Ústav patologické fyziologie1 Principy a etické zásady provádění experimentů na zvířatech Ing. Hana Holcová Polanská, Ph.D. Ústav patologické fyziologie2 Použití živých systémů Myšlenka použití zvířat v experimentech Claude Bernard (1813-1878) – lékař ̶ 1867 publikace l'Introduction à l'étude de la médecine expérimentale (Úvod do studia experimentální medicíny) ̶ „Principy experimentální medicíny jsou principy všech experimentálních věd.“ Ústav patologické fyziologie3 Pokusné zvíře 1. živý obratlovec, který je nebo má být použit k pokusům, s výjimkou člověka, včetně samostatně se živících larválních forem a plodů savců od poslední třetiny jejich běžného vývoje, nebo 2. živý hlavonožec, který je nebo má být použit k pokusům; za pokusné zvíře se považuje také zvíře, které je v ranějším stadiu vývoje, než je stadium uvedené v bodě 1, pokud má být zvířeti umožněno žít nad rámec tohoto stadia vývoje a v důsledku prováděných pokusů je pravděpodobné, že po dosažení tohoto stadia vývoje je postihne bolest, utrpení, strach nebo trvalé poškození, ̶ laboratorní myš (Mus musculus) ̶ laboratorní potkan (Rattus norvegicus) ̶ králík domácí (Oryctolagus cuniculus) ̶ křeček zlatý (Mesocricetus auratus) ̶ morče domácí (Cavia apperea) ̶ prase domácí (Sus scrofa) ̶ drápatka vodní (Xenopus laevis) ̶ ryby - např. dánio pruhované (Danio rerio) Ústav patologické fyziologie4 Nejčastěji používaná pokusná zvířata Obrázky: https://www.biolib.cz/ & https://www.velaz.cz/ Ústav patologické fyziologie5 Způsoby chovu 1. Otevřený ̶ vstup zvířat, osob a materiálu je volný, bez bariéry 2. Uzavřený a) Bariérový • zvířata oddělena od vnějšího prostředí bariérou, nejsou oddělena od člověka • SPF zvířata b) Izolátorový • zvířata uzavřena v izolátoru, který je odděluje od vnějšího prostředí i od člověka • gnotobiotická zvířata Ústav patologické fyziologie6 Bariérový chov - schéma VSTUP MATERIÁLU KE STERILIZACI „ŠPINAVÁ“ CHODBA ČISTÁ CHODBA AUTOKLÁV ČISTÝ PROSTOR ŠPINAVÝ PROSTOR MÍSTNOST PRO ZVÍŘATA MÍSTNOST PRO ZVÍŘATA MÍSTNOST PRO ZVÍŘATA MÍSTNOST PRO ZVÍŘATA VSTUP Z HYGIENICKÉ SMYČKY Ústav patologické fyziologie7 Izolátorový chov University of Calgary Ohio State University Ústav patologické fyziologie8 Zvířecí modely – mikroorganismy Konvenční ̶ běžná zařízení, otevřený systém chovu, kontrola patogenů přenosných na člověka SPF ̶ uzavřený systém chovu, je definováno, jaké mikroorganismy zvířata nemají Axenická ̶ uzavřený systém chovu ̶ bez mikroorganismů Gnotobiotická ̶ “gnotos” (known) and “bios” (life) ̶ uzavřený systém chovu ̶ axenické zvíře + definovaný mikroorganismus (mono-, di-, poly-xenická) Ústav patologické fyziologie9 Zvířecí modely – genetika Inbrední ̶ kolonie vytvořené minimálně 20 generacemi páření bratr-sestra, které lze vysledovat k jedinému zakládajícímu páru. Outbrední ̶ křížení kolonií, které byly geograficky odděleny (jiné chovatelské zařízení), až dosáhnou stejného rozsahu genetických variací. Hybridní ̶ křížením dvou inbredních kmenů ̶ hybridní zvířata jsou odolnější vůči nemocem, mají z výšenou míru přežití ve stresu ̶ větší vrhy než rodičovské kmeny Trangenní ̶ používají se téměř v každé terapeutické oblasti a oblasti výzkumu nemocí ̶ modifikace DNA • vypnutí funkčního genu • zapnutí nefunkčního/utlumeného genu • vnesení části cizorodé DNA Ústav patologické fyziologie10 Zvířecí modely – imunitní systém Imunokompetentní ̶ bez změny imunitního systému Immunodeficientní ̶ zvířata s různou úrovní imunodeficience a fenotypovými charakteristikami Humanizované zvířecí modely ̶ indukovaný lidský imunitní systém různé úrovně Ústav patologické fyziologie11 Použití zvířat v experimentu Zásada 3R ̶ 1959 Russel a Burche › Reduction (snížení) › Replacement (nahrazení) › Refinement (zmírnění) Více info na: https://norecopa.no/media/bjwh1h2s/the-three-rs-cz.pdf Ústav patologické fyziologie12 Reduction (Snížení) ̶ jakýkoli postup, který vede k dosažení stejného množství informací za použití nižšího počtu zvířat nebo k maximalizování získaných informací z jednoho zvířete ̶ vhodný plán pokusu a přiměřená analýza výsledných dat s náležitým posouzením statistických principů může zvýšit přesnost výsledků a stejně tak umožní použití nižšího počtu zvířat k vývoji těchto dat ̶ malá pilotní studie naznačí, zda je nebo není vhodné přikročit k hlavnímu pokusu Ústav patologické fyziologie13 Replacement (Nahrazení) ̶ jakákoli experimentální metoda, která nevyžaduje použití celého, živého zvířete ̶ některé z těchto metod nahrazují pouze částečně ̶ humánní zabíjení zvířat pro získání buněk, tkání nebo orgánů pro následné studie in vitro Některé alternativní metody nahrazují plně, jelikož nevyžadují žádný biologický materiál získaný od zcela vyvinutého obratlovce. Ústav patologické fyziologie14 Alternativy pokusů na zvířatech ̶ Důsledné vytěžení existujících experimentálních dat ̶ Modely, počítačové programy ̶ Fyzikálně-chemické techniky ̶ Bezobratlí, rostliny, mikroorganismy (nižší organismy) ̶ Časná vývojová stádia – zárodečný terčík ptačího vejce, embrya ̶ Lidští dobrovolníci, epidemiologická data ̶ Buněčné, tkáňové a orgánové kultury (tzv. relativní náhrady vyžadují čerstvě získané buňky nebo tkáň) Ústav patologické fyziologie15 Refinement (Zmírnění postupů) ̶ upravení jakékoli procedury, která zasahuje do života laboratorního zvířete od jeho narození až po jeho smrt, takže se tím minimalizuje bolest a utrpení, které zvíře prožívá, a pozvedá úroveň jeho života ̶ personál musí být dobře vyškolený a zručný v zacházení s druhy používaných zvířat ̶ anestézie a analgezie by měly být použity všude, kde je to vhodné a možné Ústav patologické fyziologie16 Regulace používání laboratorních zvířat ̶ Zákon na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb. a jeho prováděcí vyhláška 419/2012 Sb. ̶ Ústřední komise na ochranu zvířat (ÚKOZ) ̶ Odborná komise pro zajišťování dobrých životních podmínek pokusných zvířat při uživatelském zařízení Ústav patologické fyziologie17 Odborná komise pro zajišťování dobrých životních podmínek pokusných zvířat ̶ při každém uživatelském, chovatelském i dodavatelském zařízení ̶ poskytuje poradenství týkající se dobrých životních podmínek pokusných zvířat, 3R, … ̶ zavádí, kontroluje a přezkoumává vnitřní provozní postupy ̶ sleduje a kontroluje průběh a výsledky projektů pokusů Ústav patologické fyziologie18 Ústřední komise na ochranu zvířat (ÚKOZ) ̶ ochrana hospodářských zvířat ̶ ochrana zvířat v zájmových chovech ̶ ochrana volně žijících zvířat ̶ ochrana pokusných zvířat Ústav patologické fyziologie19 Zákon na ochranu zvířat č. 246/1992 Sb. § 3 Pro účely tohoto zákona se rozumí a) zvířetem každý živý obratlovec, kromě člověka, nikoliv však plod nebo embryo, … j) pokusným zvířetem 1. živý obratlovec, který je nebo má být použit k pokusům, s výjimkou člověka, včetně samostatně se živících larválních forem a plodů savců od poslední třetiny jejich běžného vývoje, nebo 2. živý hlavonožec, který je nebo má být použit k pokusům; za pokusné zvíře se považuje také zvíře, které je v ranějším stadiu vývoje, než je stadium uvedené v bodě 1, pokud má být zvířeti umožněno žít nad rámec tohoto stadia vývoje a v důsledku prováděných pokusů je pravděpodobné, že po dosažení tohoto stadia vývoje je postihne bolest, utrpení, strach nebo trvalé poškození, Ústav patologické fyziologie20 Zákon na ochranu zvířat č. 246/1992 Sb. § 18 Účely pokusů (1) Pokusy lze provádět výhradně pro tyto účely: a) základní výzkum, b) translační nebo aplikovaný výzkum s cílem 1. zabránit a předejít onemocnění, špatnému zdravotnímu stavu nebo jiným anomáliím nebo jejich následkům u lidí, zvířat nebo rostlin a diagnostikovat je nebo léčit, 2. posoudit, zjistit, regulovat nebo upravit fyziologické předpoklady lidí, zvířat nebo rostlin, nebo 3. zlepšit životní podmínky a podmínky produkce zvířat chovaných k zemědělským účelům, c) pro jakýkoli z cílů uvedených v písmeni b) při vývoji, výrobě nebo zkoušení kvality, účinnosti a nezávadnosti léčiv, potravin, krmiv a jiných látek nebo výrobků, d) ochrana přírodního prostředí v zájmu zdraví nebo dobrých životních podmínek lidí nebo zvířat, e) výzkum zaměřený na zachování druhů, f) vyšší vzdělávání nebo odborná příprava za účelem získání, udržení nebo zlepšení odborných znalostí, g) trestní řízení a jiné soudní řízení. (2) Provádět na zvířatech pokusy za účelem vývoje nebo zkoušení zbraní, bojových látek nebo munice a k nim příslušných zařízení je zakázáno. Ústav patologické fyziologie21 Zákon na ochranu zvířat č. 246/1992 Sb. § 15a Oprávnění k chovu, oprávnění k dodávce a oprávnění k používání pokusných zvířat … (2) Pokusy mohou být prováděny pouze ve schválených zařízeních uživatele pokusných zvířat. Ministerstvo může udělit výjimku z požadavku uvedeného ve větě první, pokud uživatel pokusnýchzvířat prokáže, že je to vědecky odůvodněno. Udělit výjimku k provádění pokusů mimo schválenézařízení uživatele pokusných zvířat bez uvedení adresy místa, kde hodlá žadatel vykonávat svojičinnost, je možné pouze v případě provádění pokusů ve volné přírodě. Ústav patologické fyziologie22 Zákon na ochranu zvířat č. 246/1992 Sb. § 15d Kurzy odborné přípravy k získání kvalifikace a odborné způsobilosti na úseku pokusných zvířat … (2) Osoba, která bude navrhovat pokusy a projekty pokusů, provádět pokusy na pokusnýchzvířatech, pečovat o pokusná zvířata nebo usmrcovat pokusná zvířata, musí před prováděnímtěchto úkonů absolvovat náležité vzdělávání a odbornou přípravu v a) navrhování pokusů a projektů pokusů, b) provádění pokusů na pokusných zvířatech, c) péči o pokusná zvířata, nebo d) usmrcování pokusných zvířat. Ústav patologické fyziologie23 Zákon na ochranu zvířat č. 246/1992 Sb. § § 15d Kurzy odborné přípravy k získání kvalifikace a odborné způsobilosti na úseku pokusných zvířat (3) Úkony uvedené v odstavci 2 písm. a) mohou provádět pouze lékaři, veterinární lékaři a osoby s jiným vysokoškolským vzděláním v oblasti biologických oborů, pokud se během studia nebo postgraduálního studia prokazatelně seznámili s metodami chovu a práce na pokusných zvířatech, s jejich ochranou a s vyhledáváním a používáním alternativních metod a kteří absolvovali kurz odborné přípravy a získali osvědčení o odborné způsobilosti k navrhování pokusů a projektů pokusů. Na základě tohoto osvědčení mohou tyto osoby provádět také pokusy na pokusných zvířatech, péči o pokusná zvířata a usmrcování pokusných zvířat. Osvědčení o odborné způsobilosti k navrhování pokusů a projektů pokusů vydává ministerstvo, a to na dobu 7 let. (4) Provádět úkony uvedené v odstavci 2 písm. b), c) nebo d) mohou pouze osoby, které absolvovaly kurz odborné přípravy a získaly osvědčení o odborné způsobilosti k provádění pokusů na pokusných zvířatech, péči o pokusná zvířata a usmrcování pokusných zvířat. Toto osvědčení vydává ministerstvo, a to na dobu 7 let. Ústav patologické fyziologie24 Probatorní laparotomie - zvířecí model Ing. Hana Holcová Polanská, Ph.D. Mgr. Lucie Válková, Ph.D. Ústav patologické fyziologie25 Probatorní laparotomie Ústav patologické fyziologie26 Praktikum 1) Potkan v chirurgické toleranci 2) V poloze na zádech umístění na operační stolek 3) Laparotomie 4) Sutura svalové vrstvy 5) Sutura kožní vrstvy Ústav patologické fyziologie27 Praktikum 1) Zvíře v plné chirurgické toleranci - zvíře již dostalo iniciační dávku anestezie Bez vyzvání další anestezii nepodávat! Ústav patologické fyziologie28 Praktikum 2) V poloze na zádech umístění na operační stolek - gumičkou fixovat hrudní i pánevní končetiny - gumičkou fixovat hlavu (za horní řezáky) Ústav patologické fyziologie29 Praktikum 3) Laparotomie - v průběhu abdominální oblasti (od processus xiphoideus téměř k symfýze) - nejprve kožní vrstva, poté svalová - NIC se neholí Nenastřihněte hrudník!!! Ústav patologické fyziologie30 Praktikum 4) Observace dutiny břišní ̶ caecum vs. žaludek ̶ ledviny (především levá) + vena renalis ̶ aorta abdominalis + vena cava caudalis ̶ močový měchýř ̶ … Ústav patologické fyziologie31 Praktikum 5) Sutura svalové vrstvy ̶ pokračovací steh ̶ jehla na průřezu kulatá ̶ vzdálenost mezi stehy 5-7 mm ̶ řádně utáhnout stehy = okraje rány k sobě přiléhají (nejsou vidět orgány vespod, ale ani nedochází k ischemii sešité tkáně) Ústav patologické fyziologie32 Praktikum 6) Sutura kožní vrstvy ̶ individuální stehy ̶ jehla na průřez trojúhelníkovitá ̶ vzdálenost mezi stehy 5-7 mm ̶ konce stehů zkrátit na cca 5 mm ̶ řádně utáhnout stehy Ústav patologické fyziologie33 Praktikum Podání další anestezie POUZE na pokyn vyučujícího (s největší pravděpodobností nebude nutná). Pokud se zvíře začne samo hýbat (jevit známky odeznívající anestezie), neprodleně to ohlaste vyučujícímu. Pokud by se Vám udělalo nedobře (z jakýchkoliv důvodů), nebojte se zavčasu ozvat a oznamte to vyučujícímu. Zápatí prezentace34 V laboratorních prostorách je zakázáno jíst, pít a kouřit Zápatí prezentace35 Je zakázáno pořizování jakýchkoliv záznamů z laboratorních prostor