Stanovení vitamínů Výsledek obrázku pro vitamíny Vitaminy •Dostupné ve stravě a náš organismus většinou ztratil schopnost je syntetizovat • •Hlavní funkce –Prekurzory biokatalyzátorů – koenzymy, hormony –Antioxidační fce –Metabolismus živin Rozdělení •Vitaminy rozpustné ve vodě –Vit. C –Vitaminy B – thiamin (B1), riboflavin (B2), pyridoxin (B6), cyanokobalamin (B12), kyselina listová (B9), kyselina nikotinová (B3), kyselina pantothenová (B5), biotin (B7) • •Vitaminy rozpustné v tucích –A, D, E, K Vstřebávání vitamínů •Rozpustné ve vodě –Rychle, duodenum •S výjimkou B12 –Žaludek – HCl, trávicí enzymy => uvolnění B12 -> vazba na haptokorin=B12 -> pankreatické enzymy štěpí -> vazba B12 na vnitřní faktor („intrinsic factor“) –Absorpce – ileum, skrze transportér endocytózou do enterocytů •Rozpustné v tucích –Pomaleji, s tuky –A, D, K2 – resorpce bez závislosti na micelách –E, K1 a K3 – transport ke kartáčovému lemu v micelách Rozpustnost Ve vodě V tucích Absorpce Přímo do krve Do lymfy, pak do krve Transport Volně Transportní protein Uskladnění Volně ve vodním prostředí Tuková tkáň, játra Vylučování Ledvinami - Potřeba Pravidelně (1-3 dny) Občas (týdny, měsíce) Rozdíly oproti živinám •Struktura • • •Fce • • •Obsah v potravě –µg až mg Thiamin Folát Biotin Biologická využitelnost •Množství vitaminu •Absorbované množství –Účinnost trávení a transitní čas –předchozí příjem živin –Výživový stav –Ostatní konzumovaná potrava ve stejný čas –Technologická úprava –Zdroj nutrientu Biologická využitelnost •Prekurzory –Provitaminy (β-karoten -> vitamin A (retinol) • •Organický původ •Nestabilita –teplo, světlo, technologické úpravy •Labilní (folát, kys. panthotenová, vit. C, B12, B1, K) •Stabilní (D, E, biotin, niacin, B6, B2) Stanovení vitamínů •Přímé –hladina v krvi, v moči, tkáni •Nepřímé –hladina metabolitu v krvi, moči –měření koncentrace po zátěži substrátem –změna aktivity enzymu po dodání vhodného koenzymu (vitaminu) reakce –produkt reakce katalyzované vitaminem •Saturační testy Nepřímé metody měření saturace vitaminu •Měření sérové, močové nebo tkáňové koncentrace typického metabolitu •Měření koncentrace hromadícího se metabolitu po zátěži substrátem •Zvýšení aktivity enzymu po dodání koenzymu •Stanovení produktu vytvořeného působením vitaminu Saturační testy •Zvýšené vychytávání vitaminu v organismu po jeho podání –Zvýšení jeho obsahu ve tkáních –snížená exkrece v moči – –např. po podání vitaminu C v dávce 10 mg/kg – - jedná-li se o deficit vitaminu – nedochází k jeho vylučování močí Metody stanovení vitaminů •Mikrobiologické testy •Chemické postupy •Enzymatické testy •Imunoanalýza •Separační metody Chemické metody •Bez předchozí separace jsou použitelné omezeně –čisté a koncentrované vzorky (potravinářské nebo farmaceutické) •chybí specifita a sensitivita pro kvantitativní stanovení vitaminů v biologických vzorcích –obsahují často řadu neznámých interferentů •nejsou vhodné ani pro diferenciaci mezi vitamíny Enzymové metody •Využití jejich funkce jakožto koenzymů •Hlavně při stanovení aktuálního stavu saturace organismu vitaminy •Stanovuje se aktivita enzymu s a bez aktivace přídavkem koenzymu (vitaminu) –sledováním změn koncentrace substrátů nebo produktů •často z plné krve nebo v erytrocytech, mohou být měřeny na automatických analyzátorech •Nevýhodou je komplikovaná standardizace, nestabilita enzymů během skladování a interference Imunochemické metody •Zahrnují specifické protein-vázající postupy •Snadno proveditelné v biologických matricích •Snadná automatizace •Kompetitivní reakce –Značení: izotopové, fluorescenční –Př. vitamín B12, folát •Enzymoimunoanalýzy –Volný vitamin kompetuje s vitaminem značeným enzymem o vazbu na protilátku –př. pyridoxin Imunochemické metody •Problémy –Zkřížené reakce s ostatními modifikacemi vitaminu •Výhoda –krátká doba analýzy –dobrá dostupnost –instalace na random access automatických analyzátorech Separační techniky •Dělení a identifikace v jednom běhu řadu vitamínů a jejich derivátů •HPLC/UVD; FLD; ED; MS •LC-MS –přispívá k informacím o struktuře, velmi sensitivní •CE – mikroemulzní elektrochromatografie •CE-MS –vhodný postup vysoce citlivého stanovení některých vitaminů ve složitých matricích •GC a TLC méně časté •Imunoafinitní chromatografie je využívání k čištění a zakoncentrování vzorků Příklady Stanovení vitamínů A,E •Preanalytika –Vit. A = tma (UV záření); -20°C –Vit. E = deproteinace + antioxidační agens + vnitřní standard; -20°C •deproteinace, extrace hexanem, odpaření organické fáze v proudu dusíku, odparek rozpustit v mobilní fázi, nástřik na kolonu •Dělení HPLC, detekce fluorimetricky (vit A 324 nm-> 470 nm); (vit E 298 nm -> 325 nm) Vitamin A Retinol Retinal Kys. retinová β-karoten Zdroje (DDD ~ 1 mg) •β-karoten – provitamin –Barvené ovoce a zelenina •Retinol –Pouze živočišná strava (především játra, částečně žloutky) Vitamin A •Deficit –Malabsorbce celiakie, poruchy pankreatu –Především v rozvojových zemích – slepota, snížená imunita u dětí •Hypervitaminóza –Teratogenní (nebezpečné u těhotných – neměly by konzumovat játra) Vitamin A •Referenční metoda: LC/MS •Certifikovaný ref. materiál: SRM 986b •Preanalytika –Vit. A = tma (UV záření); -20°C; zabránit hemolýze •Rutinní metody: HPLC, GC Vitamin D Ergokalciferol (D2) Cholekalciferol (D3) Kalcidiol (hydroxyD3) Kalcitriol (1,25-dihydroxykalciferol) Zdroje (DDD ~ 10 ug) •D3 – sluneční záření, ryby, žloutek, játra, mléko, máslo •D2 – kvasinky, droždí Vitamin D •Deficit –Při vývoji rachitis, osteomalacie –V pokročilejším věku osteoporóza •Hypervitaminóza –Hyperkalcémie, kalcifikace měkkých tkání Vitamin D •Referenční metoda: –ID-LC-MS/MS •Certifikovaný ref. materiál: UME CRM 1308 •Preanalytika –Vit. D = tma (UV záření); vzdušný kyslík; -20°C; •Rutinní metody: imunochemicky; HPLC; (dokáže rozlišit jednotlivé formy vit. D= D2, D3); LC/MS (1,25-OH D3) Vitamin D Vitamin E α-Tokoferol Zdroje (DDD ~ 10-12 mg) •Obilné klíčky, slunečnicové semínka, mnadle, lískové ořechy, mák, ořechy, žloutek, rostlinné oleje, maso savců tokoferol chemický název α-tokoferol 5,7,8-trimethyltokol β-tokoferol 5,8-dimethyltokol γ-tokoferol 7,8-dimethyltokol δ-tokoferol 8-methyltokol Vitamin E •Deficit –Snížená živostnost erytrocytů až hemolytická anémie –Funkční změny periferních nervů –Myopatie, retinopatie, nekróza jater •Hypervitaminóza –GIT obtíže, únava, bolest hlavy, horší vstřebávání vitamínu K, porucha fce gonád Vitamin E •Referenční metoda: HPLC •Certifikovaný ref. materiál: SRM 986b •Preanalytika –Vit. E = tma (UV záření); -20°C; zabránit hemolýze; deproteinace; přídavek antioxidačního činidla •Rutinní metody: •HPLC, GC Vitamin K Vitamin K1 Vitamin K2 Vitamin K3 Zdroje (DDD ~ 90-120 ug) •K1 – listová zelenina brokolice, špenát, salát •K2 – sýr, maso, tvaroh, játra, žloutky, tuk, natto •K3 – vyrábí se synteticky, doplněk stravy v krmivech Vitamin K •Deficit –Poruchy srážlivosti krve (u novorozenců může být život ohrožující) –Osteoporóza •Hypervitaminóza –Není známa Vitamin K •Referenční metoda: není •Certifikovaný ref. materiál: není •Rutinní metody: nestanovuje se •RUO metody: K1 HPLC – FLD (postkolonová redukce Zn), K1+K2 HPLC-chemiluminiscence, •K1+K2 LC-APCI-MS • B1 thiamin Zdroje (DDD ~ 1,1-1,5 mg) •Droždí, otruby, játra, ovesné vločky neloupaná rýže, ořechy, pohanka, klíčky •Alkohol inhibuje aktivní transport do enterocytů (pasivní > 5mg/den zachován) •Deficit –Beri – beri (slabost) •Anorexie, dyspepsie, únava •Suchá forma: postihnutí periferních nervů, parézie až paralýza •Mokrá forma: otoky, dušnost, hepatomegalie, tachykardie, selhání srdce, laktátová acidóza •Hypervitaminóza –Není známá B1 thiamin B1 thiamin •Referenční metoda: není k dispozici •Certifikovaný ref. materiál: není k dispozici •Preanalytika –Vit. B1 = tma (UV záření); •Rutinní metody: • HPLC-FLD B2 riboflavin Zdroje (DDD ~ 1,4-1,8 mg) •Droždí, játra, ledviny, vejce, mléko •Rostlinné zdroje – kakao, ořechy (vegetariáni a vegani musí často suplementovat) •Deficit –Zánět ústních koutků, rtů, jazyka, spojivek, •Dlouhodobě vede k atrofii •Hypervitaminóza –Není známá B2 riboflavin B2 riboflavin •Referenční metoda: není k dispozici •Certifikovaný ref. materiál: není k dispozici •Preanalytika –Vit. B2 = tma (UV záření); Rutinní metody: HPLC-FLD, LC-MS B6 pyridoxin Zdroje (DDD ~ 1,4-1,8 mg) •Játra, vepřové maso, makrely, vejce, droždí, pšeničné klíčky, celozrnné pečivo, banány, ořechy, semínka, pohanka, otruby, maso Pyridoxol Pyridoxal Pyridoxamin B6 pyridoxin •Deficit –Při zvýšeném výdeji (těhotenství, sportovci s vysokým příjmem masa, alkoholismu, dialýza) •Neurologické sysmptomy •Hypochromní sideroblastická anemie, zápaly očních a ústních koutků •U novorozenců mentální retardace, defomity skeletu, trombózy, osteoporóze, poruchy vidění •Hypervitaminóza –Není známá B6 pyridoxin •Referenční metoda: není k dispozici •Certifikovaný ref. materiál: není k dispozici •Preanalytika –Vit. B6 = tma (UV záření); •Rutinní metody: • HPLC-FLD B9 – folát, kys. listová Zdroje (DDD ~ 200-300 ug) •Listová i další zelenina, droždí, vnitřnosti, ořechy, celozrnné obilniny, ovoce B9 – folát, kys. listová •Deficit –Megaloblastová anémie, trombocytopenie –Defekty neurální trubice plodu –Kardiovaskulární onemocnění (hyperhomocysteinémie) –Deprese •Hypervitaminóza –žaludeční potíže, vysoké dávky můžou maskovat některé příznaky nedostatku v B12 B9 – folát, kys. listová •Referenční metoda: není k dispozici •Certifikovaný ref. materiál: není k dispozici • •Rutinní metody: imunochemicky B12 kobalamin Zdroje (DDD ~ 2,5 ug) •Játra, ledviny, maso, ryby, žloutek, mléčné výrobky •Rostlinné zdroje – pouze malé množství u fermentovaných potravin B12 kobalamin •Deficit –Velké zásoby v játrech (5-10 let) – projeví se opožděně –Makrocytární anémie, neurologické poruchy (nedostatečná syntéza myelinu), perniciózní anémie •Hypervitaminóza –Není známá •Referenční metoda: není k dispozici •Referenční materiál: NIBSC 03/178 •Rutinní metody: Imunochemie B12 kobalamin Vitamin C kys. askorbová Zdroje (DDD ~ 80-90 mg) •Citrusy, paprika, brambory, jahody, šípky, černý rybíz, křen, ranná cibule, kysané zelí Vitamin C kys. askorbová •Deficit –Únava, prodloužená rekonvalescence, zhoršení hojení ran, kurděje (skorbut) •Hypervitaminóza –Nadměrné užívání suplementů může vést k tvorbě oxalátů (konverze cca 1 % vitC -> lithiáza) –Interference při některých oxidoredukčních biochemických testech Vitamin C kys. askorbová •Referenční metoda: HPLC •Certifikovaný ref. materiál: SRM970 •Nestabilní – snadná oxidace na oxalovou kyselinu (okyselení, deproteinace, přídavek red. činidla, -70°C) •Rutinní metody: HPLC-UV, HPLC-CE • Vitamin C kys. askorbová Vitamin C kys. askorbová Děkuji za pozornost •