Metody molekulární cytogenetiky Sekce cytogenomiky, Centrum molekulární biologie a genetiky, IHOK, FN Brno Mgr. Hana Dynková Filková n https://euc-powerpoint.officeapps.live.com/pods/GetClipboardImage.ashx?Id=a6013fc3-dcbb-4a1a-b9af-b 7a0f37ed0da&DC=GEU4&wdoverrides=GetClipboardImageEnabled:true vyšetření, která zkoumají DNA na chromosomální úrovni na základě molekulárně genetických principů n Páry s poruchou reprodukce (víc než rok, SA,..) nZátěž v rodě (VCA,…) n Pacienti s intelektuálním postižením (neurovývojovými poruchami, vývojovými poruchami intelektu), poruchami autistického spektra, vrozenými vývojovými vadami, stigmatizací... n Prenatální indikace z důvodu abnormálního průběhu gravidity (abnormální prenatální screening) nOnkologická onemocnění n Indikace k molekulárně cytogenetickému vyšetření Cytogenetika v medicíně dnes… V ČR jsou cytogenetické laboratoře součástí Oddělení lékařské genetiky (velké nemocnice – Praha, Brno, Olomouc, Ostrava, Plzeň, Hradec Králové, České Budějovice…) •soukromá pracoviště (laboratoře) •20 – 30 cytogenetických laboratoří v ČR… Cytogenetická laboratoř/cytogenetická diagnostika: a) prenatální cytogenetika b) postnatální cytogenetika c) nádorová cytogenetika •Lékařská genetika •Onkologie •Reprodukční medicína •Pediatrie •Kardiologie •Patologie •Kožní •Neurologie •aj Materiál pro cytogenetické vyšetření n nperiferní krev nvzorky různých tkání (biopsie kožní) nbuňky plodové vody, choriových klků, placenty npupečníková krev nbuňky kostní dřeně nvzorky solidních nádorů n -Izolovaná DNA -Suspenze buněk ( jádra interfázní či metafáze) I. Metody molekulární cytogenetiky FISH (fluorescenční in situ hybridizace) detekce balancovaných i nebalancovaných změn 493-04 t(11-14)fotka1 2Lfe-screen-agilent Mnohobarevná FISH – M FISH; detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu Array-CGH - komparativní genomová hybridizace na čipech Agilent´s Human CGH Microarray Kit detekce nebalancovaných změn v celém genomu MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification) detekce nebalancovaných změn OGM(Optical Genome Mapping) detekce balancovaných i nebalancovaných změn v celém genomu citlivost detekované změny materiál metoda (KARYOTYP) 5-10 Mb balancované změny nebalancované změny suspenze buněk (metafázní chromozomy) celogenomová metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace) cca >10 kb balancované změny nebalancované změny suspenze buněk (interfázní jádra, metafázní chromozomy) cílená metoda M FISH (mnohobarevná FISH) 5-10 Mb balancované změny nebalancované změny suspenze buněk (metafázní chromozomy) celogenomová metoda Array CGH (komparativní genomová hybridizace na čipech) cca > 50 kb nebalancované změny (zisky, ztráty) izolovaná DNA celogenomová metoda MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification) > (1bp) 1kb nebalancované změny (zisky, ztráty) izolovaná DNA cílená metoda - vyšetření až 50 sekvencí najednou OGM (Optical Genome Mapping) >500 bp balancované změny nebalancované změny izolovaná DNA celogenomová metoda 493-04 t(11-14)fotka1 2Lfe-screen-agilent I. Metody molekulární cytogenetiky FISH = fluorescenční in situ hybridizace n1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení n1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH) n nHybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy na cytogenetickém preparátu n Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn v interfázních buňkách i v mitózách obr2a obr6-interfáze obr1 Postup FISH Zhotovení kvalitních preparátů 1.Denaturace sondy i cílového místa 2.Hybridizace 3.Odmytí 4.Barvení pozadí 5.Hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu • fluorescenční mikroskop vybavený sadou fluorescenčních filtrů • citlivá ČB kamera • počítač a specifické programové moduly pro aplikace FISH, M-FISH FISH Vybavení lucia FISH : Typy sond nCelochromozomové nCentromerické nSondy subtelomerické nSondy lokus specifické n n Sondy pro jedinečné sekvence: na) plazmidové (500pb-5 kb) nb) kosmidové (20-50 kb) nc) bakteriofág lambda (8-15 kb) nd) YAC klony (50-1000 kb) n typy sond Značení DNA sond nfluorochromy, Texas Red, Spectrum Green, Spectrum Orange, FITC, TRITC SpectrumAqua, SpectrumGold, aj n ( celo15h jedinh FISH : Přítomnost, počet a poloha signálů delece exonu počet signálů translokace Identifikace každého chromozómu pomocí jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5 •referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny každému chromozómovému páru na základě měření vlnových délek Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz - úspěšná hybridizace - finančně nákladné Umožňuje odhalení balancovaných a nebalancovaných ( i kryptických ) přestaveb celého genomu v jednom kroku Mnohobarevná FISH (M FISH) vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednom preparátu Speicher a kol., 1996 (M-FISH), Schröck a kol., 1996 (SKY) nmikroskop vybavený 6 fluorescenčními úzkopásmovými filtry (pro 5 fluorochrómů + DAPI) nSp. Aqua nSp. Green nSp. Gold nSp. Red nF. Red nDAPI n nsnímání jednotlivých fluorochromů, složení obrázku, počítačová analýza - dle kombinace fluorochromů přiřazení pseudobarev Polychroic mirror CCD array placed at primary focus of microscope objective emission or barrier filter fluorescent specimen on slide Mnohobarevná FISH (M FISH) specdapi2 kalab-SKY Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno) M FISH - komplexní karyotyp m banding3 m banding5 Mnohobarevné pruhování (M-banding) § parciální malovací sondy ze specifických oblastí chromozomů § fluorescenční signály jednotlivých sond se podél sledovaného chromozomu částečně překrývají a dochází k jejich kombinaci § umožňuje rozlišení intrachromozomových přestaveb (inverzí) Komparativní genomová hybridizace na čipech (array-CGH) • Efektivní metoda celogenomového screeningu nebalancovaných přestaveb chromosomů během 1 hybridizační reakce • Založena na společné hybridizaci různě značených vzorků DNA (testované DNA a referenční DNA) na DNA mikročip pokrytý fragmenty oligonukleotidů • Ztráta či zisk genetického materiálu v testované DNA je odečten ze spotů vykazující abnormální poměry intenzit signálů . tradiční karyotypování 5-10 Mb array CGH 50-100 kb https://www.agilent.com/cs/promotions/images/CGH-FISHarray2018feb-CGH-Figure-4.0.jpg https://www.agilent.com/cs/library/videoanimation/public/Agilent%20CGH%20-%20D12b.mp4 Array CGH Materiál: • DNA izolovaná z biologického materiálu vyšetřovaného jedince • Prenatální – amniocyty, buňky choriových klků, lymfocyty fetální krve, buňky z tkání potracených plodů (kůže) • Postnatální – lymfocyty periferní krve • Onkologický materiál – nádorové buňky (solidní nádory, hematologické malignity) • DNA referenční (nejčastěji komerční příprava) • do reakce 500-1500 ng DNA dle typu platformy mikročipu • nutná přesná kvantifikace – do reakce shodná množství DNA reference a testované DNA • Kontrola kvality DNA (A260/280, A260/230, integrita DNA) lsca_104b_aCGH Princip array-CGH • Solinas-Toldo a kol., 1997 • vyhází z principu klasické (chromosomální) CGH • nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy) n Array-CGH CGH Původ metody array-CGH Agilent Human CGH Microarray Oligo arrays • 8x15K custom chip • 4x44K 43 kb rozlišení • 2x105K 21 kb rozlišení • 1x244K 9 Kb rozlišení Nové typy – Sure Print G3 Human • 8x60K 41 Kb rozlišení • 4x180K 13 Kb rozlišení • 2x400K 5 Kb rozlišení • 1x1M 2 Kb rozlišení geFeatured6_fig1 rna_microarray_13 HRCGH negativní 8x15K negativní 4x44K del(1)(p36) 2x105K del(1)(p36) del(1)(p36), cca 3 Mb aCGH Analytics Software, Agilent Technologies Array CGH : vyhodnocení Výhody a nevýhody metody array-CGH + Celogenomový screening nebalancovaných submikroskopických chromosomových aberací + Rozlišení dáno parametry použitého mikročipu + Nevyžaduje přítomnost mitóz + Možnost detekce mozaiek (< 30 % dle kvality vyšetření) - Genomová DNA o dostatečné koncentraci a integritě -Není možné detekovat balancované přestavby chromosomů, ani změny ploidie -Vyšší cenové náklady -Zkušenosti s interpretací vzácných nálezů - práce s databázemi, literaturou - Interpretace nálezů CNVs musí probíhat vždy v kontextu s: 1.Fenotyp jedince 2.Vyšetření rodičů -> stanovení původu CNVs (de novo/zděděná CNV od rodiče s normálním/patologickým fenotypem) 3.Informace v databázích genetických variant (UCSC, DECIPHER, DGV...) a o genech v oblasti CNVs (databáze OMIM) 4. Informace v relevantní vědecké literatuře (Pubmed...) Array CGH: ~ 1000-krát větší rozlišení nebalancovaných změn než klasická cytogenetika, ale nedokáže detekovat balancované přestavby chromozomů…!!! •jedná se o speciální formu multiplex PCR, při které se amplifikují MLPA sondy a ne zkoumaná DNA •detekuje změny počtu kopií ( především rozsáhlejších delecí/duplikací ) až 50 specifických sekvencí v jedné PCR reakci •dokáže odlišit sekvence lišící se v jediném nukleotidu; •další aplikace – stanovení SNP, metylace v promotorové oblasti • https://files.mrcholland.com/kb/articles/22/how-does-mlpa-work.mp4 Citlivá: jen 20 ng DNA Specifická: MLPA je schopná odlišit sekvence lišící se v jediném nukleotidu Jednoduchá: MLPA reakci je možné uskutečnit v jedné zkumavce Relativně levná metoda: Kit obsahuje všechny potřebné reagencie, potřebné vybavení je bežnou součástí všech molekulárně-biologických laboratoří MLPA princip Syntetický oligonukleotid 50-60 bp PCR primer Y Hybridizační sekvence PCR primer X vložená sekvence (odlišná pro každou sondu) Hybridizační sekvence M13-derivovaný oligonukleotid 60-450 bp MLPA princip MRC Holland, www.mlpa.com Pacient Kontrola MLPA princip Karyo MM 5+ oříznutý 1971 G-pruhování (5 – 10 Mb) 1986 Molekulární cytogenetika FISH (100 kb) 1997 array-CGH (oligo 0,06 kb) 2000 NGS Od chromozomů …k analýzám DNA … Vývoj nových cytogenetických technik pro detekci chromozomových změn n 2023 Optical mapping Existuje univerzální metoda, která by nahradila vše? https://bionano.com/videos/saphyr-ogm-technology-overview-video/ Co umí optické genomové mapování (OGM) Optické mapování genomu - postup Bionano Genomics (https://bionanogenomics.com/technology/platform-technology/) reference vzorek Detekce chromozomových aberací pomocí optického mapování OGM - příklad translokace (13;20)(q32;p13) Dremsek et al. 2021 VÝSLEDKY •kluk, nar. 2021, symptomatická epilepsie a epileptický syndrom, febrilný status epilepticus •rodiče zdraví nepříbuzní • Karyotyp: 46,XY,t(5;8)(q31;q13) FISH: t(5;8) aCGH: del(5)(q33.2q34) - GABA receptory dup(8)(q24.13) del(5)(q33.2q34) - GABA receptory 4x180K SurePrint G3 CGH+SNP Agilent Pacienti s definovanou strukturní změnou – Proband 3 Obrázok, na ktorom je text, náčrt, kresba, typografia Automaticky generovaný popis Obrázok, na ktorom je temnota, pestrofarebnosť, svetlo, snímka obrazovky Automaticky generovaný popis dup(8)(q24.13) VÝSLEDKY Proband 3 del(5)(q33.2q34) dup(8)(q24.13) t(5;8) VÝSLEDKY Proband 3 del(5)(q33.2q34) dup(8)(q24.13) t(5;8) t(5;8); del(5)(q33.2q34) dup(8)(q24.13) ogm[GRCh37]t(5;8)(q34;q21.11)(154,464,548~162,283,811;76,370,347~76,382,253) ogm[GRCh37] 5q33.2q34(154464548_162276558)x1 ogm[GRCh37] 8q24.13(125936927_127239385)x3 II. Využití metod molekulární cytogenetiky v klinické genetice dle typu aberací Detekce numerických změn: aneuploidie (monozomie, trizomie,…) Detekce strukturních změn: -balancované: inverze, reciproké translokace, robertson. translokace,… - nebalancované: -Mikrodelece (mikrodeleční/mikroduplikační syndromy, CNV,..) -Subtelomerické přestavby -Nebalancované translokace -Marker chromozomy -Izochromozom; ring chromozomy,… Detekce LOH, UPD Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Downův syndrom 47,XX/XY,+21 +21 fish +21karyo FISH Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Klinefelterův syndrom n47,XXY nvysoká postava, porucha růstu vousů, ženská distribuce podkožního tuku, PMR 3 klein Klinefelter FISH Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Turnerův syndrom n45,X nchybí jeden chromozom X n1/2500 dívek n95 % SA nmalá postava, chybí vaječníky až sterilita Turner turner FISH nvýskyt v populaci s četností asi 1 : 500 nneovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v populaci mentálně retardovaných pacientů) nvýznamná příčina sterilit u přenašečů nv důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece) nMetoda FISH, karyotyp recip_gametes Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: balancované translokace Zemanovafoto sejmout0002 46,XX,add(1) § děvče, rok narození 2002 § dg: stigmata – mongoloidní postavení očí, hyperplastická gingivální sliznice, soudkovitý hrudník, velké rozlité bříško § matka 46,XX, inv(9), otec 46,XY,add(1)[87]/46,XY[13] Kazuistika CGH: rev ish enh (11p15-pter) – nebalancovaná translokace ZemanovaWCP FISH: der(1)t(1;11) Kazuistika recip_gametes sejmout0002 1. Karyotyp 46,XX,add(1) Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: nebalancované translokace 2. CGH: rev ish enh (11p15-pter) ZemanovaWCP 3. FISH: der(1)t(1;11) § kazuistika §děvče, rok narození 2002 § dg: stigmata – mongoloidní postavení očí, hyperplastická gingivální sliznice, soudkovitý hrudník, velké rozlité bříško Karyotypy: matka 46,XX, inv(9), otec 46,XY,add(1)[87]/46,XY[13] nskupina geneticky podmíněných chorob, jejichž příčinou jsou drobné mikrodelece DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami npacienti mají specifické klinické příznaky…dříve popis dle fenotypu („phenotype first“…) nnyní přístup „genotype first“ …nejprve nález, srovnání velikosti, genů – vliv na fenotyp n nrekurentní - vznikají opakovaně ve stejném místě na chromozomu …např. del 22q11 nnerekurentní - mohou vzniknout kdekoliv v genomu … n Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: Mikrodeleční syndromy Mikrodeleční syndromy: Nejčastější mechanismy vzniku rekurentních a non-rekurentních mikrodelečních/duplikačních syndromů n n Rekurentní mikrodelece n n n n Non-rekurentní mikrodelece n D:\Dita\Desktop\NAHR_1.png Nerovnoměrná homologní rekombinace Zastavení replikační vidlice a přeskok na odlišný templát D:\Dita\Desktop\FOSTES.png Spojení nehomologních konců Mikrodeleční syndromy •růstová retardace •dysmorfismus •stigmata •mentální retardace •malformace •vrozené vady Obecné příznaky: Jsou způsobeny mikrodelecí úseku chromozomu – většinou 2 – 4 Mb Nejčastější rekurentní mikrodeleční syndromy: DiGeorgeův/Velokardiofaciální syndrom Prader-Williho a Angelmanův syndrom Williamsův-Beurenův syndrom Využití metod molekulární cytogenetiky FISH: detekce mikrodelečních syndromů – např. del 22q11 DiGeorge syndrom n nSRDEČNÍ VADY nANOMÁLIE TVÁŘE nPORUCHY IMUNITY n Využití metod molekulární cytogenetiky FISH: DiGeorge syndrom del 22q11 D:\Dita\Documents\Skripta\PřF - 11\Bi9015 Diplomová práce MBG IV\DP\Obrázky\TBX1_22q13 sonda.png Dvoubarevná FISH D:\Dita\Desktop\FISH22q11.png Obrázek: Ukázka normální mitózy a mitózy s mikrodelecí 22q11 vyšetřená pomocí techniky FISH (de Ravel et al., 2007; upraveno) Obrázek: Příklad komerčně dostupných sond pro detekci mikrodelece 22q11 (www.cytocell.co.uk) Využití metod molekulární cytogenetiky MLPA: DiGeorge syndrom del 22q11.2 SALSA MLPA probemix P250-B2 DiGeorge contains 48 MLPA probes with amplification products between 129 and 487 nt: 29 probes are located in the 22q11.2 region and can be used to distinguish the most common types of deletion. Nineteen probes are present for relevant regions of DiGeorge syndrome (DGS), DGS type II or disorders with phenotypic features of DGS on 22q13 and on chromosomes 4q, 8p, 9q, 10p and 17p. Array-CGH profil DNA pacienta s mikrodeleci 22q11 o velikosti 2,72 Mb ISCN: arr[GRCh37] 22q11.21(18818376_21540347)x1 Využití metod molekulární cytogenetiky Array CGH: DiGeorge syndrom del 22q11 Pomocí DNA čipů zjistíme i velikost mikrodelece Využití metod molekulární cytogenetiky mikrodeleční syndromy : Prader Willi a Angelman syndrom del 15q11-13 Metody pro stanovení diagnózy PWS a AS Cytogenetické : karyotyp - translokace Molekulárně cytogenetické : FISH - mikrodelece 15q11-13 DNA sonda MLPA, array-CGH Molekulárně genetické: PCR - uniparentální disomie, Metylační analýza Prader-Williho syndrom Chaloupková nHlavní klinické příznaky: n §Snížená aktivita plodu §Neprospívání kojenců §Hypotonie novorozenců (do 9 měs.) §Obesita §Hyperfagie, neukojitelný hlad §Hypogenitalismus, hypogonadismus §PMR §Malá postava §Akromikrie §Hypopigmentace §Problémy s chováním n Angelmanův syndrom – „Happy Puppet“ Výskyt : frekvence není přesně známá – - odhad asi 1: 15 000- 1: 30 000 Kubíková n Hlavní klinické příznaky §Vážná PMR §Tuhá nemotorná chůze §Trhavé pohyby, špatná rovnováha §Absence řeči §Šilhání §Výbuchy smíchu, šťastná povaha §Hypotonie §Epilepsie §Abnormální tvar lebky §Hypopigmentace § Využití metod molekulární cytogenetiky Genetické příčiny vzniku PWS a AS nPrader-Williho syndrom n n n1. Delece na paternálním n chromozómu 15 n (70%) n n2. Maternální uniparentální n disomie chromozómu 15 (20 - 25 %) n n3. Změna imprintingu n (2 - 4 %) n n4. Různé chromozomální n přestavby n ( méně než 5 %) n Angelmanův syndrom n n n1. Delece na maternálním n chromozómu 15 n (70 %) n n2. Paternální uniparentální disomie chromozómu 15 n (4 %) n n3. Změna imprintingu n (1 %) n n4. Různé chromozomální přestavby n (2 %) n n5. Mutace v genu UBE 3A n (3 - 5 %) n n Využití metod molekulární cytogenetiky mikrodeleční syndrom: Williams-Beurenův syndrom del7q1123 nautozomálně dominantní onemocnění s variabilní expresivitou, výskyt zpravidla de novo nriziko stejného postižení je pro děti probanda 50% nvýskyt 1:20 000 živě narozených dětí npříčina vzniku: del (7)(q11.23), deletovaná oblast o velikosti kolem 1,5 Mb zahrnuje nejméně 17 genů, nejvýznamnější je ELN gen kódující elastin ndetekce: FISH DNA sonda n Vysis ELN 7q11.23 SO/7q31 SG nMLPA, aCGH n n profil array-CGH s mikrodelecí 7q11.23 n„skřítkovitý obličej“ – široké čelo, nízký kořen nosu, krátké oční štěrbiny, velká ústa, malá brada nmalá, drobná postava, mikrocefalie nvadný skus, chybné postavení zubů, hypoplastické zuby nlehké až středně těžké duševní postižení (IQ mezi 35-70) nVCC- cévní stenózy nhyperkalcemie npřátelská povaha, hyperaktivita, hrubý hlas obr6-interfáze obr2a FISH §Telomery - fyzické konce chromozomů § §úplné konce tvořeny proteiny a tandemovými repeticemi DNA (TTAGGG) 3-20 kb (společné pro všechny chromozomy) § §TAR – doprovodné repetitivní sekvence subtelomerické oblasti 100-300 kb § Využití metod molekulární cytogenetiky Přestavby subtelomerických oblastí (delece/ duplikace) §subtelomerické oblasti na chromozomech – největší hustota genů v genomu! §aberace v této oblasti - příčina spontánních abortů, VVV a mentálních retardací §nebalancované translokace mohou být také příčinou subtelomerických přestaveb § §7 % pacientů s dysmorfií a MR - mikrodelece subtelomerických oblastí chromozomů !!! § §příklady: §Wolf-Hirschhornův syndrom (4p-), §1p36 syndrom, §Cri-du-chat syndrom (5p-), § 9p- syndrom, §13q- syndrom, §18p- syndrom § § Využití metod molekulární cytogenetiky Delece/ duplikace subtelomerických oblastí dicentr TEL4P Využití metod molekulární cytogenetiky Syndrom kočičího křiku (Cri du chat - delece 5p- ) n1 : 15 000- 50 000 n5 – 40 Mb nrůzný rozsah delece n- del 5p15.2 až celé p rameno n78 % terminální delece n10 – 15 % potomci přenašečů translokace ntypický křik novorozence nlaryngomalacie nkulatá hlava nmikrocefalie nPMR, srdeční vady nepicanthi nhypotonie 5p-k k2c_deletion lejeune1 J. Lejeune Využití metod molekulární cytogenetiky Identifikace markerových chromozomů n„supernumerary marker chromosome“, markerový chromozom či jen marker; nje to malý nadbytečný chromozom, který není možno analyzovat cytogenetickými pruhovacími metodami; nvýskyt - 1/4000 u novorozenců, n 1/2500 u amniocentéz; n 15foto FOT26-3 Philadelphský chromozóm translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2) Využití metod molekulární cytogenetiky onkocytogenetika (příklad reciproké translokace) Chronická myeloidní leukemie (CML) Philadelphský chromozóm translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2) Philadelphský chromozóm translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2) ¨Cytogenetika: kultivace tkáně tumoru; vyšetření karyotypu ¨ ¨Molekulární cytogenetika: ¨ I –FISH: amp.MYCN genu 2p24 del 1p36 gain 17q ¨ array-CGH ¨ SKY, MLPA ¨ Molekulární genetika: tyrozinhydroxyláza, protein PGP 9.5 Využití metod molekulární cytogenetiky u solidních nádorů : Neuroblastom(mimo jiné..) DM