Molekulární diagnostika Iveta Valášková Po staletí jsme vždy klasifikovali sami sebe jakožto zdravé až do chvíle, než se objevily symptomy nemoci. Jakmile byla jednou nemoc diagnostikována, ať již správně nebo nesprávně, obdrželi jsme standardizovanou léčbu. Ve shodě s tímto pohledem bylo lidské tělo v zásadě ignorováno, dokud nezačalo fungovat nesprávně. • Collins, F., (2010) The Language of Life. Profile Books LTD. London, GB. p. 34 James D. Watson, Francis H. Crick Popsali molekulární strukturu DNA Položili tím základ ještě hlubší úrovně genetického výzkumu – molekulární genetiky 1953 Francis Harry Compton Crick James Dewey Watson Maurice Hugh Frederick Wilkins roku 1962 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu, podle komise za „jejich objevy týkající se molekulární struktury nukleových kyselin a jejich významu pro přenos informací v živých systémech“. 1951 Byl získán první jasný rentgenový snímek DNA. "Watson and Crick staring up at their model of the Double Helix is one of the most iconic pictures of the 20th Century. A replica of the model now gathers dust in a glass case in a dark corner of the top floor of the Science Museum. Here, a man glances at it as he walks past. Does he know the story?" Dave Kinahan. Crick and Watson's DNA molecular model, 1953. Francis H. Crick byl jedním z nejvýznamnějších vědců 20. století Hrál klíčovou roli ve výzkumu týkajícího se odhalení genetického kódu (1966) Použil termín "centrální dogma" - jednosměrný tok genetické informace v buňce z DNA na RNA do proteinu 1988 – 1992 byl jedním z ředitelů Human Genome Project v National Institutes of Health, kde dohlížel na mapování genů v lidských chromozomů Jeho genom byl sekvenován v roce 2007 jako druhé osoby, u které to bylo provedeno V roce 2007 byla jeho pověst poskvrněná spornými výroky, které učinil ohledně inteligence Afričanů a intelektuálních rozdílů mezi geograficky oddělenými národy. James D. Watson The “Caligula of Biology” vyvolává další výzvu Watson, J. (2013). Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers Open Biology, 3 (1), 120144-120144 Kary Banks Mullis 1983 technika,která umožňuje mnohonásobnou amplifikaci specifických úseků DNA Tato metoda byla ve své době doslova převratná a nejen že měla obrovský dopad na vědeckou komunitu, ale ovlivnila i mnoho aspektů našeho každodenního života. PCR (polymerázová řetězová reakce) Událost popisuje tak, že během cesty po dálnici 128 ze San Francisca do Mendocina v jeho Hondě Civic ho náhle polymerázová řetězová reakce napadla tak jasně, jako by jí měl v hlavě nakreslenou na tabuli. Kary Banks Mullis Kary Banks Mullis 1983 PCR (polymerázová řetězová reakce) Molekulárně - genetická diagnostika využití PCR • Diagnostika geneticky podmíněných chorob postnatální, prenatální, preimplantační diagnostika, populační screening • Diagnostika nádorových onemocnění  analýza tumorsupresorových genů a onkogenů  diagnostická vyšetření zaměřená na detekci kauzálních markerů  diagnostika pomocí analýz prognostických faktorů onkologických onemocnění  monitorování terapie rakoviny  zjišťování minimální reziduální choroby • Diagnostika infekcí PCR diagnostiky detekující virová, bakteriální, mykotické a parazitální patogeny v různých tělních tekutinách • Farmakogenetika stanovení tolerance k farmakům • DNA typizace osob (soudní lékařství, transplantologie) • Diagnostika infekcí diagnostiky detekujících virová, bakteriální, mykotické a parazitální patogeny v různých tělních tekutinách Cílem je detekovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk Provádí se za použití PCR na DNA nebo cDNA cizirodých organismů Konvenční diagnostické metody -vypěstování organismu v kultuře -detekce přítomnosti organismů za použití protilátek Časově náročné Někdy málo citlivé Molekulárně - genetická diagnostika využití PCR • Diagnostika infekcí HIV Přítomnost virová RNA naznačuje aktivní infekci Lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátu vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk Tuberkulóza Pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů mykobakterií pomocí primerů připraveným k těmto sekvencím Amplifikovaný fragment je hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen Lze detekovat je 10 bacilů na 10000000 eukaryotických buněk Molekulárně - genetická diagnostika využití PCR Molekulárně - genetická diagnostika využití PCR • Diagnostika geneticky podmíněných chorob postnatální, prenatální, preimplantační diagnostika, populační screening • Diagnostika nádorových onemocnění  analýza tumorsupresorových genů a onkogenů  diagnostická vyšetření zaměřená na detekci kauzálních markerů  diagnostika pomocí analýz prognostických faktorů onkologických onemocnění  monitorování terapie rakoviny  zjišťování minimální reziduální choroby • Diagnostika infekcí PCR diagnostiky detekující virová, bakteriální, mykotické a parazitální patogeny v různých tělních tekutinách • Farmakogenetika stanovení tolerance k farmakům • DNA typizace osob (soudní lékařství, transplantologie) 1984 Alec Jeffreys DNA fingerprinting (genetický otisk) Human Genome Project Projekt lidský genom Human Genome Project Projekt lidský genom 1986: Santa Fe James Watson: „vstoupit na cestu od dvojišroubovice k 3 miliardám schodů lidského genomu“ 1988: Kongres USA schválil 15 letý projekt a dotaci 3 mld USD 1990: začátek projektu 2005: předpokladané ukončení $ 3 Billions Walter Gilbert: „až budeme mít v ruce úplnou sekvenci lidského genomu, budeme vědět, co dělá člověka člověkem.“… Human Genome Project Projekt lidský genom Určit úplnou sekvenci genomu (3,2 Gb) Identifikovat a mapovat geny, určit jejiich strukturu a funkci v zdraví i v patologii Pomocné projekty • vytvoření nových technologií  zlepšení technik umožňující fyzikální a genetické mapování  zlepšení technik sekvenování DNA  konstrukce databází • sekvenování genomu pěti modelových organismů E.coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster a Mus musculus • ELSI: Etické, Legální, Sociální Implikace Veřejné Consortium Francis Collins Celera Genomics Craig Venter Veřejné consortium a Celera Veřejné consortium a Celera Genomics: remíza  V únoru 2001 Celera publikuje v Science sekvenování 90% genomu člověka  Ve stejném týdnu publikuje totéž veřejné consortium v časopise Nature  Spory: Veřejné consortium vystavuje výsledky sekvenování průběžně veřejně na síti… …a Celera tato data využívá  Celera Genomics doufá, že by nalezené geny patentovala – to by znamenalo obrovské zisky díky farmaceutickému průmyslu The Genome International Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409,860-621,2001 V davu jsou fotografie Gregora Mendela, Jamese Watsona a Francise Cricka. Venter, J.C. et al.: The sequence of the human genome.Science 291:1304-1351,2001 Human Genome Project Projekt lidský genom V roce 2003 vědci popsali DNA sekvenci 3 miliard párů bazí tvořících lidský genom John Sulston Craig Venter • „Z domova jsem si odnesl myšlenku, že se věci nedělají kvůli penězům. Zač by stál lidský život, kdybychom se v něm nepokusili objevit něco nového?“ • sekvenování genomů pro komerční zisk je "totally immoral and disgusting". • "Speed matters - discovery can´t wait!" • Věda je forma podnikání • Informace je třeba proměnit na peníze • snaha o patentování genů člověka za účelem zisku peněz z patentů Patentování genů Zkompletování lidského genomu je důležitý krok na dlouhé cestě, avšak konečný prospěch pro zdravotnictví může být fenomenální. profesor Allan Bradley, ředitel Wellcome Trust Sanger Institute. Lidský genom • má přibližnou velikost 3,2 Gb • z nichž je 2,95 Gb tvořeno euchromatinem. • 28% sekvencí je transkribováno do RNA a z těchto 28% je pouhých 5% překládáno do proteinů; což je 1,1%-1,4% absolutní velikosti celého genomu člověka. – toto v roce 2012 již není pravda, přepisuje se do RNA snad až 90% genomu – v roce 2013 se předpokládá, že někdy a nějak se přepíše do RNA 100% genomu • Přes 50% genomu je tvořeno repetitivními sekvencemi: 45% genomu je tvořeno jedním ze čtyř typů parazitických DNA elementů, 3% genomu tvoří repetice jen několika bází a 5% genomu je tvořeno recentními duplikacemi velkých segmentů DNA. • Většina parazitické DNA je tvořena reverzními transkripty z RNA. • Lidský genom tak z určitého úhlu pohledu připomíná moře repetitivních sekvencí s malou příměsí genů. • má přibližnou velikost 3,2 Gb, z nichž je 2,95 Gb tvořeno euchromatinem. • 28% sekvencí je transkribováno do RNA a z těchto 28% je pouhých 5% překládáno do proteinů což je 1,1%-1,4% absolutní velikosti celého genomu člověka. toto v roce 2012 již není pravda, přepisuje se do RNA snad až 90% genomu v roce 2013 se předpokládá že někdy a nějak se přepíše do RNA 100% genomu • přes 50% genomu je tvořeno repetitivními sekvencemi: • 45% genomu je tvořeno jedním ze čtyř typů parazitických DNA elementů, • 3% genomu tvoří repetice jen několika bází • 5% genomu je tvořeno recentními duplikacemi velkých segmentů DNA. • většina parazitické DNA je tvořena reverzními transkripty z RNA. Lidský genom Lidský genom tak z určitého úhlu pohledu připomíná moře repetitivních sekvencí s malou příměsí genů. NEKÓDUJÍCÍ SEKVENCE LIDSKÉ DNA Nekódující DNA (98,5%) nachází se mezi geny (extragenová) nebo v genech (intragenová) Single Copy DNA jedinečná Repetitivní DNA 50 % celkové jaderné DNA Mírně repetitivní Vysoce repetitivní (tandemová) LINEs Long interspersed elements. např. lidské Kpn segmenty AT-rich 1.5-6 kb 104-106 bp Satelitní DNA dlouhé repetice kolem centromer a telomer Minisatelity VNTR Variable number Tandem Repeats 15bp repetice náhodně roztroušené Mikrosatelity STR Short Tandem Repeats 2-6 bp repetice náhodně roztroušené a variabilní v počtu opakování v rámci populace SINEs Short interspersed elements. např. lidské ALU segmenty GC-rich 300 bp 105-106 bp 101-105 kopií >105 kopií repetitivní geny (histony, rRNA, tRNA) CNV Copy number variation Lidský genom • 20 500genů kódujících proteiny méně genů než se očekávalo: předpovídalo se 150,000 (před sekvenací), 30-40,000 (2001) • Průměrně 9 genů na 1Mb • Celkem 232 000 exonů (průměrně 10,4 exonu / gen) • Identifikovaných asi 20 000 pseudogenů Organismus Velikost (bp) počet genů Sloupec1 bakteriofág MS2 3 569 první osekvenovaný genom ssRNA viru 1976 bakteriofág MS2 5386 první osekvenovaný genom ssDNA viru 1977 bakterie Haemophilus influenze 1,83 . 106 1740 první osekvenovaný genom prokaryotického organismu 1995 bakterie Escherichia coli 4,6 . 106 4 377 kvasinka Saccharomyces cerevisiae 12,1 . 106 5 770 první osekvenovaný genom eukaryotického organismu 1997 hlístice Caenorhabditis elegans 98 . 106 1900 první osekvenovaný genom vícebuněčného organismu 1999 huseníček Arabidopsis thaliana 157 . 106 25 498 první osekvenovaný genom rostliny 2000 rýže Oryza sativa 430 . 106 60 000 2002 kukuřice Zea mays 2.5 . 109 2 500 pšenice Trticum aestivum 15 . 109 40 - 60 000 octomilka Drosofila melanogaster 137 . 106 13 472 2000 laboatorní myš Mus musculus 2,6 . 109 25 000 člověk Homo sapiens sapiens 3,2 . 109 22 000 první osekvenovaný genom savce 2003 lidská mitochondriální DNA 1,6 . 104 37 Odlišnosti uvnitř druhu Homo sapiens v rámci celého sekvence DNA 0.1 – 0,5% (většina je v nekódujících sekvencích) • 1,5 milionu pb - rozdíl mezi matkou a dítětem • 2,25 milionů pb - rozdíl mezi babičkou a vnučkou • 3 miliony pb - rozdíl mezi dvěma náhodnými lidmi na Zemi Všichni lidé si jsou nápadně podobni 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Pea* Fly Fish Human Ve srovnání s ostatními druhy vykazují lidé velmi malou genetickou variaci Genetickávariabilita(%) p 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Orang-utan Gorilla Chimpanzee Human p Rasismus je mrtvý Moderní populační genetika učinila koncept „rasy“ biologicky beze smyslu, i když je stále sociálně explozívní. Marek Orko Vácha The 1000 Genomes Project 78 různých výzkumných institucí The 1000 Genomes Project Vědci z konsorcia nejprve přečetli kompletní genomy cca 1000 lidí. Vybrali si k tomu reprezentanty čtyř různých etnik - obyvatele západní Afriky, Evropany, Číňany z jižní Asie a Japonce jako reprezentanty obyvatel východní Asie. Aby si udělali detailní představu o tom, kolik změn vzniká v dědičné informaci nově v každé další generaci, přečetli velmi důkladně genomy dvou rodičovských párů a jejich dětí. Počet odhalených variant lidské DNA se díky tomuto počinu zvýšil dvacetinásobně. U genů dnes známe asi 15 milionů variant. Polovina z nich se podařilo odhalit díky konsorciu The 1000 Genomes Project. Z tohoto výzkumu také vyplynulo, že každý z nás má zásadními změnami v DNA vyřazeno z činnosti v průměru 200 až 300 genů. The 1000 Genomes Project Plná polovina variant lidské dědičné informace se vyskytuje s četností nižší než 5 %. Některé vzácnější varianty DNA jsou typické jen pro určitá etnika. V konsorciem zkoumaných populacích Afričanů, Evropanů, Číňanů a Japonců měli příslušníci jediného etnika „monopol“ na třetinu všech variant vyskytujících se s frekvencí nejvýše 0,5 %. Význam jednotlivých variant DNA se může lišit mezi různými etniky. Varianta lidské DNA, která u svých nositelů zvyšuje riziko vzniku glaukomu čili zeleného očního zákalu u Islanďanů a Číňanů. V čínské populaci je však tento případ genetické dispozice podstatně vzácnější. Pravděpodobnost onemocnění je u čínských nositelů této vlohy mnohem vyšší než u Islanďanů. Genetická informace uložena v jádře a mitochondriích Lidský genom Jaderný genom 3 000 Mb cca 22 000 genů Mitochondriální genom 16,6 kb 37 genů Kódující DNA Intragenová DNA 22 tRNA genů 13 strukturárních genů 2 rRNA geny Nekódující DNA Pseudogeny Genové fragmenty Introny Nepřekládané oblasti Unikátní sekvence Repetitivní sekvence Tandemové sekvence Roztroušené sekvence 1% DNA kóduje nějaké znaky Extragenová DNA Lidský genom • jaderný • mitochondrialní Buněčné jádro obklopené mitichondriemi Jaderný genom Každý ze 46 chromosomů člověka je tvoře jednou molekulou dvoušroubovicové Každá DNA molekula je sbalena do chromosomu Jaderný genom Mendelian inheritance DNA se nachází i mimo jádro buňky. V každé buňce se nachází mnoho mitochondrií, Každá obsahuje mitochondriální DNA Mitochondriální genom Mitochonriální dvoušroubovicová DNA tvoří jednu kruhovou molekulu Mitochondriální genom Mitochodrie mají svoji vlastní DNA, relikt z dávné minulosti, kdy oni byli volně žijící organismy. Dokladem toho jsou mírně odlišné genetické kódy nalezené v nonplant mitochondriích. Například: Organism Code Amino Acid (standard) All nonplant species UGA Tryptophan (stop) Mollusks AGA Serine (Arginine) Yeast CUU Threonine (Leucine) Mitochondriální genom Maternální dědičnost Mitochondriální genom mtDNA vs. choroby •Leber hereditary optic neuropathy - mutace v genech MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, and MT-ND6 •mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes- mutace v genech MT-ND1, MT-ND5, MTTH, MT-TL1, and MT-TV •myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - mutace v genech MT-TK, MT-TL1, MT-TH, and MT-TS1 •neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa - mutace v genu MT-ATP6 •nonsyndromic deafness- mutace v genech MT-RNR1 a MT-TS1 •cancer, including breast, colon, stomach, liver, and kidney tumors, cancer of blood-forming tissue (leukemia) and cancer of immune system cells (lymphoma) – somatické mutace •age-related disorders: heart disease, Alzheimer disease, and Parkinson disease - somatické mutace cyclic vomiting syndrome –přestavby rozáhlých segmentů mtDNA Heteroplasmie • daná buňka obsahuje určité procento mutovaných a normálních mitochondrií •od množství mutovaných mitochondrií a také od postiženého orgánu se odvíjí tzv. prahový efekt. To je právě určité množství mutovaných mitochondrií, které právě způsobí daný defekt. Právě z těchto důvodů se mitochondriální nemoci projevují ve kterémkoli věku a klinicky se projevují onemocněním zdánlivě nesouvisejících orgánů. Mitochondriální genom mtDNA vs. choroby Důvody, proč jsou mitochondrie asi 10 krát náchylnější na poškození DNA více než DNA jaderná, jsou tyto: •mitochondriální DNA nemá takové množství opravných systémů jako jaderná DNA, •mitochondrií je v buňce mnoho, tudíž jejích DNA se musí dělit stejně často, ale ne jen jedné mitochondrie ale všech mitochondrií v buňce, tudíž je větší pravděpodobnost chyby, než u jednoho jádra •mitochondriální DNA nemá histony, •mitochondriální DNA je velice blízko dýchacímu řetězci a tudíž i radikálům, které se při reakcích v dýchacím řetězci tvoří, tudíž je mnohem častější poškození její DNA těmito radikály. Mitochondriální genom Jaderná a mitochondriální dědičnost differ in many aspects of their organisation and expression 22 000 1 – 2 % Jaderný a mitochondriální genom ELSI HGP • 3-5% z ročního rozpočtu jde na ELSI (=Ethical, Legal, Social Issues), etické, právní, sociální otázky • Vznikl tak největší etický projekt v historii planety • Právo na genetické soukromí – před pojišťovnami a zaměstnavateli • Opačný problém: zruinování pojišťoven díky tomu, že klient zná svůj genom a volí optimální pojišťovací strategii ELSI HGP • je identifikováno čím dál tím víc lidských genů • pokud budou objeveny geny, které indikují náchylnost ke kriminalitě, inteligenci nebo homosexualitě, jak by na to měla společnost reagovat? • genetika versus kriminalita: když u zločinců manipulujeme prostředí vězením, nemohli bychom též manipulovat jejich genomem? • Kdo bude mít přístup k osobním informacím o složení genomu jedince a jak budou tyto informace využívány? • Kdo je majitelem informace o genomu jedince? • Jak ovlivní informace o složení genomu jedince sebechápání daného člověka a jak tato informace ovlivní přijetí tohoto jedince společností? • Jak informace o genomech jedinců ovlivní přijetí minoritních skupin společností? • Jak připravíme lékaře na nástup „nové genetiky“ a jak připravíme na nástup nové genetiky veřejnost? • Jak připravíme veřejnost, aby byla schopna uvážlivě a kvalifikovaně provést informovanou volbu? ELSI HGP • Jak společnost vyváží nutná vědecká omezení a sociální risk s dlouhodobým prospěchem? • Mělo by se provádět genetické testování, pokud neexistuje terapie? • Měli by mít rodiče právo nechat testovat děti na nemoc, která propukne až v dospělosti? • Jsou genetické testy spolehlivé a interpretovatelné lékařskou komunitou? • Způsobují geny, že se lidé chovají určitým způsobem? • Mohou lidé vždy kontrolovat své chování? • Kde se nachází linie mezi léčbou a vylepšením? • Kdo vlastní geny a další sekvence lidské DNA? • Bude patentování sekvencí DNA omezující pro jejich nedostupnost a zbrzdí se tím vývoj užitečných produktů? ELSI HGP Etické otázky plynoucí z HGP • 1. Vzrůstající informovanost a genetické konstituci jedince a celých populací vede k otázce, kdo by měl kontrolovat získávání těchto informací a kde by tyto informace měly být přístupné. Do této otázky spadají otázky týkající se presymptomatického testování, screening přenašečů, genetický screening prováděný zaměstnavatelem za účelem zjištění vhodnosti uchazeče k dané práci atd. • 2. V nedaleké budoucnosti budu zcela jistě možné manipulovat genom embryí za účelem změny genotypu i fenotypu • 3. Vzrůstající informovanost obhledně genetického základu behaviorálních projevů zřejmě změní naše sebepochopení a ovlivní sociální instituce. • Murray, T.H., (1991) Ethical issues in human genome research FASEB Journal 5,55- 60 ELSI HGP Úmluva na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny . Úmluva o lidských právech a biomedicíně. Členské státy Rady Evropy, další státy a Evropské společenství, signatáři této Úmluvy, KAPITOLA IV Lidský genom Článek 11 Zákaz diskriminace Jakákoliv forma diskriminace osoby z důvodu jejího genetického dědictví je zakázána. Článek 12 Prediktivní genetická vyšetření Vyšetření, která předpovídají geneticky podmíněné nemoci nebo která slouží k určení nositele genu způsobujícího nemoc nebo k odhalení genetické predispozice nebo náchylnosti k nemoci, lze provést pouze pro zdravotní účely nebo pro vědecký výzkum spojený se zdravotními účely a v návaznosti na odpovídající genetické poradenství. Článek 13 Zásahy do lidského genomu Zásah směřující ke změně lidského genomu lze provádět pouze pro preventivní, diagnostické nebo léčebné účely, a to pouze tehdy, pokud není jeho cílem jakákoliv změna genomu některého z potomků. Článek 14 Zákaz volby pohlaví Použití postupů lékařsky asistované reprodukce nebude dovoleno za účelem volby budoucího pohlaví dítěte, ledaže tak lze předejít vážné dědičné nemoci vázané na pohlaví. .Zákon 373/2011Sb. o specifických zdravotních službách a 372/2011 Sb. o zdravotních službách Genetickým laboratorním vyšetřením se rozumí laboratorní analýza lidského zárodečného genomu nebo jeho částí. Osoba, které je nabízeno genetické laboratorní vyšetření, má právo • na svobodné a informované rozhodnutí týkající se vyšetření, dalšího nakládání s genetickým materiálem a informacemi získanými během vyšetření. • na podání informace o jeho účelu, povaze a dopadu na zdraví, včetně zdraví budoucích generací, a o rizicích neočekávaných nálezů pro pacienta a geneticky příbuzné osoby Výsledky genetických vyšetření nesmějí být bez písemného souhlasu pacienta poskytnuty třetím osobám. Prodej nebo darování výsledků genetických vyšetření třetím osobám bez písemného souhlasu pacienta, včetně písemného souhlasu dotčené geneticky příbuzné osoby, je zakázán. Výsledky genetického vyšetření nesmějí být použity k jakékoli diskriminaci pacienta a geneticky příbuzných osob. Společnost lékařské genetiky ČLS JEP vydala v souvislosti s přijetím zákonů 373/2011Sb. o specifických zdravotních službách a 372/2011 Sb. o zdravotních službách doporučení týkající se informovaného souhlasu pro genetická laboratorní vyšetření.