Buňka x Zánět x Hojení Buňka Mitochondriální funkce/disfunkce ROS Hypoxie Lysosomální funkce/disfunkce Buněčná smrt 2 Mitochondrie ̶ Produkce ATP k pokrytí buněčných potřeb ̶ Metabolismus aminokyselin ̶ Regulace redoxních dějů buňky ̶ Syntéza hemu ̶ Diferenciace a aktivace procesů imunitních buněk ̶ Výsadní role v programu buněčné smrti 3 Mitochondriální síť Mitochondriální „fusion and fission“ ̶ Proces odpovídající na extra- a intracelulární změny ̶ Změny dodávky živin, energie nebo redox stavu, během diferenciace „celltype dependent“ charakteru 4 Front. Cell Dev. Biol., 2017 Mitochondriální fúze a štěpení ̶ Odpověď na metabolický/patogenní podnět ̶ FÚZE = autonomní integrace ̶ 1. fúze vnější membrány mezi 2 sousedními mitochondriemi ̶ Řízené - mitofusin 1 a 2 ̶ 2. fúze vnitřní membrány ̶ cardiolipin, dynamin-like GRPase optic atrophy (OPA) ̶ důležité pro udržení integrity mitochondriální DNA a buněčné dýchání5 Research Reports in Clinical Cardiology 2014(default):111 Mitochondriální fúze a štěpení ̶ ŠTĚPENÍ ̶ důležité pro mitochondriální dědičnost pro dceřinné buňky během buněčného dělení ̶ při poškození a odstranění - poškozené mitochondrie „usnadňují“ své odstranění pomocí mitofagie 6 Research Reports in Clinical Cardiology 2014(default):111 Způsoby přenosu mitochondrií z buněk do buněk Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště7 a TNT is a membranous tubular protrusion that extends from the plasma membrane, with a variety of diameters between 50 and 1500 nm and lengths from several tens to hundreds of microns. TNT is the most popular route of mitochondrial transfer between the connected cells. b Dendrite is another form of the membranous protrusion. Some cells with dendrites (e.g., osteocytes) are connected to each other via intrinsic dendrites to form an intercellular network, which provides a highway for mitochondrial transfer. c Microvesicles formed by blebbing of the cellular plasma membrane were reported as another route for mitochondrial transfer. d Free mitochondria alone can be extruded or internalized without carriers, which provides a possible route for intercellular mitochondrial transfer Mitochondrie a ROS ̶ produkce reaktivních forem kyslíku ̶ generované mitochondriemi prostřednictvím elektronového transportního řetězce ̶ vedlejší produkt při produkci energie, důsledek β-oxidace mastných kyselin, vystavení záření, světlu, kovům a redoxním látkám ̶ ROS funkce: ̶ druzí poslové v různých signálních drahách Imunitní buňky: Ca2+-NFAT signální dráha – kritická pro aktivaci T lymfocytů. ̶ ROS mohou také ničit bakteriální patogeny, ale ̶ pokud jsou nadměrně produkovány - poškodí produkující buňku nebo sousední buňky.8 Int. J. Mol. Sci. 2019, 20(18), 4407 Místa produkce ROS ̶ mitochondriální ROS (mROS) jsou produkovány jako vedlejší produkty bioenergetického metabolismu ̶ Cyt c, cytochrome c; MAO, monoamine oxidase; NOX-4, NADPH oxidase 4; VDAC, voltage-dependent anion channel 9 Mitochondrie, ROS a imunitní buňky ̶ prozánětlivé buňky - aktivované monocyty a aktivované T a B buňky – glykolýza ̶ regulační buňky - regulační T lymfocyty nebo M2 makrofágy zvyšující mitochondriální funkci a beta-oxidaci 10 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease Volume 1866, Issue 10, 1 October 2020, 165845 Vliv mitochondrií na imunitní reakci ̶ mitochondriální DAMPs ̶ v extracelulárním prostoru a v cirkulaci. ̶ mitochondriální proteiny ̶ FRP receptory - produkce chemoatraktantů. ̶ mitochondriální ROS ̶ intracelulární signalizace, poškození buněk. ̶ mitochondriální ATP a Kardiolipin ̶ aktivují NLRP3 inflamasom nebo TLR4 - produkci prozánětlivých cytokinů. ̶ mitochondriální DNA ̶ aktivuje TLR9, NLRP3 inflammasomy nebo dráhu cGAS - produkce prozánětlivých cytokinů. 11 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease Volume 1866, Issue 10, 1 October 2020, 165845 Mitochondrie - indukce imunitní odpovědi ̶ „mitochondrial danger associated molecules“ (DAMPs) that resemble structures of bacterial derived pathogen associated molecular patterns (PAMPs) ̶ mitochondriální DAMPS - mitochondrial DNA with hypomethylated CpG motifs, specific lipid present in prokaryotic bacteria and mitochondria, i.e. cardiolipin. ̶ via DAMPs mitochondrie řídí imunitní odpověď ̶ mitochondriálí DAMPs - negativní vliv- uvolňovány poškozenými buňkami bez přítomnosti infekce - nežádoucí zánětlivá reakce, která vede k poškození tkání a dysfunkci orgánů 12 Clin Microbiol Rev. 2012 Oct; 25(4): 609–634. Oxidační stres ̶ výsledek nerovnováhy mezi produkcí ROS a antioxidací ̶ patologické změny u živých organismů ̶ rakovina, ateroskleróza, neurologické nemoci, stárnutí a cukrovka, poškození buněčných složek (DNA, RNA, lipidy, a proteiny) ̶ ne-enzymatická obrana: ̶ flavonoidy, vitaminy (A, C, and E), a glutathion ̶ enzymatické antioxidanty: ̶ Superoxide dismutase (SOD), superoxide reductase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, peroxiredoxins (Prdxs), and thioredoxins (Trx)14 Int. J. Mol. Sci. 2019, 20(18), 4407 Mitochondriální disfunkce 15 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 17, pages308–321(2016) Mitochondriální disfunkce 16 Mitochondriální disfunkce ̶ mutace v mitochondriální DNA a oxidační stres - rizikový faktor pro neurodegenerativní onemocnění ̶ mitochondriální dysfunkce se objevuje brzy a působí kauzálně v patogenezi onemocnění ̶ pro nemoc specifické proteiny interagují s mitochondriemi 17 Nature volume 443, pages787–795(2006) Oxidační stres 18 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2019 Mitochondriální disfunkce 19 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2019 Mitochondriální disfunkce 20 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2019 Mitochondrial dysfunction and heart 21 European Society of Cardiology Journals 23. 10. 2018 Mitochondrie a hypoxie 22 Nature Reviews Cancer volume 2, pages38–47(2002) Mitochondrie a hypoxie ̶ Akutní vs. chromická ̶ decreased flux through the tricarboxylic acid (TCA) cycle ̶ activity of the electron transport chain (ETC) ̶ hypoxia-induced ROS, … ̶ nízký vs. limitní/žádný O2 23 Buněčná smrt Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště24 Current Aging Science Volume 10 , Issue 1 , 2017 Buněčná smrt Apoptóza: programovaný proces kondenzace chromatinu - fragmentace jádra odbourání cytoskeletu („scvrknutí“ buňky) fragmentace chromozomální DNA (180 bp) mitochondrie zůstávají intaktní buněčná membrána se vychlipuje umírající buňka je fagocytována sousedními buňkami Nekróza: smrt buňky obvykle vyvolaná zraněním bobtnání organel poškození mitochondrií celková dezintagrace buňky uvolnění nitrobuněčných komponent vznik zánětu Apoptóza versus nekróza Volná DNA Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště27 • Buněčné procesy, od lýzy buněk po uvolnění DNA, jsou hlavními místy pro syntézu cfDNA. • cfDNA se často využívá pro diagnostiku a prognózu rakoviny a příbuzných onemocnění • Je přítomna v fetálních tekutinách, kde slouží jako důležitý biomarker pro diagnostiku abnormalit a prenatální analýzy – příkladem je Downův syndrom Advances in Cancer Biology - Metastasis Volume 5, October 2022 Exosomy ̶ obsahují různé vnitřní složky a variabilní náklad, který může zahrnovat proteiny, lipidy, metabolity a DNA až po ncRNA ̶ iniciuje biologické reakce a fenotypové změny v cílových buňkách ̶ carrying anabolic/catabolic and anti-/proinflammatory factors ̶ exosomy slouží jako klíčové medum pro mezibuněčnou komunikaci Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště28 International Journal of Oral Science volume 14, Article number: 40 (2022) Exosomy v terapii ̶ Progrese osteoartrózy (OA) může být zmírněna usnadněním přepnutí makrofágů z prozánětlivého fenotypu M1 na protizánětlivý fenotyp M2 Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště29 International Journal of Oral Science volume 14, Article number: 40 (2022) Signály z lysozomu: kontrolní centrum buněčné clearance a energetického metabolismu ̶ degradation and recycling of cellular waste ̶ via endocytosis and autophagy ̶ Lysosomal and autophagy dysfunction in ̶ lysosomal storage diseases (LSDs) and ̶ common neurodegenerative diseases ̶ defective cellular clearance and accumulation of toxic material 30 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 14, pages283–296(2013) Defektní buněčná clearance u neurodegenerativních onemocnění ̶ loss-of-function mutace genů zapojených do lysozomálně– autofagické dráhy ̶ gain-of-function mutace u proteinů náchylných k agregaci ̶ zvýšená agregace proteinů a narušení lysozomálně-autofagických drah 31 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 14, pages283–296(2013) Lysosomy a hladovění ̶ omezená dostupnost živin a zprostředkování odpovědi na hladovění regulací katabolismu lipidů ̶ nádorové buňky 32 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 14, pages283–296(2013) Zánět Zánět Reakce akutní fáze Cytokiny, chemokiny 33 Zánět je soubor reakcí , které se objevují po tkáňovém poškození nebo infekci nebo imunologické stimulaci jako obrana proti cizím, nebo alterovaným vlastním substancím. Zánětlivé reakce zahrnují četné biochemické a celulární alterace, jejichž rozsah koreluje s rozsahem iniciálního traumatu. Nevhodná aktivace zánětlivých odpovědí jako bazální příčina nemocí. Zánět ̶ Reakce živého organismu na poškození. ̶ 3 hlavní funkce: ̶ Tvorba akutního zánětlivého exsudátu. Ten přináší proteiny, tekutinu a buňky z krve do poškozené oblasti, kde posiluje lokální obranyschopnost. ̶ Destrukce a eliminace příčinného činitele (např. bakterií, pokud jsou přítomny). ̶ Rozklad a likvidace poškozené tkáně (debris). Etiologie a patogeneze ̶ Fyzikální poškození ̶ Chemické látky ̶ Biologické poškození (např. mikroorganismy). Typy zánětu ̶ Akutní ̶ Chronický ̶ Lokální ̶ Systémový SYSTÉMOVÉ A MÍSTNÍ KLINICKÉ SYMPTOMY AKUTNÍHO ZÁNĚTU Systémové příznaky horečka tachykardie hyperventilace únavnost ztráta chuti k jídlu Lokální příznaky calor rubor dolor tumor functio laesa PŘÍZNAKY ZÁNĚTU A KORESPONDUJÍCÍ CHEMICKÉ MEDIÁTORY Zánětlivá odpověď Chemický mediátor Otok, zčervenání, zteplání Histamin, PG, LT, bradykinin Tkáňové poškození Lysosomy, látky z M a dalších zánětlivých buněk Chemotaxe Komplement, chemokiny Bolest Prostaglandiny, bradykinin Horečka IL-1 a IL-6 Leukocytóza TNF a IL-8 Lokální zánětlivé reakce ̶ Zvýšený průtok krve oblastí poškození ̶ Zvýšení permeability cév ̶ Řízený a přímý influx a selektivní akumulace různých efektorových buněk z periferní krve v místech poškození ̶ a/rychlá, nespecifická(antigenně) fagocytární odpověď-neutrofily ̶ b/pozdní odpověď- monocyty- makrofágy, specifické T a B lymfocyty+ exsudace plasmy Dynamika zánětlivé reakce ̶ Aktivované zánětlivé buňky (M-M, T,B lymfocyty) samy produkují protektivní a prozánětlivé molekuly. ̶ Zánětlivé buňky exprimují zvyšující se počet buněčných povrchových proteinů a glykoproteinů, tzv. adhesivních molekul. ̶ Aktivované endoteliální buňky exprimují receptory pro adhesivní molekuly. Počet těchto receptorů je regulován a umožňuje precizní směrování požadovaného počtu cirkulujících leukocytů do místa zánětu. ̶ Celulární přichycení (“attachment”) imunitních buněk k endotelu v cévách v oblasti zánětu zabraňuje možnosti, že by mohly místo zánětu minout, a je klíčovým krokem pro extravazaci. AKUTNÍ ZÁNĚT-TYPY PODLE EXSUDÁTU ̶ Serózní ̶ Katarální ̶ Fibrinózní ̶ Hemorhagický ̶ Purulentní ̶ Membranózní ̶ Pseudomembranózní ̶ Nekrotizující (gangrenózní) zánět SYSTÉMOVÉ MANIFESTACE ZÁNĚTU 1. Horečka 2. Reakce akutní fáze Justin Root PŘÍZNAKY ZÁNĚTU A KORESPONDUJÍCÍ CHEMICKÉ MEDIÁTORY Zánětlivá odpověď Chemický mediátor Otok, zčervenání, zteplání Histamin, PG, LT, bradykinin Tkáňové poškození Lysosomy, látky z M a dalších zánětlivých buněk Chemotaxe Komplement, chemokin Bolest Prostaglandiny, bradykinin Horečka IL-1 a IL-6 Leukocytóza TNF a IL-8 Systémové manifestace zánětu Horečka Polymorfonukleáry a makrofágy produkují endogenní pyrogeny, které resetují termoregulační centrum v hypotalamu na vyšší teplotu. Uvolnění endogenních pyrogenů je stimulováno fagocytózou, endotoxiny a imunitními komplexy. Klinické symptomy Únava, anorexie, nausea. Ztráta hmotnosti u chronického zánětu. Zduření lokálních nebo systémových lymfatických uzlin se objevuje pravidelně; splenomegálie u některých specifických infekcí (např. malárie, infekční mononukleóza). Systémové manifestace zánětu Mol Cancer Res; 11(9); 967–72. ©2013 AACR. SYSTÉMOVÉ PŘÍZNAKY AKUTNÍHO ZÁNĚTU ̶ Hematologické změny ̶ Zrychlená sedimentace erytrocytů. Častý nespecifický příznak systémového zánětu. ̶ Leukocytóza ̶ Neutrofilie se objevuje u pyogenních infekcí a tkáňové destrukci; eozinofilie u parazitárních infekcí; ̶ Lymfocytóza u chronických infekcí (např. TBC), u mnoha virálních infekcí ̶ Monocytóza u infekční endokarditidy a některých bakteriálních infekcí (TBC) ̶ Anémie ̶ Ztráta do zánětlivého exsudátu (ulcerativní kolitis); ̶ Hemolýza (v přítomnosti bakteriálních toxinů) ̶ „anémie u chronických zánětlivých onemocnění“ jako důsledek toxického útlumu kostní dřeně. ̶ Amyloidóza ̶ Dlouhotrvající chronický zánět (např. u revmatoidní artritidy) může zvýšit sérový amyloid A protein (SAA),což může vést k depozici amyloidu do tkání Anémie chronických chorob vs. anémie z nedostatku železa Anémie chronických chorob Anémie z nedostatku železa Serum Iron Reduced Reduced Transferrin Reduced to normal Increased Transferrin Saturation Reduced Reduced Ferritin Normal to increased Reduced Soluble transferrin receptor Normal Increased Cytokine level Increased Normal Hepcidin Increased Reduced Bone marrow iron stores Normal to increased Reduced Erythrocytes Normal, microcytes Microcytes J Clin Invest. 2007;117(7):1755-1758. https://doi.org/10.1172/JCI32701. Změny při zánětu Zvýšení Pokles Buněčné Fagocytující buňky (v krvi i místně) Erytrocyty Metabolické Proteiny akutní fáze serová Cu katabolismus bílkovin glukoneogeneze Sérové Fe, sérový Zn syntéza albuminu transtyretin, transferin Endokrinní glukagon insulin ACTH GH T4 kortisol aldosteron vasopressin T3 TSH Reakce akutní fáze Je systémová reakce na lokální nebo systémový imunologický stres způsobený infekcí, tkáňovým poškozením, traumatem nebo neoplastickým růstem. V místě léze uvolňují lokální prozánětlivé buňky neutrofily a makrofágy- prozánětlivé cytokiny (TNF-α/β, IL-1α/β, IL-6, INF-α/γ a IL-8) do krve. Tyto cytokiny aktivují různé cílové buňky, což vede k aktivaci hypotalamu, redukci sekrece růstového hormonu a dalším dějům charakterizovaným jako horečka, anorexie a katabolismus svalových buněk. Při dostatečně vysoké hladině prozánětlivých cytokinů (zejména IL-6) v periferní krvi játra odpovídají změnou exprese proteinů akutní fáze. Reakce akutní fáze ̶ Metabolické změny: pokles LDL a HDL v krvi, nárůst ACTH a glukokortikoidů, aktivace komplementu, pokles hladin Ca++, Zn, Fe, vitaminů rozpustných v tucích a změny v koncentracích proteinů akutní fáze. ̶ Smysl reakce: zábrana mikrobiálního růstu a pomoc při obnově homeostázy (limitace poškození navozených vlastním zánětlivým procesem). 51 Proteiny akutní fáze ̶ Je třída proteinů, jejichž plasmatická koncentrace stoupá (pozitivní proteiny akutní fáze) nebo klesá (negativní proteiny akutní fáze) v odpovědi na tkáňové poškození. ̶ Tato reakce se nazývá reakce akutní fáze (AFR). 52 N Engl J Med 1999; 340:448-454 DOI: 10.1056/NEJM199902113400607 Pozitivní proteiny akutní fáze ̶ (1) ceruloplasmin a složka komplementu C3 ̶ (2) haptoglobin, fibrinogen, a-globuliny a LPS-binding proteinázy ̶ (3) C-reaktivní protein a sérový amyloid A ̶ Funkce: ̶ Opsonizace a vychytávání bakterií a jejich produktů ̶ Aktivace komplementu ̶ Vychytávání volného hemoglobinu a radikálů 53 Biotechnology Advances Volume 34, Issue 3, May–June 2016 Funkce Protein akutní fáze Nárůst v průběhu Inhibitory proteáz Alfa 1-antitrypsin Alfa 1-antichymotrypsin 4 x 6 x Koagulační proteiny (serin proteinázy) fibrinogen prothrombin factor VIII plasminogen 8 x Složky komplementu C1s C2b C3, C4, C5 C9 C5b 2 x Transportní proteiny haptoglobin hemopexin feritin 8 x 2 x 4 x Scavengerové proteiny ceruloplasmin 4 x Různé alfa1-kyselý glykoprotein (orosomukoid) serum amyloid A protein C-reactive protein 4 x 1000 x 1000 x 54 C-reaktivní protein ̶ CRP aktivuje komplement ̶ CRP se váže na chromatin pocházející z mrtvých buněk a na zbytky buněk, který je nutno z cirkulace odstranit fagocytózou, a to přímo, vazbou na receptory Fc, C3b nebo CRP. ̶ Inhibice destičkové agregace snižuje riziko trombózy. ̶ CRP se váže na LDL.55 N Engl J Med 1999; 340:448-454 DOI: 10.1056/NEJM199902113400607 Negativní proteiny akutní fáze ̶ Pokles albuminu, transferinu, kortisol-binding globulinu, transthyretinu a vitamin A binding proteinu vedou dočasně ke zvýšené nabídce volných hormonů, které se na tyto bílkoviny obvykle vážou. ̶ Transthyretin (prealbumin vážící thyroxin, transportuje hormony štítné žlázy z plexus choroideus do mozkomíšního moku) inhibuje produkci IL-1β monocyty a endoteliálními buňkami. Jeho pokles je tedy možno považovat za prozánětlivý mechanismus. Tyto změny krevních bílkovinných profilů zřejmě částečně souvisí s hladověním a katabolismem ve svalech. Jde také o nabídku aminokyselin pro produkci pozitivních proteinů akutní fáze. 56 Cytokiny ̶ Definice je problematická. Podle dnešních kritérií se považuje za generické jméno velmi variabilní skupiny solubilních proteinů a peptidů, které fungují jako humorální působky v piko- až nM koncentracích a které modulují funkční aktivity jednotlivých buněk a tkání za fyziologických a patofyziologických podmínek. Tyto procesy také modifikují interakci mezi buňkami přímo a ovlivňují procesy v extracelulární matrix. Nature Reviews Immunology volume 19, pages205–217(2019) Cytokiny Působí také jako růstové faktory (mitogenně nebo antimitogenně), jako celulární „survival“ faktory (zabraňující apoptóze) a jako faktory transformační. Glykoproteiny sekretované buňkami klasickými sekrečními cestami. Mnohé ve formě vázané na membrány. Rovnováha mezi solubilními a membránovými formami zřejmě sama o sobě regulujícím faktorem. Většina se neskladuje v buňkách (kromě TGF a PDGF v destičkách). Rozdíly mezi cytokiny a peptidovými hormony Cytokiny působí na širší spektrum buněk než hormony Cytokiny nejsou produkovány specializovanými buňkami organizovanými do specializovaných žláz Místa jejich sekrece primárně neurčují místo jejich cílového působení (některé cytokiny jsou totožné s enzymy-PD-ECGF) Cytokiny Nenavozují odpověď přímo. Stimulují nebo inhibují produkci specifických DNA vazných proteinů, které kontrolují expresi dalších genů. Cytokin ve vazbě na receptor vyvolává (hod) expresi immediate early response genes (IEG, několik set). Genové produkty těchto genů se pak vážou na promotorové elementy tzv. delayed early response genes (DEG). Cytokiny pleiotropní, tj. vykazují několikeré biologické aktivity. Cytokiny s mnohonásobnými účinky se čato ve svých aktivitách přesahují a jednotlivé buňky vstupují do interakce s nimi zdánlivě identickým způsobem. Jsou tedy funkčně nahraditelné, nebo alespoň částečně funkčně kompenzovatelné. Cytokiny Účinné modulátory během embryogeneze a organogeneze. Jejich aktivity v pozdějším životě se mohou od působení v tomto období výrazně lišit. Typy cytokinů (nazvy často podle buněčného původu nebo první objevené funkce: Interleukiny, lymfokiny, monokiny, interferony, CSF aj. International Journal of Oral Science volume 11, Article number: 30 (2019) “cytokine storm” ̶ extreme increase in inflammatory cytokines, including IL-1β, IL-2, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-10, granulocytecolony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), interferon-inducible protein-10 (IP10), monocyte chemotactic protein 1 (MCP1), macrophage inflammation protein-1α, IFN-γ, and TNF-α. 64 Signal Transduction and Targeted Therapy volume 5, Article number: 128 (2020) 65 Journal of Infection 80 (2020) 607-613 Chemotaxe Je řízený pohyb buněk v koncentračním gradientu solubilních extracelulárních látek. Chemotaktické faktory, chemotaxiny nebo chemoatraktanty. Pozitivní chemotaxe=buňky směřují do míst s vyšší koncentrací chemotaktických faktory (CHF). Negativní chemotaxe=buňky se pohybují od míst s vyšší koncentrací CHF. Chemokineze=buňky se pohybují neřízeně Chemoinvaze=buňky se pohybují přes bazální membránu Chemotakticky aktivní faktory ̶ Funkce:  Účast v imunitní odpovědi  Zánět  Hojení ran  Celkové systémové reakce po tkáňovém nebo orgánovém poškození Chemotakticky aktivní faktory C5A Oligopeptidy bakteriálního původu Intermediální produkty lipidových metabolismů (AA a LTB4) Cytokiny, růstové factory Chemokiny Chemotakticky aktivní faktory Biologická aktivita těchto faktorů je řízena pomocí specifických receptorů na buněčném povrchu, jejich exprese je pozitivně nebo negativně modulována téměř všemi cytokiny. V chemotaktické odpovědi buněk se aktivně účastní také extracelulární matrix, celulární adhesivní molekuly, cytoskelet a některé nízkomolekulární substance. Chemokiny Tvoří rodinu cytokinů, indukovatelných prozánětlivou aktivací. 8-10kDa, 20-50% sekvenční homologie, podobná genetická a terciární struktura. Všechny tyto proteiny poskytují množství konzervovaných cysteinových zbytků, které se účastní v tvorbě intramolekulárních disulfidových vazeb. Funkce chemokinů 1. esenciální mediátory normálního pohybu leukocytů 2. podpora zánětu 3. indukce chemotaxe 4. aktivace zánětlivých buněk a/ aktivace granulocytů a makrofágů s následným oxidativním vzplanutím, degranulací a releasem lysosomálních enzymů b/ovlivnění imunitních buněk k odpovědi na suboptimální množství zánětlivých mediátorů c/ mocné uvolňovací faktory pro histamin z bazofilů 5. indukce proliferace a aktivace NK (CHAK-chemokine-activated killer) 6. modulace hemopoézy (BFU-E, CFU-GH, CFU-GEMM) 7. modulace angiogenezy 8. modulace nádorového růstu 9. účast v patogeneze infekcí viry HIV (chemokiny mohou suprimovat infekci HIV-1, chemokinové receptory slouží prostřednictvím Hojení 73 Hojení ran ̶ Je opravný proces, který navazuje na poškození kůže a měkkých tkání. ̶ Hojení je interakce komplexní kaskády buněčných reakcí, které vedou k obnovení povrchu, rekonstrukci a o obnovení napětí poškozené tkáně. ̶ Hojení je systémový proces, tradičně popisovaný třemi fázemi: zánět, proliferace, remodelace Hojení ran ̶ Zánětlivá fáze: vytváří se trombus a zánětlivé buňky odstraní debris poškozené tkáně. ̶ Proliferační fáze: epitelizace, fibroplazie a angiogeneze; vytváří se granulační tkáň a rána se začíná stahovat. ̶ Remodelační fáze: Kolagenní vlákna vytváření pevné vazby s jinými kolagenními vlákny a molekulami bílkovin: tak se zvyšuje napětí v jizvě. Phases of wound healing 76 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 25, pages599–616 (2024) I. Zánětlivá fáze ̶ Trvání:od poškození 2-5 dní ̶ Hemostáza ̶ Vazokonstrikce ̶ Agregace destiček ̶ Koagulace ̶ Zánět ̶ Vazodilatace ̶ Fagocytóza Activation of inflammation ̶ damage-associated molecular patterns (DAMPs) and pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) from damaged neighbouring cells and microorganisms, and both will activate various Toll-like receptors (TLRs) and receptors such as receptor for advanced glycosylation end products (RAGE) ̶ DAMPs or any membrane damage to wound edge cells will trigger Ca2+ influx into the cytoplasmic space ̶ Ca2+ wave and the release of ROS generated by Nox (NADPH oxidase) and Duox (dual oxidase) enzymes 78 Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 25, pages599–616 (2024) Wound inflammatory response and the roles of neutrophils and macrophages ̶ Neutrophils are recruited ̶ passively through blood loss or by active extravasation from the vasculature. ̶ macrophages ̶ local tissue residents or derive from extravasating monocytes from the vasculature. ̶ Extravasated immune cells migrate interstitially towards the wound following gradients of different inflammatory signals such as H2O2, DAMPs and PAMPs. ̶ at the site of the wound - release signals to recruit more inflammatory cells Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště79 Zánětlivá fáze ̶ Tělo rychle odpovídá na jakékoliv narušení kožního povrchu. ̶ Na začátku procesu hojení se rozvíjí vaskulární a celulární odpověď na poškození. ̶ Hlubší poranění kůže vede k poškození mikrocirkulace a následnému krvácení. ̶ Během sekund se dochází k vazokonstrikci v místě poškození, která má za cíl omezit místně krvácení. ̶ V průběhu minut se krvácení zastavuje pomocí aktivace primární hemostázy (aktivace a agregace destiček) a koagulace (tvorba trombu). Zánětlivá fáze Vazokonstrikce rozvíjející se v důsledku incize kůže se rozvíjí pod vlivem adrenalinu, noradrenalinu, prostaglandinů, serotoninu a tromboxanů. Vazokonstrikce způsobí dočasné vyblednutí rány a slouží k redukci krvácení po tkáňovém poškození. Endoteliální buňky se retrahují a tím odkrývají subendoteliální kolagen, na němž jsou schopny se uchytit krevní destičky. Adheze destiček na exponovaný kolagen a adhezivita destiček vůči ostatním destičkám se uskutečňuje prostřednictvím adhezívních glykoproteinů: fibrinogenu, fibronektinu, trombospondinu a von Willebrandova factoru. Zánětlivá fáze ̶ Destičky také uvolňují chemoatrakční faktory pro: ̶ Neutrofily omezují infekci povolávají makrofágy. ̶ Makrofágy štěpí a odstraňují tkáňovou debris aktivují odpověď fibroblastů ̶ Zánětlivá fáze trvá asi 24 hod. Navazuje na ni proliferativní fáze hojivého procesu Zánětlivá fáze ̶ Adhese, aktivace a agregace destiček vede k tvorbě bílého trombu (destičky+fibrin). Adhese destiček na exponovaný kolagen vede k jejich aktivaci, jejímž důsledkem je degranulace. V průběhu degranulace se uvolňují chemotaktické a růstové faktory: platelet-derived growth factor (PDGF) proteázy vazoaktivní látky (ADP, serotonin, histamin). Zánětlivá fáze ̶ Následuje aktivace koagulační kaskády - vede k aktivaci trombinu, který aktivuje fibrinogen na fibrin. ̶ Trombin podporuje také migraci zánětlivých buněk do místa poškození prostřednictvím zvýšené cévní permeability. ̶ Produkce fibrinu je pro proces hojení ran zcela zásadní a je primární složkou ranné matrix, do které migrují zánětlivé buňky, destičky a plasmatické proteiny. Odstranění fibrinu komplikuje hojení ran. Zánětlivá fáze ̶ Výsledkem aktivace primární (destičky) a sekundární hemostázy (aktivace koagulačních kaskád) v průběhu procesu hojení ran je tvorba sraženiny v místě poškození. ̶ Tvorba sraženiny se omezuje na trvání a místo tkáňového poškození. ̶ Tvorba sraženiny ustává, jak ustává aktivace hemostázy. Následně je plasminogen aktivován na plasmin, který stimuluje fibrinolýzu a dále pomáhá v lýze buněk v místě poškození. ̶ Tvorba sraženiny je místně omezována prostřednictvím endoteliálních buněk, které produkují prostacyklin PGI2 (antiagregační a vazodilatační účinky). V místě poškození se uplatňují také faktory přirozené antikoagulace (antitrombin III vyvazuje aktivované vitamin-K dependentní koagulační faktory, protein C a protein S vážou aktivované faktory V a VIII). II. Proliferační fáze ̶ Trvání: 2 dny až 3 týdny ̶ Granulace ̶ Fibroblasty vytvářejí kolagen ̶ tkáň vyplňuje defekt a vede k neovaskularizaci ̶ Kontrakce ̶ Konce ran se slepují a redukují defekt ̶ Epitelizace ̶ se uskutečňuje ve vlhkém prostředí ̶ Buňky cestují až 3 cm ve všech směrech Journal of Theoretical Biology 459, 2018, 1-17 Role of fibroblasts ̶ Various fibroblastic lineages from different anatomical locations contribute to the deposition of wound matrix mediated by mechanical signals and signals from inflammatory macrophages ̶ microanatomical cellular differences in contribution to scarring, ̶ gross anatomical locations of the body have different predispositions to scarring, with some sites being very prone to scaring, for example, the back, whereas other sites, most notably the mouth, tend to be almost scar resistant Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště87 Roles of other cell types in wound healing ̶ adipocytes at the wound edge ̶ undergo lipolysis and release free fatty acids that activate macrophages and induce angiogenesis ̶ dedifferentiate to become myofibroblasts and then migrate into the wound bed and secrete extracellular matrix (ECM) components ̶ melanoblasts and melanocytes ̶ mast cells ̶ neurones Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště88 Nerves are important ̶ Nerves fibers infiltrate the epidermis and dermis of the skin. After injury, nerves secrete growth factors, neurotransmitters and neuropeptides, modulate gap junction expression, and influence bioelectric signaling to drive keratinocyte proliferation and migration during reepithelialization and wound healing. Definujte zápatí – název prezentace nebo pracoviště89 August 2023, Developmental Dynamics 253(2) Proliferační fáze ̶ Na povrchu rány se během 24-72 hodin epidermální buňky dostávají do mitotické aktivity. Tyto buňky pak migrují přes povrch rány. ̶ Fibroblasty proliferují v hlubších vrstvách rány. Tyto fibroblasty začínají syntetizovat malé množství kolagenu, který představuje jakési “lešení“ usnadňující migraci a další proliferaci fibroblastů. Proliferační fáze ̶ Granulační tkáň se skládá ̶ z kapilárních kliček nově vznikajících ve vyvíjející se kolagenní matrix ̶ objevuje se v hlubších vrstvách rány. ̶ Proliferační fáze trvá od 24 do 72 hodin a přechází do remodelační fáze procesu hojení Proliferační fáze ̶ Za 4 až 5 dní od poškození začínají fibroblasty produkovat velké množství kolagenu a proteoglykanů. ̶ Kolagenní vlákna leží původně náhodně, později jsou organizována do pevných svazků. ̶ Proteoglykany podporují tvorbu kolagenních vláken, ale přesně není jejich role dosud známa. Za 2-3 týdny zhojená rána odolává normální zátěži, ale odolnost rány se buduje ještě několik dalších měsíců. Fibroblastická fáze trvá 15-20 dní a potom se rána dostává do remodelační fáze hojení. Proliferační fáze Epitelizace ̶ Epidermis se rekonstruuje z okrajů ran a zbytků vlasových folikulů (z keratinocytů) ̶ Keratinocyty putují přes místo rány ̶ Během migrace a po ní se neodermis diferencuje a stratifikuje ̶ Epitelizaci pomáhá vlhké prostředí III. Remodelující fáze ̶ tři týdny až 2 roky ̶ vytváří se nový kolagen, který zvyšuje tenzní napětí v jizvě. ̶ Jizevnatá tkáň je přesto nanejvýš z 80% stejně silná jako tkáň původní. Tvorba jizvy ̶ Proces hojení je velmi podobný ve všech tkáních a je relativně nezávislý na typu poškození, malá variabilita je v relativním podílu různých elementů, které se na výsledku hojení podílejí. ̶ Konečným produktem hojení je jizva. Jedná se o relativně avaskulární a acelulární masu kolagenu, která slouží k obnovení tkáňové integrity, síly a funkce. ̶ Zpoždění v procesu hojení vede k dlouhodobému nezhojenému defektu, zatímco ̶ abnormální proces hojení vede k tvorbě abnormálních jizev. Remodelační fáze ̶ Během remodelační fáze fibroblasty opustí místo rány a kolagen je remodelován do organizovanější matrix. ̶ Tenzní napětí zhojené rány se zvyšuje až do jednoho roku po poškození. Kožní defekty mají výsledně 70-80% původní „síly“. Hojení se může zpozdit několika faktory: ̶ Ischémie ̶ Suché okolí rány ̶ Infekce ̶ Cizí tělesa ̶ Protizánětlivá terapie ̶ Nutriční deficity Místní faktory ovlivňující hojení ran ̶ Mechanické poškození ̶ Infekce ̶ Edém ̶ Místní podmínky (vlhkost, pH …) ̶ Ischémie/nekróza ̶ Ionizující záření ̶ Nízká pO2 ̶ Cizí tělesa Regionální faktory ovlivňující hojení ran ̶ Arteriální insuficience ̶ Venózní insuficience ̶ Neuropatie Systémové faktory ovlivňující hojení ran ̶ Neadekvátní perfúze ̶ Zánět ̶ Výživa ̶ Metabolické nemoci ̶ Imunosuprese ̶ Nemoci pojivové tkáně ̶ Kouření Hojení: akutní rány ̶ Akutní rána se obvykle hojí kontinuálně a v odhadnutelném časovém horizontu ̶ Obyčejně se hojí per primam ̶ Zvýšená reaktivita během hojení akutních ran: ̶ Keloidy ̶ Hypetrofické jizvy Hojení: chronické defekty ̶ V případě selhání nebo opoždění hojivého procesu ̶ Neodpovídavost na normální růstové signály ̶ Opakované trauma, špatná perfúze /oxygenace tkání, excesivní zánět ̶ Systémová onemocnění ̶ Genetické faktory Hojení u DM International Journal of Research in Medical Sciences 2017: 5(10):4206 Děkuji za pozornost „I just need a closer look...“ Inflamasom ̶ Multiproteinové komplexy, které se aktivují při zánětu. ̶ Inflamasom se obvykle skládá z cytoplasmatické senzorové molekuly (NLRP3), adaptačního („apoptosis associated specklike protein containing caspase recruitment domain“) proteinu a efektorové prokaspázy-1. ̶ Inflamasom reguluje aktivaci kaspázy -1, což má za následek sekreci interleukinu- 1β a interleukinu-18. ̶ K aktivaci inflamasomu vedou infekce, stres nebo jiné imunologické signály, které se účastní zánětu. ̶ NLRP3 inflamasom se účastní imunologických regulací, interakcí receptor-ligand během zánětu, „microbialassociated molecular patterns“, „danger“ a „pathogen associated molecular patterns“. ̶ Účastní se taky cytokinových a chemokinových zánětlivých reakcí v PNS a CNS. 106 J Mol Biol. 2017 Oct 12. pii: S0022-2836(17) 30471-0. doi: 10.1016/j.jmb.2017.10.001 „THE SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE SYNDROME“ (SIRS) 107 ̶ Klinická manifestace nespecifického zánětu, významná příčina morbidity a mortality a vedoucí příčina smrti na jednotkách intenzivní péče. ̶ SIRS může být iniciován mnoha příčinami, včetně infekce, závažnost kolísat až k život ohrožujícímu stavu. Závažné poškození nebo infekce ̶ Závažné poškození nebo infekce začínají tím, že jsou rozpoznány alarminy, které se primárně skládají z mikrobiálních produktů a poškozené tkáně. ̶ Vrozený imunitní systém na základě vrozených rekogničních receptorů (PRRs – „pattern recognition receptors“) rozpoznává cizí antigeny a poškozené buňky. PRRs jsou exprimovány na mnoha buněčných liniích (myeloidní, endoteliální a epiteliální). ̶ PRRs detekují konzervované mikrobiální komponenty zvané „pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)“, stejně jako hostitelské molekuly derivované z poškozených buněk, známě jako „damage-associated molecular patterns (DAMPs)“. 108 Front Immunol. 2018; 9: 595. PRRS ̶ PRRs zahrnují Toll-like receptory (TLRs), C-type lectin receptory (CLRs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs), retinoic-acidinducible gene-I (RIG-I)-like receptors (RLRs) a receptor pro získané produkty glykaces (RAGE). ̶ Velký počet, diverzita a redundance se uplatňují v rámci optimalizace imunitní odpovědi. 109 PRRS ̶ Na základě rozpoznání hostitelských PAMPs nebo DAMPs PRRs iniciují komplexní soubor signálních událostí , které indukují hostitelskou obranyschopnou odpověď. Jedná se o povolávání a fosforylaci intracelulárních intermediálních látek, což vede částečně k aktivaci genů okamžité odpovědi. ̶ PRRs aktivace a následná signalizace vede k nespecifickým i pro patogen specifickým buněčným odpovědím, které mají zajistit eliminaci stresorů nebo prevenci jejich uplatnění. Těmito stresory jsou mikrobiální infekce nebo tkáňové poškození. ̶ Suprese mikrobiální replikace, invaze Mb do tkání a diseminace z místa infekce zahrnují mnoho buněk vrozeného imunitního systému: neutrofily (PMNs), monocyty/makrofágy (Mφ), dendritické buňky (DCs), natural killer (NK) buňky a innate lymphoid cells (ILCs) . Tyto buňky hrají klíčovou roli v časné zánětlivé odpovědi. 110 Toll-like receptory ̶ Zatím u člověka známo 13 různých TLRs. ̶ Některé exprimovány na plasmatické membráně buněk (TLRs 1, 2, 4, 5, 6) jako konstantní součást lokálního prostředí ̶ Jiné jsou v endosomálních kompartmentech (TLRs 3, 7, 8, 9, 11, 12, 13), kde vnímají signály nebezpečí pro hostitele, mikrobiální proteiny a nukleové kyseliny. ̶ TLRs na plasmatických membránách detekují vnější mikrobiální komponenty a cirkulující signály poškození, jako jsou lipopolysacharidy (LPS), fosfolipidy, zymosan, flagellin, peptidoglycan, S100A8/9 a „endogenous high-mobility group box (HMGB)“ nukleární proteiny z buněk poškozených distresem. ̶ Cytoplasmatické TLRs detekují virové nebo mikrobiální nukleové kyseliny a mitochondriální nukleové kyseliny asociované se poškozením buňky. ̶ TLRs hrají centrální roli v iniciaci vrozené imunitní odpovědi ve spolupráci s jinými PRRs prostřednictvím různých i přesahujících se pathways. 111 NETosis and patophisiology of disorders ̶ Neutrophil extracellular traps (NETs) are formed by activated neutrophils during the process of NETosis in which the nuclear material is released into extracellular space, including DNA molecules, citrullinated histones, and neutrophil granule enzymes, such as elastase. This material forms networks that are able not only to physically entrap bacteria but also to provide elevated concentration of bactericidal components. Inflammation Research May 2017, Volume 66, Issue 5, pp 369–378 Nádorové buňky se neřídí regulačními signály pro buněčnou smrt zdravé buňky mohou žít jen za přítomnosti růstových faktorů, jinak odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i bez růstových faktorů zdravé buňky s poškozenou DNA odumírají apoptózou x nádorové buňky přežívají i s poškozenou DNA rezistence k apoptóze je jedním z důvodů prodloužené životaschopnosti nádorových buněk Apoptóza a nádory zvýšená exprese bcl-2 zaznamenána u různých pevných nádorů, leukémií i lymfomů zvýšená exprese bcl-2 je nepříznivý faktor: zvýšená odolnost na chemoterapii terapie zaměřené na ovlivnění apoptózy se mohou uplatnit při léčbě některých nádorových i nenádorových chorob