápníku zabráněno specifickým komplexotvorným činidlem a) Celkové magnesium – pokr.: •Fotometrické metody: •Stanovení s Chlorphfosphonazo III • Chlorophosphonazo III (CPZ III) reaguje s hořečnatými ionty za vzniku komplexu Mg-CPZ III. • Interferenci Ca 2+ zabraňuje EGTA ( ethylen bis(oxyethylennitrilo)tetra-octová • kyselina) - inhibuje vazbu vápníku na CPZ III • pH 7,5 • a) Celkové magnesium – pokr.: •Stanovení s calmagitem: •Fotometrické stanovení se provádí rovněž v alkalickém prostředí při 520 nm. Kalcium může být maskováno s EGTA. •Stanovení s AAS: •Stanovení ve provádí po naředění séra (1:50) roztokem chloridu lantanitého nebo strontnatého v kyselém prostředí. Tím se uvolní hořečnaté ionty z komplexů s fosfáty a proteiny. Dojde rovněž ke snížení viskozity. Ke stanovení se používá plamen acetylén-vzduch. V laboratořích klinické biochemie se běžně neprovádí. •Volné magnesium - B: •Stanovení s ISE – spec. přístroj nebo přístroj na ABR • (Nova Biomedical) •Krátká životnost (1 měsíc), nízká frekvence stanovení, finanční náročnost •Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinizovaných stříkaček či kapilár • •Stanovení Mg v moči: •Fotometrické stanovení ze sbírané moče •Specifičtější stanovení pomocí AAS •Vzorek předem okyselit s HCl, rozpustit potenciální krystaly solí •U pacientů se sklonem ke zvýšené tvorbě krystalů (pro stanovení souboru litiázy) okyselit celý objem sbírané moče •AAS v některých laboratořích v moči rutinně • • Fosfor anorganický •Význam –Společně s Ca zajišťuje strukturu kostí –Fosfáty jsou hlavní intracelulární anionty –Součástí fosfolipidové membrány, tvoří kostru NK, ATP jako energeticky bohaté molekuly, cAMP jakožto signální molekuly, fosforylace/defosforylace proteinů má zásadní roli pro řízení buněčných procesů a signálních drah –Extracelulárně je součástí pufračního systému ABR •Poruchy –Malnutrice –Onemocnění ledvin –Dysbalance hormonálního systému (jako Ca – PTH, kalcitriol, kalcitonin) – –Abnormálně vysoké hodnoty fosfátů můžou vést ke kalcifikaci orgánů Fosfor anorganický •Doporučená rutinní metoda: UV molybdátová metoda •Referenční metoda: neexistuje (navrhovaná ID-MS, IC) • •Stanovení v séru, plasmě a moči: • •Poměr H2PO4- : HPO42- je v kyselém prostředí 1:1, při pH 7,4 1:4 a v alkalické oblasti 1:9 •10% fosfátů v séru vázáno na protein, 35% tvoří komplexy s natriem, kalciem a magnesiem, zbývajících 55% volných •V krvi anorganické i organické fosfáty •Stanovuje se fosfor anorganický, organické estery lokalizovány v buněčných elementech • Fosfor anorganický •Referenční rozmezí: • •S/P dospělí 0,9-1,5 mmol/l • děti 1-2 roky 1,5-2,2 mmol/l • •moč 13,0-42,0 mmol/24 hod •Stanovení P s molybdenanem amonným: •Prostředí kyseliny sírové •Vznik fosfomolybdátového komplexu (NH4)3[PO4(MoO3)12] •a) detekce při 340 nm •b) nebo následná reakce fosfomolybdátového komplexu s redukčním činidlem (kyselina aminonaftolsulfonová – nízká stabilita) à fosfomolybdenová modř - 650 nm • •Stanovení P s molybdenanem a vanadičnanem amonným: •Kyselé prostředí •Vznik žluté kyseliny molybdátovanadátofosforečné •Analýza po vysrážení bílkovin ze supernatantu •Jinak nadhodnocení anorganického fosforu (při reakci dochází k hydrolýze organických esterů) •Není vhodná k automatizaci Železo •Význam –Součástí metaloproteinů – především hemoglobinu, myoglobinu, cytochromy, katalasy, peroxidasy.... Obecně kyslík-dependentní enzymy – •Poruchy –Malnutrice (porucha příjmu, vyšší spotřeba) –Některé druhy anemie Železo •Doporučená rutinní metoda: fotometrie s ferrozinem •Referenční metoda: neexistuje • •Stanovení v séru nebo plasmě: •Fe3+ vázáno na transportní beta1-globulin apotransferin . •Měřená koncentrace železa odpovídá Fe3+ vázanému v sérovém transferinu, nezahrnuje železo obsažené v séru jako volný hemoglobin •Běžně Fe3+ obsazuje pouze jednu třetinu vazebných míst v transferinu •Navázaná část - saturace transferinu Železo •Referenční rozmezí: • • S/P M 10,6-28,3 umol/l • Ž 6,6-26,0 umol/l Princip stanovení Fe: •Po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+ reakcí se skupinou –N= CH-HC=N • •Tvorba barevných komplexů • •Fotometrické stanovení • • • • • •Stanovení železa s ferrozinem: •Železo se uvolní z komplexu s transferinem přidáním citrátového pufru (pH<2) •Fe3+ redukováno kyselinou askorbovou na dvojmocné •Fe2+ s ferrozinem modrý komplex, abs. max. 570 nm • • •Stanovení železa s bathofenantrolinem: •V minulosti nejčastěji používána •Není však vhodná pro automatizaci (deproteinace), •pak se trojmocné železo s kyselinou thioglykolovou redukovalo na dvojmocné. •S bathofenantrolinem pak dává Fe2+ červený komplex. •Interference: •Při fotometrických stanoveních hemolýza zanedbatelný vliv •Větší vliv hemolýza při stanovení pomocí AAS •Stanovení v moči: •AAS •Provádí se zřídka •Nízká koncentrace železa v moči – nevhodné fotometrické metody •Celková a volná vazebná kapacita železa: •Celková vazebná kapacita železa (TIBC) je metoda, která se využívá k výpočtu saturace transferinu: • • Koncentrace Fe v séru • Saturace transferinu (%) = ---------------------------- x 100 • Konc. TIBC •V současnosti minimální použití • • •Výpočet saturace transferinu – provádí se z koncentrace • transferinu a železa • Koncentrace Fe v séru (umol/l) •Saturace transferinu (%) = -------------------------------- x 3,98 x100 • Konc. Transferinu (g/l) Referenční rozmezí: • • •S/P celková vazebná kapacita • 45-75 umol/l • •saturace transferinu železem • M 0,21-0,40 • Ž 0,20-0,36 • Stanovení celkové vazebné kapacity železa: •V minulosti – nelze automatizovat • •Přídavek nadbytku roztoku chloridu želetitého - vysycení transferinu • •Přidat pevný uhličitan hořečnatý – reaguje s přebytečným Fe • •Směs se promíchá, po půl hodině odstředí • •V supernatantu se stanoví koncentrace Fe odpovídající celkové vazebné kapacitě železa • Stanovení volné vazebné kapacity železa: • •Alkal. pufr, přídavek známé konc. Fe2+ v nadbytku. •Specifická vazba na transferin •Nezreagované Fe2+ stanoveny s ferrozinem •Rozdíl mezi koncentrací původně přidáváných Fe2+ a stanovenou koncentrací = volné vazebné kapacitě •Celková vazebná kapacita - součet volné vazebné kapacity a sérového železa • Stopové prvky •Součástí metaloproteinů – obvykle v centru zamýšleného účinku enzymů •Cu, Zn, Se, Cr, Co, Mn, Mo • •Velmi nízké koncentrace v séru i moči, proto je potřeba velmi citlivá analytická metoda a taky předejít kontaminaci vzorku – AAS / AES-ICP •Měří se pro kontrolu suplementace, poruchu vstřebávání, případně genetickou poruchu způsobující onemocnění • Stopové prvky –MĚĎ – •Analyzovaný materiál: S, P, U •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu •Referenční rozmezí: S,P M 11,0-22,0 μmol/l • Ž 12,5-24,0 μmol/l • dU 0,2 – 0,9 μmol/24h Stopové prvky –ZINEK – •Analyzovaný materiál: S, P, U •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: zabránit kontaktu s gumou •Referenční rozmezí: • S,P 9,5 – 19,0 μmol/l • dU 3,0 – 9,0 μmol/24h Stopové prvky –SELEN – •Analyzovaný materiál: S, P, B •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu •Referenční rozmezí: S,P 0,8 – 1,2 μmol/l • dU 0,1 – 0,4 μmol/24h Stopové prvky –MANGAN – •Analyzovaný materiál: S, P, B, tkáně •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu •Referenční rozmezí: S,P 7,0 – 13 nmol/l • dU 9,0 – 36,0 nmol/24h Stopové prvky –CHROM – •Analyzovaný materiál: S, P, B •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu •Referenční rozmezí: S,P 1 – 10 nmol/l • dU 9,6 – 38,5 nmol/24h Stopové prvky –MOLYBDEN – •Analyzovaný materiál: S, P, B •Stabilita: S 2 týdny (+4 °C), 1r (-20 °C ) •Speciální preanalytické požadavky: obecná pravidla pro stopovou analýzu •Referenční rozmezí: S,P 1,0 – 30 nmol/l • dU 208 – 313 nmol/24h METODY STOPOVÉ ANALÝZY PRVKŮ •Referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA) • nedestruktivní • • •Doporučené metody: •ATOMOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE • - PLAMENOVÁ (FAAS) • - S ELEKTROTERMICKOU ATOMIZACÍ (ETA-AAS) • •ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ VÁZANÝM PLAZMATEM (ICP-AES) a její modifikace • METODY STOPOVÉ ANALÝZY PRVKŮ •ATOMOVÁ EMISNÍ SPEKTROMETRIE S INDUKČNĚ •VÁZANÝM PLAZMATEM • •výboj vzniká v proudu argonu – ten protéká plazmovou hlavicí v kruhové indukční cívce kde protéká vysokofrekvenční proud a vzniká elektromagnetické pole • •teplota 5000° - 10000° K • •dochází snadno k vypaření aerosolu vzorku, disociaci, atomizaci a excitaci atomů prvků • •čarovou emisí excitovaných atomů a iontů je tvořeno záření • •záření je monochromatizováno v mřížkovém spektrálním přístroji a detekováno • •multiprvková analýza • •Děkuji za pozornost