PATOLOGIE IV MATULOVÁ KVĚTOSLAVA ÚPA FN BRNO BARVENÍ POJIVOVÉ TKÁNĚ HISTOLOGICKÁ BARVIVA A PRINCIPY BARVENÍ ZNÁZORNĚNÍ AMYLOIDU IMUNOHISTOCHEMIE – METODY PRŮKAZU VÝZNAM IMUNOHISTOCHEMIE U DIAGNOSTIKY TKÁNÍ A BUNĚK, PREDIKTIVNÍ MARKERY BARVENÍ POJIVOVÉ TKÁNĚ Pojivová tkáň • původ v mezenchymu – vývojově první pojivová tkáň , která vzniká v oblasti těla zárodku – vycestováním bb ze zárodečných listů • morfogenetické procesy- kondenzace, proliferace, apoptóza, migrace, tvorba mezibuněčné hmoty, • stavební princip – rozvoj mezibuněčné hmoty- různé typy vláken a základní hmotu • tvar, fce, složení mezibuněčné hmoty – pojiva : – vazivo, chrupavka, kost, (sklo., zubovina, cement) - pojivo s tekutou mezibuněčnou hmotou – krev a míza složení a vlastnosti plasticita – např. vznik kosti z chrupavky či vaziva - např. nahrazení kostní dřeně kolagenním vazivem regenerace – řídké kolagenní vazivo, kostní tkáň - zralá chrupavka – omezena kontakt – migrace odolnost – tah –kolagen ve šlachách tlak – glykosaminoglykany v chrupavce tvrdost – anorganické krystaly přenášení síly - pevné a pružné kolagenní a elastické vazivo pevná opora – kostní tkáň Buňky vazivo chrupavka kost bb krvetvorné bb endotelové chondroblast lipoblast myoblast chrupavka kostadipocyt osteoblastfibroblast mesenchymová buňka vazivo, vazy, vazivová pouzdra šlachy sval mezibuněčná hmota – vlákna – základní amorfní substance vazivo a chrupavka VAZIVO buňky – fixní a volné vlákna: kolagenní – např. kůže, šlachy, vazy elastické – vazy retikulární – opora LEU, krvetorných bb v KD, mízních uzlinách, slezině, fce: stavební podpora mechanická ochrana výživa imunita hojení reparace CHRUPAVKA hyalinní – kostra plodu, konce žeber, kloubní hlavice, skelet hrtanu, průdušnic a bronchů - kolagen II elastická – pružná – ušní boltec, hrtan, stěna cév - kolagen II vazivová – svazky kolagenních vláken (I) - plotenky, disky, menisky - neobsahují cévy – výživa difuzí - nulové hojení Kost mineralizovaná pojivová tkáň vzniká procesem zvaným osifikace osteoblastů -produkují kostní matrix -kolagen I, glykoproteiny, proteoglykany osteocyty -v kostní tkáni - těla a výběžky v lakunách a kanálcích osteoklasty – kostní makrofágy výměna iontů mezi tělními tekutinami a kostní hmotou – hormony USPOŘÁDÁNÍ KOLAGENNÍCH VLÁKEN •Vláknitá kost – nahodilé uspořádání, hydroxyapatit •Lamelární kost – lamely se střídají s vrstvami kost.bb ◦ kompaktní - hutná ◦ trámčitá – houbovitá, spongiózní •Na kostru se upínají svaly a vazy •povrch – vazivový obal periost •vnitřní povrch - endos barvící metody - Hematoxylin-eozin extrakt z kampeškového dubu (Haematoxylon campechianum), patří mezi bazická (jádrová) barviva nebarví přímo - oxidace na hematein přidávají se oxidační činidla (jodičnan sodný) vzdušný kyslík (na vzduchu cca 1 měsíc) hematein má slabou afinitu ke tkáním - použít mořidla barví barevný lak hemateinu kamencové hematoxyliny: odvozené od kamence hlinitoamonného, jádra – modrá železité hematoxyliny: odvozené od kamence železitoamonného, jádra - hnědočerně Eosin vzniká působením bromu na fluorescein Barvení cytoplasmy, kolagenu a svalových vláken. Struktury, které se snadno barví eosinem, se označují jako eosinofilní. Eozinů existuje několik druhů, liší se svou rozpustností, chemickým složením a také barvou: bromeosiny – eozin žlutý, červený jodeosiny – erytrosiny Hematoxylin-eozin 1. Odparafínování 3. Odvodnění xylen 1- 5 min. xylen 2- 5 min. xylen 3- 5 min. 96% alkohol 1- 5 min. 96% alkohol 2- 5 min. H2O-praní 30 s. 96% alkohol 1-5 min. 96% alkohol 2- 5 min. 2. Barvení 4. Projasnění Mayerův hematoxylin- 10 min. H2O-modrání- 5 min. Eozin- 20 s. H2O-praní- 1 min. xylen 1- 5 min. xylen 2- 5 min. xylen 3- 10 min. 5. Montování Výsledek jádra buněk modře vazivo růžově svalstvo červeně fialově erytrocyty oranžově chrupavka modře HE, močový měchýř Weigert van Gieson Barvící metoda, která nám umožňuje barevně odlišit kolagenní vazivo od svalové tkáně. K barvení jader se používá železitý hematoxylin (jádra), dobarvujeme kyselým fuchsinem (kolagenní vlákna) kyselinou pikrovou (cytoplasma buněk a svalovina). výsledek: jádra modročerně až černohnědě kolagenní vlákna třešňově červeně svaly žlutě erytrocyty žlutě Massonovy trichromy K odlišení kolagenního vaziva od hladké svaloviny. Žlutý Massonův trichrom: Barviva: Harrisův hematoxylin, eozin, šafrán Výsledek barvení: jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené Modrý Massonův trichrom Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá cytoplasma světle růžová kolagenní vlákna modrá svalovina červená Zelený Massonův trichrom Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin světlá zeleň oranž G Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá cytoplasma okrová kolagenní vlákna zelená svalovina červená erytrocyty oranžové Barvení -AZAN je přehledné histologické barvení pro zvýraznění vaziva barviva: azokarmín anilínová modř oranž G Svalstvo – červené Jádra tmavě červená Ery oranžové Kolagení vazivo - modré Peyerovy pláty ilea obarvené metodou AZAN Průkaz elastických vláken K barvení elastických vláken se používá např. rezorcin-fuchsin, orcein, aldehydový fuchsin, často v kombinaci s přehledným barvením. Impregnační metody vysrážení solí těžkých kovů (nejčastěji stříbra) na některých buněčných, případně i mimobuněčných strukturách. Tmavá depozita kovu pak mikroskopicky vidíme v místě proběhlé redukční reakce. Dle metody Gömöry se barví černě retikulinová kostra tkáně. Tukové vazivo metoda barviva výsledek HE kamencový hematoxylin a eosin hematoxylin – bazofilní struktury-modře (jádro, jaderko, ribozomy) eozin – acidofilní složky –ružově (cytoplasma, hemoglobin, svalovina, kolagenní vlákna) cílené znázornění vazivových vláken kolagenní vlákna anilinínová modř kolagenní vlákna modrá pikrosiriová červeň kolagen červeně polarizované světlo – kolagen I – červená až žlutá barva, kolagen III – zelená barva elastická vlákna orcein červeno-hnědě aldehydový fuchsin elastin- fialově resorcin-fuchsin hnědo-fialově až modro-černě retikulární vlákna AgNO3 argyrofilní v. – černá, kollagenní vlákna I – hnědo-šedá znázornění buněk i kolagenních vláken pojiv AZAN azokarmín, oranž G, anilínová modř jadra- červěně, cytoplazma-oranžová, kolagen-modrý, svalovina- červená M. trichrom modrý železitý hematoxylin, kyselý fuchsin, anilininová m. jadra- hnědočerná, svalovina-červená, kolagen-modrý M. trichrom zelený železitý hematoxylin,světlá zeleň, oranž G jadra- hnědočerná, svalovina-oranžová, kolagen zelený Weigert van Gieson železitý hematoxylin, pikrofuchsin jadra- hnědočerná, kolagenní vazivo- červeně, sval a ery - žlutě Histologická barviva a principy barvení Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, - mají stejný index lomu Běžná světelná mikroskopie - založena na použití barvicích metod Barviva jsou látky- absorbují světlo určitých vlnových délek Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit HISTOLOGICKÁ BARVIVA A PRINCIPY BARVENÍ Barviva Barvivo = látka, která absorbuje světlo určité vlnové délky. Rozlišení jednotlivých struktur- afinitu k různým barvivům Důvodem odlišné barvitelnosti = rozdílné fyzikálně-chemické vlastnosti (elektrostatické vazby) Molekuly barviv - vodíkové můstky - intermolekulárních van der Waalsových sily - iontovou či kovalentní chemickou vazbu Color Index- C. I. 75290, C. I. 45380 Histologická barviva Zásaditá – bazická- jádrová: bazofilní struktury (jaderný chromatin, ribosomy) hematoxylin, jádrová červeň, methylenová modř, toluidinová modř, thionin, krystalová violeť Kyselá –acidická-plasmatická: acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna) eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin Neutrální barviva - směs kyselých a bazických barviv. pH 7. Amfoterická barviva - obsahují ve své molekule aniontové a kationtové struktury. Jejich reakce závisí na pH. Barviva podle původu: Přírodní: hematoxylin, karmín, orcein, šafrán Syntetická Barvení podle způsobu aplikace §Progresivní – tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se proces přeruší §Regresivní – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní tzv. diferencováním. §Sukcedánní – několik barviv po sobě, každé barvivo barvit jinou část tkáně §Simultánní – více barviv současně, každé barvivo barvit jinou část tkáně § Adjektivní - barvení prostřednictvím mořidla, které se váže na tkáň Barvení podle výsledků barvení Ortochromatické – složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivo Metachromatické – jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě barevných tónech. Např. barvení methylenovou nebo toluidinovou modří. Jaderný chromatin se barví modře (ortochromaticky), matrix chrupavky, granula žírných buněk a muciny se barví červenofialově (metachromaticky), metachromatická barviva jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř Polychromatické- více barviv např. jaderné barvení (hematoxylin) a dvě dobarvení (Oranží G a EA polychromem) Difúzní – barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě Výběrové – barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá Přehledné barvicí metody Obarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně. 1. Hematoxylin – eosin 2. Massonovy trichromy Podle zbarvení vaziva: a) žlutý b) zelený c) modrý 3. Weigert van Gieson 4. AZAN Selektivní metody § v preparátu vyselektuje a označí pouze některé struktury § přehled o přítomnosti retikulárních či elastických vláken § přítomnost kyselých mukopolysacharidů nebo glykogenu § skupiny speciálních barviv Přehled barviv a struktur, které se jimi obarvují PAS – barví polysacharidy Mucikarmín - barví hlen Orcein - barví elastická vlákna červeno-hnědě Alciánová modř – kyselé mukopolysacharidy do modra Bestův karmín - k průkazu glykogenu v místě s vysokou koncentrací Szpielmayerův hematoxylin - myelinové pochvy Kongo červeň - k průkazu amyloidózy Olejová červeň - neutrální lipidy Sudanová čerň - neutrální lipidy Impregnační metody vysrážení solí těžkých kovů na některých buněčných i mimobuněčných strukturách Tmavá depozita kovu pak mikroskopicky vidíme v místě proběhlé redukční reakce. Impregnační metody Dle metody Gömöry se barví černě retikulinová kostra tkáně. Grocott (prosycování řezů solemi stříbra, které se vyredukují na plísních) plísně se barví černě. barvení podle von Kossy se používá na depozita kalcia (dusičnan stříbrný + Ca + světlo černé sraženiny) znázornění astrocytů dle Hortegovy metody -astrocyty se impregnují černě nervové fibrily, nervová zakončení, neuroglie, astrocyty můžeme impregnačně prokázat dle Bielschowského, Goldiho metodou a Bodianovou metodou. průkaz melaninu založena na redukci stříbra nebo zlata různými látkami uloženými v cytoplazmě melanin a jiné argentafinní látky se barví černě Grocott -průkaz plísní Hemosiderin, Perls Tkáňové řezy -kyselina chlorovodíkova - denaturují vazbu bílkovin na molekuly hemosiderinu - uvolňování iontů železa (3+). - ionty železa se kombinují s ferokyanidem draselným za vzniku ferokyanidu železitého - modrým pigmentem PAS reakce - využívá vzniku aldehydů při oxidaci polysacharidů kyselinou jodistou. Vznikající aldehydy reagují s Schiffovým reagens a vytváří komplex s fialově červeným zbarvením. Schiffovo činidlo je vodný roztok fialovočerveného barviva fuchsinu, ke kterému se přidává hydrogensiřičitan nebo siřičitan. Pokud hotové Schiffovo činidlo přijde do kontaktu s aldehydovou skupinou, siřičitan se od fuchsinu oddělení a roztok se zbarví. Barvení bakterií a fibrinu Barvení podle Gramma v tkáňových řezech rozliší G+ a G- bakterie. Pro průkaz fibrinu lze použít Gramovo barvení s diferenciací Anilínem. barvení podle Ziehl- Neelsona K průkazu acidorezistentních bakterií barvení podle Ziehl- Neelsona (barví karmínově mykobakteria) Mykobakteria - vysokým obsahem lipidů ve stěně Barvení Warthin-Starry Warthin-Starry: tmavě hnědě barví některé bakterie (např. spirochety, Helicobacter). Karmín z těl hmyzu červce nopálového z Peru druhu opuncie, na kterých hmyz rodu Dactylopius žije pěstuje se v Mexiku, Guatemale, Chile, Bolívii a dalších jihoamerických zemích barví červeně mimo jiné jádra a glykogen (bazické barvivo). Roztok karmínu v kyselině octové je acetokarmín. Brouček? (E120) Orcein fialové přírodní barvivo, které se vyskytuje v některých druzích lišejníků Šafrán extrakt z blizen šafránu kyselé barvivo na kolagen Amyloid § je bílkovina – proteinové fibrily § různé dle typy amyloidu § přeměna uspořádání proteinu z α-helixu na ß-skládaný listu § ßeta listy proteinů, nebo proteinových fragmentů – se k sobě váží - tzv. amyloidová fibrila § odolná vůči degradaci enzymy § při chorobných stavech ukládá v mezibuněčném prostoru § proteiny, ze kterých vzniká amyloid- fyz. vyskytují v těle § prekurzory amyloidu - sérový amyloid A, -lehké řetězce imunoglobulinů. ZNÁZORNĚNÍ AMYLOIDU Amyloidóza § heterogenní skupina chorob § porucha struktury proteinů § z původně rozpustné formy proteinů – extracelulární proteinové agregáty – amyloid § ke změně proteinu dochází v buňce - vláknitý materiál vyloučen do intersticia tkání § minoritní nefibrilární složka – P komponenta (SAP), glykosaminoglykany, apolipoprotein E = podpora ukládání fibril do ec. prostoru orgánů § 20 proteinů – amyloid § radioaktivně značený SAP-scintigrafie – monitoring nemoci Diagnóza amyloidózy bioptické vyšetření postiženého orgánu systémová amyloidóza – náhodně odebraný vzorek – podkožního tuku či rektální sliznice genetická analýza – mutace genu pro amyloidogenní protein – není 100% sérum – monoklonální lehké řetězce imunoglobulínů – není 100% diagnóza amyloidózy – první krok identifikace proteinu léčba – dle typy amyloidu Typizace amyloidu IHC – průkaz AA amyloidu - AA amyloidóza průkaz kappa a lambda řetězců - AL amyloidóza imunofluorescence – nefixovaná tkáň hmotnostní spektrometrie – limitovaná množstvím amyloidu 5% - bez typizace kappa lambda Důsledky akumulace amyloidu 1. odolný vůči proteolýze 2. nerozpustný ve vodě 3. neimunogenní – nevyvolají zánět 4. toxický 5. celkové množství – i několik kg Klasifikace amyloidózy vrozené získané generalizované lokalizované dle chemického typu amyloidu klinicko – patologické dělení generalizované AL amyloidóza – systémové, 5-10% produkce monoklonálních lehkých řetězců imunoglobulínu - fibrilární komponenta - řetězce λ - často spojena s mnohočetným myelomem - nejčastější typ v Evropě a USA - ledviny AA amyloidóza- sérový amyloidový protein A (SAA) – játry syntetizovaný protein - komplikací dlouhodobě probíhajících zánětlivých procesů – autoimunitní záněty - revmatoidní artritida, Crohnova choroba, psoriáza - ledviny, srdce, játra, GIST Prognóza 1-3 roky lokalizované Amyloid v CNS - Aß amyloidóza – Alzheimerova choroba Endokrinní amyloid – medulární Ca štítné žlázy - neuroendokrinní nádor z buněk Langerhansových ostrůvků Senilní amyloidózy s dominantním postižením srdce - 70. – 80. rok – nemutovaný transthyretin (ATTR amyloidóza) Amyloidóza dialyzovaných pacientů – fibrily z ß2 mikroglobulínů Ložiskový amyloid – uzly v plících, laryngu, mléčné žláze, močový trakt, jazyk hereditární Hereditární transthyretinová amyloidóza - germinální mutace genu pro transthyretin - ATTR amyloid - transthyretin syntetizován v játrech – transportní protein pro tyroxin a retinol Familiární středomořská horečka – mutace v MEFV genu – koduje pyrin - Araby, Turci, Armény Průkaz amyloidu Konžská červeň = Kongo červeň nebarví pouze amyloid, ale i jiné struktury polarizované světlo – dva indexy lomu - anomální barvy – od bílé, přes žlutou a modrou až k zelené fluorescenční mikroskop – konžská červeň vykazuje autofluorescenci - citlivá metoda, identifikace malých depozit - časná fáze pozn. – Konžská červeň - textilní průmysl – v histopatologii 1884 - Vztah ke Kongu – syntetizace barvy = Berlín – konference o západní Africe HE barvení Amyloidóza ledvin. Amyloid se ve tkáni mikroskopicky projeví jako extracelulární depozita homogenní eozinofilní hmoty. Na snímku jsou patrna depozita amyloidu v kapilárních kličkách. Kongo červeň Amyloidóza ledvin. Amyloid se projeví jako extracelulární depozita homogenní eozinofilní hmoty, která jsou oranžově červená v barvení konžskou červení. Na snímku jsou patrna depozita amyloidu v kapilárních kličkách. Polarizované světlo Kongo červeň Amyloidóza ledvin V polarizovaném světle má navázaná konžská červeň dva indexy lomu. Proto v polarizovaném světle depozita amyloidu vykazují anomální barvy od bílé, přes žlutou a modrou až k zelené. IHC -SAA Protilátky proti amyloidu A Thioflavin T fluorescenční pro buňky propustná amyloidová benzothiazolová sůl optimální koncentrace IHC fluorescence IHC – Aß amyloid Alzheimerova choroba. Přítomnost depozit A-beta amyloidu ve stěnách mozkových a meningeálních cév. Imunohistochemický průkaz Abeta amyloidu ve tkáni - pozitivní jsou jádra neuritických plak a cévní stěna. Kongo červeň Alzheimerova choroba. Přítomnost depozit A-beta amyloidu ve stěnách mozkových a meningeálních cév. Sférická depozita v parenchymu to je jádrem neuritického plaku. Další barvící metody Kongo červeň Methyl violeť Alciánová modř Imunohistochemie – metody průkazu vyšetření exprese makromolekul princip – vazba primární protilátky na epitop antigenu - vizualizace pomocí detekčních systémů hodnocení – lokalizace pozitivity ve tkáni - intenzita reakce - % pozitivní buněčné populace důvod- stanovení diagnózy - určení prognózy vývoje onemocnění - indikace nemocných pro cílenou terapii IMUNOHISTOCHEMIE – METODY PRŮKAZU Antigeny - běžná součást tkání a buněk intermediální filamenta transmembránové proteiny transkripční faktory cizorodé látky - HP, CMV, Epitopy konkrétní oblast antigenu vážou protilátky každá proteinová molekula obsahuje několik epitopů, tzn. několik míst, kam se vážou protilátky. počet epitopů-souvisí s velikostí daného proteinu Protilátky Monoklonální Polyklonální -získané opakovanou imunizací zvířat -silné, obvykle vysoké ředění specifita / senzitivita Analytická senzitivita -schopnost testu detekovat velmi malé množství antigenu - žádné falešně negativní výsledky Analytická specificita -schopnost testu detekovat antigen bez rušení -žádné falešně pozitivní výsledky rozdíl MONOKLONÁLNÍ POLYKLONÁLNÍ Komerčně vyráběné protilátky výrobce zaručuje: diagnostickou využitelnost ověřenou a schválenou Evropa: CE (z francouzského „Conformité Européenne“) – výrobek prošel postupem potvrzování shody - vyhovuje požadavkům evropských směrnic USA: FDA (z anglického „Food and Drug Administration“) - vládní agentura zodpovědná za kontrolu a regulaci potravin, léčiv, lékařských přístrojů IVD (In vitro diagnostika)- musí vyhovovat relevantním požadavkům uvedeným v nařízení vlády č. 56/2015 Sb. IVD musí absolvovat odpovídající způsob posouzení shody, na základě něhož je vydáno ES prohlášení o shodě a každý výrobek opatřen označením CE. Institut pro testování a certifikaci je členem TEAM-NB a signatářem etického kodexu Code of Conduct. Je monoklonální protilátka vždy lepší? Metody IHC • Přímá primární Ab značená přímo (enzymem, fluorochromem..) nutná dostatečná koncentrace antigenu ve tkáni • Nepřímá dvojstupňová neznačená primární protilátka a značená sekundární • Nepřímá třístupňová signál zesílen vazbou streptavidin-biotin nebo avidin-biotin Metody IHC • Přímá primární Ab značená přímo (enzymem, fluorochromem..) nutná dostatečná koncentrace antigenu ve tkáni Metody IHC • Nepřímá dvojstupňová neznačená primární protilátka a značená sekundární Metody IHC • Nepřímá třístupňová signál zesílen vazbou streptavidin-biotin nebo avidin-biotin Nepřímá IHC metoda Chromogeny Navázanou primární protilátku nevidím Proto se používají k vizualizaci * fluorescenční značky * enzymy a následné použití chromogenu Chromogeny: DAB 3,3’-diaminobenzidine AEC 3-amino-9-ethylcarbazole NBT p-nitroblue tetrazolium chloride Chromogeny enzymy a následné použití chromogenu křenová peroxidáza - HRP Chromogeny: DAB 3,3’-diaminobenzidine Chromogeny enzymy a následné použití chromogenu peroxidáza Chromogeny: AEC 3-amino-9-ethylcarbazole Chromogeny enzymy a následné použití chromogenu AP Chromogeny: NBT p-nitroblue tetrazolium chloride Materiál FFPE - parafinové řezy otisky cytospiny cytobloky nativní materiál Podložní skla povrch skla pro elektrostatickou vazbu vzorků tkání a cytologických preparátů nevyžadují speciální úpravu povrchu garantovaná čistota bez Rnáz vysoká přilnavost redukuje ztrátu tkání omezení barvení pozadí Nutné dodržet skla pro daný IHC systém Podložní skla Tloušťka řezu IHC- P 1 až 3 µm IHC- Frozen 2 až 6 µm Výběr testovací tkáně Low expresor (nastavuje senzitivitu) High expresor (máme správnou Ab) Negativní kontrola (nastavuje specifitu) Rutina: Multiblok 1 – tonzila, appendix Multiblok 2 – jícen, játra Multiblok 3 – prostata, placenta, čípek Multiblok 4 – plíce, ledvina, kůže, žaludek Multiblok 5 – thymus, štitná žláza, vejcovod Multiblok 6 - nádorová tkáň s různou expresí HER2 Preparáty - kontrolní tkáň Preparáty – vyšetřovaná tkáň Postup IHC vyšetření Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) tissue Postup IHC vyšetření Demaskování antigenních epitopů - fixovaný materiál - zesíťování aldehydovou fixací - proteolytické trávení - tepelně indukované odhalení epitopu HIER ˚ EDTA pufr (pH 9) ˚ citrátový pufr (pH 6) Čím vyšší pH pufru, tím účinnější je demaskování a kratší potřebný čas vaření Různé antigeny vyžadují různé způsoby odhalení antigenu HIER retrieval pH 6/98°C/20 - 40 min pH 9/98°C/20 - 40min pH 6/121°C/4 min pH 9/121°C/1 min • pH 6/ 98-100°C /20 - 40 min • pH 9/ 98-100°C /20 - 40min • pH 6/121 - 124°C/4 min • pH 9/121- 124°C/1 min Blokování endogenní enzymatické aktivity blokace potenciální endogenní aktivity enzymu endogenní peroxidázová aktivita – fyziologicky přítomna v mnoha bb po fixaci – funkční falešně pozitivní výsledek blokace: nadbytkem substrátu pro příslušný enzym např. peroxid vodíku pro peroxidázu lavamizol pro AP Primární protilátka - RTU vs. koncentrát Ready To Use se rovnou kapou na skla s tkáňovými řezy Koncentráty se ředí diluentem Nejlepší ředění se stanovuje empiricky – závisí na typu odhalení epitopu, použitém polymeru… Inkubace s primární protilátkou správná koncentrace protilátky vhodné prostředí – teplota, pH a iontová síla pufru ve kterém je Ab naředěna vlhkost inkubačního prostředí doba inkubace rce antigen-protilátka – slabé vazebné interakce – správné prostředí po celou dobu Detekce vazby primární protilátky Jednokrokové detekční systémy: sekundární protilátky – polyklonální - váží se na více epitopů primární Ab, která je pro něj Ag - vyráběny proti myším a králičím Ig -polymery – sekundární Ab a molekuly enzymu Vícekrokové detekční systémy: sekundární Ab označeny – biotinem - následuje enzym ozn. avidinem (streptavidin) - biotin-avidinový můstek Aplikace substrátu a kosubstrátu substrát (H2O2) kosubstrát (DAB) Inkubační roztok s H2O2 (substrát) + chromogen (DAB) Peroxidáza (HRP) katalyzuje rozštěpení H2O2 na vodu a kyslík. DAB je oxidován a následně polymerizuje na hnědou sraženinu v místě, kde byla navázána protilátka Dobarvení jader, montování Dobarvení jader hematoxylinem (Mayerův, Harrisonův, Gillův) Odvodnění řadou alkoholu Projasnění xylenem Montování do média Hodnocení preparátu Výsledek IHC Detekce membránového proteinu Detekce cytoplazmatického proteinu Detekce jaderného proteinu Chromogen DAB 3,3’-DIAMINOBENZIDINE AEC 3-AMINO-9-ETHYLCARBAZOLE POZOR NA ALKOHOL A XYLEN! NBT p-nitroblue tetrazolium chloride Pozor na alkohol a xylen! Dual IHC • malé množství tkáně • přehlednost Spíše pro automat: chromogranin/synaptofyzin AFP + Ki67 CD3 + CD20 ER + E-cadherin TTF1 + CK7 TTF1 + Napsin A Automatizace Význam IMUNOHISTOCHEMIE u diagnostiky tkání a buněk, prediktivní markery VÝZNAM IMUNOHISTOCHEMIE U DIAGNOSTIKY TKÁNÍ A BUNĚK, PREDIKTIVNÍ MARKERY Princip Stanovujeme: Proteiny – včetně glykoproteinů, lipoproteinů, nukleoproteinů, či jiné makromolekuly (glykolipidy, polysacharidy) Specificky označit a zviditelnit reakce antigen (stanovený protein) – protilátka vazba – vizualizace enzym - substrát barevná sraženina v místě stanovovaného proteinu Využití IHC v patologii stanovení diagnózy - odhalit typ tkáně, ze které nádor vychází, určit přesný typ nádoru, určit proliferační aktivitu určení prognózy vývoje onemocnění indikaci k cílené specifické terapii – ERBB2, ALK, PD-L1, ROS1 Hodnocení výsledků Lokalizace pozitivity ve tkáni-buňce exprese v jádrech buněk – např. Ki-67 (stanovení proliferační aktivity nádoru) MyoD1 transkripční faktor (dg rhabdomyosarkomu) receptory pro estrogen (indikace k hormonální terapii u ca prsu) exprese v cytoplasmě- intermediární filamenta desmin (dg nádoru mezenchynálního původu) vimentin (odlišení pojivových bb. od ostatních typů tkání) cytokeratiny (dg epiteliálních nádorů) exprese v organelách – perforin v cytotoxických granulech exprese na buněčné membráně – CD 20 – dg B-lymfomu HER-2 exprese v extracelulárním prostoru – kolagen IV v bazálních membránách glomerulů ledvin Intenzita reakce CD 99 semikvantitativní hodnocení 0, 1+, 2+, 3+ Ki 67 -tonzila Název proteinu je odvozen od města Kiel, kde jej identifikovali pomocí monoklonální protilátky číslo 67 odkazuje na umístění původního klonu protilátky v 96 jamkové destičce Kollagen IV kolagen IV v bazálních membránách glomerulů ledvin CD 20 CD20 u buněk zárodečných center a buněk folikulárního pláště tonzily CK AE1/3 Silná cytoplazmatická exprese cytokeratinů nádorových buněk karcinomu plic AE1 detekuje vysokomolekulární cytokeratiny 10, 14, 15 a 16 a nízkomolekulární cytokeratin 19. AE3 detekuje vysokomolekulární cytokeratiny 1, 2, 3, 4, 5 a 6 a nízkomolekulární cytokeratiny 7 a 8 Nereaguje na cytokeratiny 17 a 18 intenzita reakce - % procentuální zastoupení nádorové populace exprimující stanovovaný antigen např.: receptory pro estrogen u nemocných s karcinomem mléčné žlázy proliferační marker - Ki67 exprese MYC proteinu ( diagnostika lymfomů) abnormální lokalizovaná pozitivita hodnocení abnormální lokalizace pozitivity. Silná jaderná a cytoplazmatická pozitivita ALK proteinu buněk velkobuněčného anaplastického lymfomu Diagnostické využití indikace IHC vyšetření – v několika vlnách typizujeme např nádorový proces – primární či metastatický karcinom nebo sarkom např. určíme zda jde o lymfom – CD 45 B lymfom – CD 20, CD 79, T –lymfom – CD 3 konkrétní lymfom – B lymfom exprese bcl2 a CD 10 (folikulární lymfom) cyclin D1 a SOX 11 (lymfom z buněk pláště) Prognostické využití Stupeň proliferace – Ki67 – exprimován v celém průběhu buněčného cyklu detekce mikrometastáz – spádové uzliny příznivý prognostický znak – velkobuněčný anaplastický lymfom – exprese molekuly ALK Indikace k cílené terapii onkologicky nemocných exprese hormonálních receptorů (estrogen, progesteron) – terapie tamoxifenem exprese CD20 u B lymfomu – terapie protilátkou anti-CD20 rituximab exprese ERBB2 – mléčná žláza , žaludek terapie protilátkou Trastuzumab léčba – nízkomulárními inhibitory nebo monoklonálními protilátkami Her2 Prediktivní markery = receptor 2 pro lidský epidermální růstový faktor transmembránový receptor, který váže růstové signály z okolí buňky Význam u karcinomu prsu, karcinomu žaludku. Stanovení exprese proteinu Her2 (a následná analýza genu ERBB2) HER2 2+ ověřit ISH ALK ALK patří mezi inzulinové receptory protein má význam při neuronální buněčné diferenciaci a regeneraci, formování synapsí.. V maligním procesu může dojít ke zlomu v genu ALK a fúzi s jiným partnerem à zvýšená exprese proteinu Aberantní exprese proteinu ALK se vyšetřuje u nemocných s nemalobuněčným adenokarcinomem plic V případě pozitivního IHC (a potvrzené aberace genu ALK) à léčba crizotinibem PD-L1 (CD279) správná fce imunitního systému = souhra mezi inhibičními a stimulačními mechanizmy Inhibiční mechanizmy = nepostradatelná složkou imunitního systému PD-L1 je ligand, který se váže k PD-1 receptoru PD-L1 hraje roli v inhibici aktivace a proliferace T buněk Nádorové buňky však mohou inhibiční mechanizmy zneužít k úniku před imunitní reakcí a tím podpořit vznik a rozvoj nádorového onemocnění. Blokádou PD-1/PD-L1 dochází k utlumení inhibičního signálu –obnovena činnost imunitního systému Hodnocení PD –L1 Tumor proportion score = procento nádorových buněk s intenzitou ≥ 1+ ku celkovému počtu viabilních nádorových buněk TPS<1% není exprese PD-L1 TPS 1-49% PD-L1 pozitivní TPS > 50% PD-L1 silně pozitivní Hodnocení PD –L1 PD-L1 Léčba - protilátky blokující receptor PD-1/PD-L1 Keytruda (pembrolizumab) melanom, rakovina kůže nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), typ rakoviny plic klasický Hodgkinův lymfom, rakovina bílých krvinek rakovina močového měchýře a močový trakt rakovina postihující hlavu a krk známá jako karcinom skvamózních buněk hlavy a krku (HNSCC) Využití ve specifických indikacích Léčba - protilátky blokující receptor PD-1/PD-L1 Tecentriq (atezolizumab) Tecentriq je lék proti rakovině pro léčbu urotheliálního karcinomu (rakovina močového měchýře a močového systému) a typu rakoviny plic nazývaného nemalobuněčný karcinom plic. Přípravek Tecentriq se používá, pokud jsou tyto rakoviny pokročilené nebo se rozšířily do jiných částí těla. U urotheliálního karcinomu je léčivý přípravek určen pro pacienty, kteří před zahájením chemoterapie s platinou vyzkoušeli léčbu cisplatinou nebo jsou pro ni neakceptováni. Pacienti s nemalobuněčným karcinomem plic by měli mít nejprve chemoterapii a pacienti s určitými genetickými mutacemi (změnami), kteří reagují na cílené léčby, by měli mít tuto léčbu před podáním přípravku Tecentriq. Kryo - IHC Adenokarcinom TTF-1+ Skvamózní karcinom p63+ CK AE 1/3 Kůže CK AE1/3+ Cytospin CA125 Cytoblok barvení: HE, IHC Závěr speciální laboratorní metoda detekce jednotlivých tkáňových antigenů pomocí specifických primárních protilátek. vazba znázorněna barevným produktem účel diagnostickým (vyhledávání a znázorňování antigenů specifických pro určité typy buněk a tkání) prognostickým indikace k cílené léčbě