Imunologické laboratorní metody POLYKLONÁLNÍ a MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY • POLYKLONÁLNÍ PROTILÁTKY o Směs imunoglobulinových molekul, jejichž vazebná místa nesou specificitu vůči různým epitopům na celé molekule antigenu o Získávají se obvykle imunizací zvířat • MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY o Produkt jednoho klonu B-lymfocytů, vykazují jedinečnou specificitu proti jednomu epitopu na molekule antigenu o Získávají se obvykle metodikami in vitro Příprava monoklonálních protilátek Využití monoklonálních protilátek • V diagnostice, jedná se o vysoce specifická diagnostická agens používaná v různých oblastech především imunologie a mikrobiologie. • V terapii, k zacílení buněk a molekul důležitých v patogenezi nemocí. Tvoří velkou část tzv. biologických terapií. • Ve výzkumu Typy monoklonálních protilátek používaných k terapii Hohlfeld R et al. (2005) Drug Insight: using monoclonal antibodies to treat multiple sclerosis; Nat Clin Pract Neurol 1 34-44 [doi: 10.1038/ncpneuro0016] Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob • Imunosuprese: anti-CD3 (OKT3), • anti CD25 (basiliximab, daclizumab), • anti CD20 (rituximab) • Blokáda prozánětlivých cytokinů: • anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artitida, Crohnova choroba, • Blokáda adhezivních molekul: • anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza • Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza • Protialergická léčba: • anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu Příklady využití monoklonálních protilátek v léčbě zhoubných nádorů • Protilátky proti anigenům bílých krvinek: • anti CD-20 (rituximab) léčba lymfomů, • anti-CD52 (Alemtuzumab) – léčba lymfomů • Anti-receptorové protilátky: • anti-epidermal growth factor (receptor HER-2) (trastuzumab) – mamární karcinom • anti-epidermal growth factor (receptor EGFR) (cetuximab) – kolorektální karcinom Další příklady využití monoklonálních protilátek v medicíně • Antiagregační léčba: • trombocytární receptor gpIIb/IIIa (abciximab) • Antivirová léčba: • RS virus (palivizumab), • SAR-Cov2 • Osteoporóza • RANKL (Denosumab) • Hyrelipidémie • protein PCSK9 (alirocumab, evolocumab) • Migréna • CGRP nebo jeho receptor (Eptinezumab Erenumab Fremanezumab Galcanezumab) Imunologické laboratorní metody ZÁKLADNÍ DĚLENÍ IMUNOLOGICKÝCH LABORATORNÍCH VYŠETŘENÍ • Serologická vyšetření • základním materiálem pro vyšetření • SÉRUM • Buněčná vyšetření • základním materiálem pro vyšetření • PERIFERNÍ ŽILNÍ KREV • Další zdroje materiálu pro imunologické vyšetření • mozkomošní mok, lymfatické uzliny, bioptické vzorky orgánů, kostní dřeň, bronchoalveolární laváž ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ 4. uchování séra k dalšímu použití • 2 týdny při teplotě 4 °C • měsíce při teplotě –20 °C • roky při teplotě –80 °C 1. odběr venózní srážlivé krve 2. centrifugace 3. přenesení séra do jiné zkumavky SEROLOGICKÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání séra ODBĚR MATERIÁLU K IMUNOLOGICKÉMU VYŠETŘENÍ Krev odebranou pro buněčná vyšetření není většinou možno skladovat delší dobu. Vyšetření je nutné provést do několika desítek minut (vyšetření fagocytárních funkcí) až několika hodin (vyšetření počtu a funkce lymfocytů). BUNĚČNÁ VYŠETŘENÍ – proces získávání buněk protisrážlivé činidlo EDTA protisrážlivé činidlo heparin PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ FÁZE SEROLOGICKÉ REAKCE Primární fáze serologické reakce • pokud je zkoumaná protilátka v séru přítomna, dochází k vazbě protilátky na antigen • není patrná pouhým okem Sekundární fáze serologické reakce • uplatňuje se multivalence antigenu a polyvalence protilátek • vzniká prostorový komplex velkého počtu molekul antigenu a protilátek o vysoké molekulové hmotnosti PŘEHLED METOD PRO STANOVENÍ ANTIGENU NEBO PROTILÁTKY • vizualizace pomocí sekundární fáze reakce o AGLUTINACE - korpuskulární antigen ( erytrocyt, bakterie, latexová částečka) o PRECIPITACE – antigen je rozpustný, molekulární • vizualizace pomocí následné detekce o IMUNOFLUORESCENCE o IMUNOANALÝZA (RIA, EIA, řada modifikací) o IMUNOBLOT, IMUNODOT a g l u t i n a c e princip reakce antigen KORPUSKULÁRNÍ POVAHY • snadná vizualizace proběhlé reakce o díky velikosti antigenu o díky průběhu reakce v tekutině Vazbou dvoj a vícevazebných protilátek na povrch antigenu dojde k překonání odpudivých, způsobených negativním nábojem na povrchu částic (zeta potenciál), a vytvoří se mezi nimi můstky … … vzniká AGLUTINÁT a g l u t i n a c e přímá a nepřímá přímá aglutinace antigeny se nacházejí přímo na zkoumané částici průkaz krevních skupin, přímý Coombsův test, určování izolovaných bakteriálních kmenů (zejména ze skupiny enterobaktérií), Widalova reakce, Weil-Felixova reakce, průkaz některých zoonóz, … nepřímá aglutinace zkoumaný antigen je navázán na povrchu vhodných makromolekulárních částic latex-fixační test, nepřímý Coombsův test, rychlé testy pro ambulantní vyšetření (ASLO), … a g l u t i n a c e určování krevních skupin ANTIGENY NA POVRCHU ERYTROCYTŮ polysacharidové skupinový systém AB0 (antigen A, antigen B) skupinový systém Lewis, P a Ii glykoproteinové skupinový systém Rh (antigen D) skupinový systém MNSs, Lutheran, Kell, Duffy, Diego p r e c i p i t a c e … v kapalinách NEFELOMETRIE měření rozptylu viditelného světla TURBIDIMETRIE měření úbytku prošlého světla viditelné světlo a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky k detekci reakce mezi antigenem a protilátkou se používá enzym (konjugát zvířecí protilátky proti lidské protilátce IgG, IgA nebo IgM značené enzymem) Použití v klinické praxi:  v současnosti zřejmě nejvíce používaná laboratorní metoda v imunologických a klinických laboratořích  průkaz protilátek (antibakteriálních, antivirových, autoprotilátek) nebo antigenů  vysoká citlivost testu umožňuje průkaz analytů o nízké koncentraci  ELISA není vhodná k detekci analytů o vyšší koncentraci (např. koncentrace sérových imunoglobulinů) – vzhledem k nutnosti vysokého ředění vzorků možnost velké chyby stanovení! E L I S A enzyme-linked immunosorbent assay princip reakce ke zjištění koncentrace antigenu nebo protilátky  vazba antigenu na pevnou fázi (jamka mikrotitrační destičky)  inkubace a následné promytí destičky  aplikace séra s předpokládaným výskytem protilátek proti vyšetřovanému antigenu (dojde k vazbě protilátky na antigen)  inkubace a následné promytí destičky  aplikace konjugátu zvířecí (myší, králičí, …) protilátky proti lidskému IgG, IgA nebo IgM konjugované s enzymem  inkubace a následné promytí destičky  aplikace substrátu (bezbarvý substrát  enzym  barevný produkt)  inkubace  zastavení probíhající enzymatické reakce  změření absorbance jamek spektrofotometricky (intenzita výsledného zbarvení je v určitém rozmezí koncentrací přímo úměrná množství navázané protilátky) ELISA READER i m u n o f l u o r e s c e n c e princip reakce zjištění přítomnosti antigenu nebo autoprotilátky k detekci přítomnosti antigenu nebo protilátky se používá fluorochrom (konjugát zvířecí protilátky proti antigenu nebo proti lidské protilátce ve třídě IgG, IgA nebo IgM značené flourochromem) PŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE  detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky ve tkáních pomocí protilátek značených flourochromem  diagnostika puchýřnatých chorob, SLE, porfyrií, vaskulitid, glomerulonefritid a podobně NEPŘÍMÁ IMUNOFLOURESCENCE  detekce přítomnosti specifických protilátek v séru tak, že protilátky přítomné v séru pacienta jsou po vazbě na antigen dárcovské tkáně označené zvířecí protilátkou proti lidským IgG, IgA a IgM imunoglobulinům značenou flourochromem  detekce přítomnosti autoprotilátek Přímá a nepřímá imunofluorescence ANA Pozitive granular type ANA – homogenous type a g l u t i n a c e p r e c i p i t a c e E L I S A i m u n o f l u o r e s c e n c e e l e k t r o f o r é z a i m u n o e l e k t r o f o r é z a i m u n o f i x a c e W e s t e r n b l o t e l e k t r o f o r é z a princip metodiky  nabité částice se pohybují v elektrickém poli  rychlost pohybu částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku NATIVNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA BÍLKOVIN  bez denaturačních činidel  proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje, velikosti a tvaru (citlivost elektroforézy je dána charakterem pórů gelu)  elektroforéza sérových bílkovin (rozdělení proteinů plazmy na 5-6 frakcí)  Využití elektroforézy v klinické praxi:  analýza a dělení směsí bílkovin, charakterizace povrchů organizmů (bakterií, virů a podobně), diagnostika monogenních chorob a podobně Aplikace séra pacientů do elektroforetických drah … … rozdělení sérových proteinů dle náboje, proteinů a velikosti … e l e k t r o f o r é z a albumin alfa 1 globulin alfa 2 globulin beta 1 globulin beta 2 globulin gama globulin elektroforéza sérových bílkovin W e s t e r n b l o t i m u n o b l o t princip metodiky 1. fáze  rozdělení antigenů elektroforézou na gelu 2. fáze  přenos rozdělených antigenů na vhodnou matrici  imobilizace antigenů a zablokování nespecifických vazebných míst  vizualizace antigenů radiograficky, barevnou reakcí, fluorescenčně (specifické protilátky  immunoblotting)  Využití v klinické praxi:  testy na HIV pozitivitu, definitivní test pro BSE, konfirmační test pro hepatitidu B, diagnostika boreliových infekcí elektroforetické dělení bílkovin a jejich následní přenesení na povrch membrány a typizace specifickými protilátkami výsledný protokol blotu … Buněčné laboratorní imunologické techniky DIFERENCIÁLNÍ KREVNÍ OBRAZ odběr nesrážlivé krve do EDTA kojenci děti dospělí LEUKOCYTY 9 – 15 x 109/l 8 – 12 x 109/l 4 – 9 x 109/l GRANULOCYTY/POLYMORFONUKLEÁRY % % % neutrofilní granulocyty 25 - 65 35 - 70 55 - 70 • segmenty 22 - 65 25 - 65 50 - 70 • tyče 0 - 10 0 - 10 3 - 5 eozinofilní granulocyty 1 - 7 1 - 5 2 - 4 basofilní granulocyty 0 - 2 0 - 1 0 - 1 MONONUKLEÁRNÍ LEUKOCYTY % % % lymfocyty 20 - 70 25 - 50 25 – 40 monocyty 7 - 20 1 - 6 2 - 6 CD klasifikační systém (Paříž 1982) CD znaky (CD = cluster of differentiation) • molekuly buněčných membrán prokazované monoklonálními protilátkami (metodikou průtokové cytometrie) • dnes známých více než 400 CD znaků • Využití v klinické praxi: vyšetření absolutního a relativního zastoupení buněčných subpopulací pomocí průtokové cytometrie (v imunologii rutinně vyšetření T-lymfocytárních, B-lymfocytárních subpopulací a NK buněk) • Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) LYMFOCYTÁRNÍ SUBPOPULACE CD ZNAKY PROCENTUÁLNÍ ZASTOUPENÍ Z LYMFOCYTŮ T lymfocyty CD3+ 58 – 85 % Th lymfocyty CD3+CD4+ 30 – 60 % z CD3+ Tc lymfocyty CD3+CD8+ 15 – 35 % z CD3+ B lymfocyty CD19+ 7 – 23 % NK buňky CD16+/56+ 6 – 20 % Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE • využívá principu přímé imunofluorescence • buňky jsou inkubovány s protilátkou proti konkrétním CD znakům na povrchu buněk imunitního systému, která je označena fluorescenčním barvivem • buňky laminárně proudí tryskou přístroje vystaveny laserovému paprsku světla Průtokový cytometr Průtoková cytometrie http://images.google.cz/imgres?imgurl=http://www.abcam.com/ps/CMS/Images/Flow-Cytometry-Diagram2.jpg& lymfocytes monocytes granulocytes granularity size CD3 CD4 CD3 CD8 CD3 CD8 Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace • Lymfocyty aktivovány • Polyklonálními mitogeny • pro B lymfocyty • pokeweed mitogen (PWM) • pro T lymfocyty • phytohemagglutinin (PHA) • konkanavalin A (ConA) • Specifickými antigeny • tuberkulin • tetanický toxoid