Lékařská genetika Iveta Valášková Pan Mendel by měl jistě radost aneb co dokáže moderní genetika v medicíně při péči o pacienta Pronásledovaná genetika V zemích komunistického bloku byla genetika nejprve považována za pavědu, až v 60. letech se to změnilo a genetika se začala vyučovat na vysokých školách. V roce 1965 se konalo v Brně přelomové Mendel Memorial Symposium, které za účasti snad pěti stovek odborníků z celého světa v nově otevřené Janáčkově opeře. Tenkrát jsme se i my za Československo znovu přihlásili k Mendelovi. Prvé začátky rozvoje lékařské genetiky po letech zavržení datujeme do roku 1963. Tehdy byla ustavena Komise pro lékařskou genetiku. Samostatná Společnost lékařské genetiky ČLS byla založena v r. 1967. Mnoho lékařů si z dob svých studií pamatuje, že lékařská genetika se zabývá relativně vzácnými monogenními onemocněními či chromozomálními poruchami. S výjimkou pediatrů a gynekologů-porodníků se většina lékařů v primární péči s těmito chorobami setkávalo velmi vzácně, a lékařskou genetiku proto považovali za okrajový obor medicíny. Současný rychlý vývoj molekulárně genetických metod, překotné odkrývání lidského genomu a systematický popis polymorfismů jednotlivých nukleotidů (SNPs) lékařskou genetiku posouvají z periferie akademické medicíny do centra každodenní praxe. Lékařská genetika 154 let po Mendelovi Genetika hraje důležitou roli v medicině! Lékařská genetika je samostatným vědním oborem v systému lékařských věd. Specifickými metodami analyzuje podíl dědičnosti, genetických změn a faktorů prostředí v etiologii a patogenezi chorob a vrozených vad. Její význam velmi rychle vzrůstá, neboť po zvládnutí hlavních problémů předchozích generací - podvýživy a infekcí – v současné klinické praxi převažují genetické choroby a vady, včetně chorob vyvolaných zhoršováním životního prostředí u osob s genetickými dispozicemi. Moderní genomické metody, mezi něž celá plejáda vysoce citlivých a přesných metod, umožňují identifikaci specifických genetických změn způsobujících onemocnění. Velké změny genomu lze studovat cytogenetickými metodami. Analýzou změn rozsahem příliš malých pro cytogenetické vyšetření a studiem vlivu těchto změn na zdravotní stav člověka se zabývá molekulární genetika. Moderní technologie molekulární genetiky dokáží identifikovat i velké přestavby genomu a postupně nahrazují klasické cytogenetické postupy. Lékařská genetika Genetická onemocnění onemocnění, která jsou přenášena (děděna) v rámci rodiny z rodičů na potomky. Genomové (polyploidie, aneuploidie) – dojde ke změně celého genomu (početní aberace) Chromozomové – mutační změna postihla strukturu chromosomu (strukturní aberace) Genové – mutační změna v genu (změny sekvence DNA) Diagnostika genetických onemocnění početní strukturní sekvenční změny DNA aberace chromosomů Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Diagnostika genetických onemocnění Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Cytogenetika Vyšetření karyotypu (hodnocení barvených metafázických chromosomů v optickém mikroskopu) Karyotyp je soubor všech chromosomů v jádře buňky. V buněčných jádrech určitého druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromosomů a jako takový se používá jako druhový znak • vyžaduje kultivaci získaných buněk ve speciálním médiu Molekulární cytogenetika Nezbytnou metodou zjišťování chromosomových aberací je fluorescenční in situ hybridizace (FISH). • umožňuje pomocí fluorescenčně značených sond vizualizaci konkrétních chromosomů nebo jejich oblastí nejen na mitózách, ale i v interfázních jádrech • prokáže i malé změny, které klasickou cytogenetickou analýzou není možno stanovit. Další využívané metody vyšetření patří • komparativní genomová hybridizace (CGH) • multicolour FISH (m-FISH), které jsou používané pro upřesnění a dořešení výsledků vyšetření. K hodnocení preparátů jsou používány mikroskopy s fluorescenčními filtry, digitální kamerou a připojeného softwaru Lucia Laboratory Imaging pro snímání a archivaci obrázků. Multicolour FISH Početní chromosomové aberace Downův syndrom Početní chromosomové aberace Početní chromosomové aberace Downův syndrom Strukturní chromosomové aberace Syndrom Di George • vrozené srdeční vady • typické konotrunkální vady • faciální dysmorfie • hypoplasie - aplasie thymu - event. příštitných tělísek • munodefekty • hypoparathyreoidismus Strukturní chromosomové aberace Syndrom Di George Molekulárně genetické metody V poslední době došlo díky významným objevům v oblasti molekulární biologie k prudkému rozvoji celé řady nových moderních technik, které podstatně zvýšily citlivost a přesnost molekulárně genetických testů. Molekulární diagnostika Analýza začíná izolací DNA ze vzorku. Biologický materiál pro izolaci DNA Teoreticky z jakéhokoliv dostupného biologického materiálu (s jádrem) Molekulární diagnostika Analýza začíná izolací DNA ze vzorku. Obvykle se k tomu používá směs chloroformu a fenolu nebo solný roztok, který oddělí DNA od ostatní hmoty buněčného jádra. Automatická izolace vychytání DNA pomocí magnetických kuliček Molekulární diagnostika Izolační postup většinou nedodá dostatek DNA pro analýzu, takže dalším postupem je umělé zvýšení množství DNA ve vzorku za použití technicky nazývané "polymerázová řetězová reakce" (PCR) Metody molekulární diagnostiky •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •PCR s alelově specifickými primery (ARMS) •PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA •Analýza teploty tání PCR produktu pomocí real-time PCR •Triplet primed PCR (TP PCR) •Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA) •jednořetězcový konformační polymorfizmus (SSCP) •denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) •heteroduplexní analýza (HD) •detekce zkráceného proteinu (PTT) •denaturační vysokotlaká kapalinová chromatografie (DHPLC) •analýza teploty tání na real-time PCR, analýza teploty tání s vysokým rozlišením (HRM) •sekvenování •masivně paralelní sekvenování Kary Banks Mullis 1983 technika,která umožňuje mnohonásobnou amplifikaci specifických úseků DNA Tato metoda byla ve své době doslova převratná a nejen že měla obrovský dopad na vědeckou komunitu, ale ovlivnila i mnoho aspektů našeho každodenního života. PCR (polymerázová řetězová reakce) Pipetování Elektroforéza K analýze jsou fragmenty vytříděny elektrofrézou druhem elektrického "závodu". DNA má negativní elektrický náboj a je přitahována ke kladné elektrodě, tak jako se vzájemě přitahují jížní a severní pól na magnetu. Elektroforéza Real-time PCR Real-time PCR - HRM Sekvenace Celý obor ženou v posledních letech neskutečně rychle dopředu technologie. New Applied Biosystems SeqStudio Genetic Analyzer Celý obor ženou v posledních letech neskutečně rychle dopředu technologie. Sekvenování nové generace („next-generation sequencing“, NGS) Revoluční technologie. Poskytuje levné, správné a přesné informace o genomické sekvenci. Tato technologie od svého uvedení postupně téměř ovládla oblast základního či aplikovaného výzkumu zabývajícího se analýzou DNA. Stratton et al. 2009 Nature 458:719-724 Vývoj sekvenačních metod za posledních 30 let 96 DNA fragmentů sekvenováno zároveň Miliony DNA fragmentů sekvenováno zároveň Miniaturizace a paralelizace Kapilární vs. Masivně paralelní sekvenování MPS V současné době se MPS v klinické diagnostice přesunuje od sekvenování malého rozsahu zaměřeného na analýzu jednotlivých genů nebo vybraných skupin genů asociovaných s konkrétním onemocněním k panelovému sekvenování až stovek genů asociovaných s diagnózou až k exomovému sekvenování se zaměřením na klinicky významné geny. „Bohaté“ laboratoře už nyní sekvenují celogenomově. Rozlišují se postupy: amplikonové sekvenování - využití zejména k ultrahlubokému sekvenování (hybridization-based capture sequencing, Hyb-Seq - panelové sekvenování – sekvenační knihovna je připravena hybridizací sond komplementárních k cílové sekvenci zájmu) – využití k ultraširokému sekvenování Panelové sekvenátory firmy Illumina - využití v diagnostice Celogenomové sekvenátory firmy Illumina - využití ve výzkumu Technologie single-molecule sekvenování třetí generace sekvenování • Představuje výraznou změnu ve vývoji nových sekvenačních metod • Nevyužívá žádný amplifikační krok před vlastním sekvenováním, což zkracuje dobu přípravy DNA a snižuje chybovost pramenící z amplifikace DNA • Redukuje cenu • Umožňuje vyšší flexibilitu v délce čtení • Umožňuje přesnou kvantifikaci DNA molekul, protože signál je zaznamenáván v reálném čase Celogenomové sekvenování: všechny varianty v jednom experimentu Genom se ‘všemi’ variantamiDNA z krve/slin Přesnost Rychlost Cena Masivně paralelní sekvenování Přesnost Krátké čtení sekvence spolehlivé pro většinu aplikací Průměrné sekvenční pokrytí spolehlivé pro detekci bodových mutací Dlouhé čtení sekvence lepší pro strukturální variace, opakované expanze, ale vysoká míra chyb pro detekci variace jednotek nukleotidů Rychlost Technologie krátkého čtení umožňuje sekvenaci exomu a genomu ve dnech Lze sekvenovat tisíce genomů na jednotlivých platformách ročně Dlouhá čtení genomů stále trvají delší dobu . 1980 byla schopna jedna laboratoř sekvenovat 1 000 pb za den, 2000 1 000 pb za vteřinu. 2003 byl přečten genom člověka za 3 miliardy dolarů. 2005 byl přečten genom šimpanze za 50 milionů dolarů. 2007 byl publikován první genom konkrétního člověka, C. Ventera za 100 milionů dolarů. 2008 publikován genom J. Watsona - sekvenován za čtyři měsíce, za jeden milion dolarů V r. 2011 sekvenování genomu trvá jeden den, stojí 1 000 dolarů a je sekvenováno 1 000 lidí. V r. 2016 je cena pod 1 000 dolarů a sekvenování genomu kohokoli z nás trvá několik hodin. Masivně paralelní sekvenování Cena za přečtení jedné báze DNA klesla během minulých deseti let více než milionkrát. Takto prudké snížení nemá precedens v dějinách ekonomie zboží na světě Náklady na sekvenování lidského genomu (s rozumnou kvalitou pro identifikaci variant) Joris Veltman The 100,000 Genomes Project The UK 100,000 Genomes Project by Dr. Richard Scott, clinical lead Genomics England 19 evropských zemí (do 12. 11. 2018) podepsalo prohlášení o poskytnutí přístupu napříč hranic k jejich genomové informaci. Jedná se o významnou událost pro evropský zdravotní výzkum a klinickou praxi: sdílení více genomických dat zlepší porozumění a prevenci nemocí, což umožní lépe individuální léčbu (a cílené léky), zejména u vzácných onemocnění, rakoviny a nemocí souvisejících s mozkem. Toto prohlášení předpokládá zejména: • Sloučit fragmentovanou infrastrukturu a odborné znalosti podporující společný a hmatatelný cíl: Jeden milion genomů dostupných v EU do roku 2022; • Využít a maximalizovat investice, které již provedly členské státy na vnitrostátní úrovni a na úrovni EU, zejména v oblasti sekvencování, biobankovnictví a datové infrastruktury; • Dosažení větší kohorty, která poskytne dostatečnou míru pro nový klinicky účinný výzkum. Česká republika patří k zakládajícím zemím - 10. 40. 2018, • určení haploskupin, mt skupin • sekvenace 1000 genomů/90 mil. Kč Vyspělé technologie umožňují molekulárním genetikům získat stále více informací o genetické výbavě analyzovaného člověka. Otázka je: Víme, jak s nimi naložit? Víme, jak je použít ve prospěch člověka? Vissers, Gilissen & Veltman. Nat Rev Genet 2016 Identifikace genů Stephen Kingsmore, M.D., D.Sc., president and CEO of Rady Children’s Institute for Genomic Medicine at Rady Children’s Hospital-San Diego rekord pro nejrychlejší diagnózu sekvenováním genomu. 2016 – 26 hodin 2018 - 19.5 hodin! GUINNESS WORLD RECORDS Sekvence naší DNA, vhodně zašifrovaná, se zanedlouho stane standardní součástí naší elektronické zdravotní dokumentace. Collins, F., (2010) The Language of Life. Profile Books LTD. London, GB. Problematickou část genetické analýzy představuje interpretace výsledků, již by měl se vší obezřetností provádět pouze odborník. Výpovědní hodnota některých genetických variant je vysoká, zatímco u jiných je nejasná. Jen asi sedm tisíc nemocí je monogenních (cystická fibróza, hemofilie), zatímco většina znaků i nemocí je důsledkem složité souhry mnoha genů, často v kombinaci s působením vlivů prostředí. Interpretace genetických analýz Predikční programy patogenicity Kircher et al. Nat Genet 2014; Lelieveld, Veltman & Gilissen. Hum Genet 2016 Klasifikace variant: ACMG-AMP doporučení American College of Medical Genetics and Genomics Association for Molecular Pathology 2015 - týká se pouze sekvenčních variant K čemu? - nutný vznik jasného klasifikačního systému po nástupu NGS technologií a celoexomových a celogenomových sekvenačních platforem – vysoká frekvence genetických variant - vyloučení subjektivního hodnocení variant a sjednocení klasifikace detekovaných variant napříč různými laboratořemi => 5 tříd - pro každou třídu existují specifická klinická doporučení (publikováno 2015) Klasifikační systém - kvalitativní zhodnocení dostupných informací o variantě => 28 definovaných kritérií = důkazů s přiřazeným kódem a hodnotou (stand-alone, very strong, strong, moderate, supporting) a směřováním (benign/pathogenic) - dle navazujících pravidel pak zařazení varianty do jedné z kategorií 5) patogenní 4) pravděpodobně patogenní 3) varianta nejasného významu 2) pravděpodobně benigní 1) benigní ACMG-AMP doporučení De novo mutace neexistují!? Whole genome sequencing (WGS) Celogenomové analýzy prokázaly De novo mutace – jsou to mozaiky u rodičů, které jsme neviděli Zárodečný genom - nutno analyzovat všechny zárodečné listy Zárodečný list tři hlavní skupiny buněk, které vznikají během embryogeneze ektoderm vyvíjí se ve stadiu gastruly společně s entodermem. Vzniká z něj většina epitelů, pokožka a její deriváty (vlasy, nehty), výstelka začátku a konce zažívací trubice, dále například čichové buňky, mozeček, tyčinky, čípky, dřeň nadledvin. Specifickým typem ektodermu je neuroektoderm, z něhož vzniká nervová soustava a neurální lišta. entoderm Z entodermu se vyvíjí epitel trávicí soustavy(vyjma části úst, hltanu a řiti). Také z něj vznikají buňky lemující obě žlázy, které jsou otevřeny do trávicí soustavy (játra, slinivka břišní), epitel Eustachovy trubice, část středního ucha, epitel průdušnice, průdušky a plicních alveol, povrch močového měchýře a části močové trubice mezoderm Mezi lidské orgány mezodermálního původu patří například svaly, kostra, oběhová soustava, Vylučovací soustava, pohlavní soustava, v podstatě však také orgány vzniklé ze stěn coelomu (např. část cévní soustavy) a dále struna hřbetní Detekce mozaicismu Vyšetření třech zárodečných listů • Ektoderm – izolace DNA z bukálního stěru • Mezoderm - izolace DNA z periferní krve • Entoderm - izolace DNA z moči Molekulárně genetická diagnostika  motor personalizované medicíny  liquid biopsy  neinvazivní prenatální screening  prekoncepční testování Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 1) genetický  genetické příčiny jsou dnes odhalovány u stále většího počtu onemocnění 2) diagnostický  v okamžiku, kdy jsou genetické faktory podílející se na vzniku onemocnění jsou zavedeny diagnostické testy do běžné klinické praxe  musí však být potvrzena jejich klinická validita a ověřen jejich užitek  dokážou určit nebo upřesnit diagnózu 3) prediktivní  slouží k určení nositele patologické varianty genu asociovaného s nemocí odhalení genetické predispozice nebo náchylnosti k nemoci  vyšetření, která předpovídají geneticky podmíněné nemoci před její manifestací 4) prognostický  stanovení rizika dědičného přenosu 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky 6) terapeuticko-indikační  pomocí genetických testů je možné dopředu určit, kteří jedinci budou mít největší prospěch z užívání konkrétního léku a u kterých pacientů bude naopak podávání léku spojeno se špatnou odpovědí a častými a závažnými nežádoucími účinky  motor personalizované medicíny a cílené biologické léčby Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 1) genetický  genetické příčiny jsou dnes odhalovány u stále většího počtu onemocnění Identifikace genů asociovaných s chorobani Fernandeze-Marmiesse et al. Current Medicinal Chemistry 2018 Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 2) diagnostický  v okamžiku, kdy jsou genetické faktory podílející se na vzniku onemocnění jsou zavedeny diagnostické testy do běžné klinické praxe  musí však být potvrzena jejich klinická validita a ověřen jejich užitek  dokážou určit nebo upřesnit diagnózu stanoví nebo upřesní diagnózu Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 3) prediktivní  slouží k určení nositele patologické varianty genu asociovaného s nemocí odhalení genetické predispozice nebo náchylnosti k nemoci  vyšetření, která předpovídají geneticky podmíněné nemoci před její manifestací umožňují prediktivní diagnózu, tzn. identifikaci genetických onemocnění před jejich manifestací Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea (HD – Huntington’s Disease) • Je porucha poprvé popsaná v roce 1872 americkým lékařem Georgem Huntingtonem. • Jedná se o neurodegenerativní autosomálně dominantně dědičné onemocnění • Patří mezi polyglutaminové poruchy • Má incidenci 4–10 na 100 000. • Manifestuje se nejčastěji ve středním věku. • Mezi příznaky dominuje porucha motoriky, změny osobnosti, progredující demence a nakonec smrt. Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 3) prediktivní Asociována s genem HTT (objeven v roce 1993). Gen kóduje protein huntingtin. • Přesná funkce proteinu stále není známa • Predominantně je exprimován v CNS. • Interaguje s řadou transkripčních faktorů, je tedy pravděpodobná jeho významná role při normálním vývoji CNS, • Rovněž byla demonstrována jeho důležitost pro normální průběh mitózy v CNS http://sk.tdmed.ru/diagnoz/24849-hvoroba-gentngtona-simptomi-lkuvannya.html Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea Příčina onemocnění zmnožené opakování tripletů CAG, což je kodon pro glutamin •normální jedinci nesou ve svém genu 9–35 repetic CAG, •postižení jedinci jich mají více než 40. Čím je počet repetic větší, tím je nástup onemocnění časnější. Expandovaná repetice se dědí od postiženého rodiče. Při přenosu ovšem někdy dochází během replikace před tvorbou gamety k další expanzi této repetice. Může proto nastat situace, kdy má rodič počet repetic při horní hranici normy - premutace, tj. je zdravý, potomek však získává alelu expandovanou, takže u něj nemoc propukne. Expanze se u HD objevuje častěji během mužské gametogeneze což je důvod, proč jsou těžké, časně se objevující formy s počtem repetic 70–120 děděny od otce. Mohou se objevit i nové mutace – asi 25 % pacientů má negativní rodinnou anamnézu. Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea K dispozici je přímé genetické testování na přítomnost expanze v genu HTT • zjištění statutu pacienta v genetickém riziku •prenatální •preimplantační diagnostice Vzhledem k neexistenci léčby je testování spojeno s psychickými a etickými problémy •hrozí psychická traumatizace pacienta, •deprese •v krajním případě i sebevražda. Proto je k testování třeba přistupovat s rozvahou a pečlivě informovat pacienta o veškerých aspektech testování. Před prediktivním (presymptomatickým) molekulárně genetickým vyšetřením na HD se postupuje podle speciálního protokolu, který kromě opakovaných konzultací s klinickým genetikem zahrnuje také vyšetření neurologické, psychiatrické a psychologické. Vyšetření dětí a nezletilých osob v riziku na základě zájmu/žádosti jejich rodičů je nepřípustné (zachování práva nevědět). HD je charakterizovaná selektivní ztrátou neuronů v bazálních gangliích, která se podílejí na koordinaci pohybů. Oranžové inkluzní tělísko v jádře postiženého neuronu v popředí, modrá jádra zdravých neuronů v pozadí Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 4) prognostický  stanovení rizika dědičného přenosu Příklad Frekvence heterozygotů Frekvence postižených jedincůFrekvence nepostižených jedinců A2 x 2Aa x a2 = 1 DÁRCOVSKÝ PROGRAM IVF Riziko vybraných recesivních chorob pro potomky pacientek využívajících dárcovské spermie/vajíčka/embrya počítané dle Hardy-Weinbergova zákona Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 4) prognostický  stanovení rizika dědičného přenosu Příklad Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocnění Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Nevyšetřený Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30* 1/30 * 1/30 * 1/4 a 1/3600; 0,028 % SMA MLPA 95,00 % 1/40** 1/40 * 1/40 * 1/4 a 1/6400; 0,016 % Prelinguální hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30*** 1/30 * 1/30 * 1/4 a 1/3600; 0,028 % Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocnění Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Homozygot b (AA) Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9084)] * 1/30 * 1/4 a 1/39 301 SMA MLPA 95,00 % 1/40 [1/40 * (1 – 0,9500)] * 1/40 * 1/4 a 1/128 000 Prelinguální hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9900)] * 1/30 * 1/4 a 1/360 000 Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 4) prognostický  stanovení rizika dědičného přenosu Příklad Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocně ní Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Homozygot b (AA) Homozygot b (AA) CF Devyser 90,84 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9084)]2 * 1/4 a 1/429 053 SMA MLPA 95,00 % 1/40 [1/40 * (1 – 0,9500)]2 * 1/4 a 1/2 560 000 Prelinguál ní hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9900)]2 * 1/4 a 1/36 000 000 Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocně ní Metoda detekce Pravděpodobnos t stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Heterozygot (Aa) Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30 1/1 * 1/30 * 1/4 a 1/120; 0,833 % SMA MLPA 95,00 % 1/40 1/1 * 1/40 * 1/4 a 1/160; 0,625 % Prelinguáln í hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 1/1 * 1/30 * 1/4 a 1/120; 0,833 % Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky umožňují identifikaci přenašečů genetických onemocnění (např. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob umožňují prenatální a preimplantační diagnostiku odhalují závažné genetické onemocnění před narozením dítěte Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob  Za nejvhodnější dobu k provedení screeningu je považováno období před početím.  Většinou se jedná o období rané dospělosti.  V tomto období je k dispozici nejvíce reprodukčních možností, pokud se zjistí, že jsou oba partneři přenašeči autozomálně recesivní choroby K reprodukčním možnostem dostupným před početím patří • upuštění od (dalšího) těhotenství • přijetí rizika, že se narodí dítě ovlivněné chorobou • adopce • prenatální diagnostika s možností ukončit nebo neukončit ovlivněné těhotenství • preimplantační genetická diagnostika při technikách in vitro fertilizace (IVF) • náhradní mateřství • použití darovaných spermií/vajíčka od jedince, který není přenašeč. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob Kritéria volby nemocí (1) Screeningový program by měl odpovídat na potřeby společnosti. (2) Věcný cíl screeningu by měl být jasně definován na počátku programu. (3) Měla by být definovaná cílová populace. (4) Efektivita screeningového programu by měla být vědecky podložena. (5) Screeningový program by měl zahrnovat vzdělávání, testování a klinické služby a management. (6) Měly by existovat záruky kvality a mechanismy k minimalizaci možných rizik screeningu. (7) Program by měl zaručovat důvěrnost, respekt k autonomii jedince, a účast v něm by měla být podmíněna informovaným souhlasem. (8) Program by měl podporovat rovnost a přístup ke screeningu pro celou cílovou populaci. (9) Závěrečné zhodnocení screeningového programu by mělo být naplánováno na jeho začátku. (10) Celkový přínos screeningu by měl převažovat nad negativy. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob Etické otázky V souvislosti se screeningem se objevuje několik etických otázek, které byly formulovány zdravotnickými odborníky i laickou veřejností: • Možná diskriminace, soukromí pacientů a ochranu dat nebo podávání informací třetím stranám. • Domněnka, že by jedinci určení jako přenašeči mohli cítit tlak ze strany širší společnosti, aby učinili specifická rozhodnutí o reprodukci, patří k nejzávažnějším etickým tématům. • Screening a následná selekce nezasažených potomků v rámci preimplantační diagnosticky nebo prenatálního testování může být vnímána jako eugenický nebo diskriminační přístup. • Na osoby s nemocemi, na které bývá prováděn screening, však nesmí být nahlíženo jako na zátěž pro společnost a je proto nutné zaručit nadále podporu a zdravotní péči pro děti, které se narodily se specifickým onemocnění, ač jejich rodiče věděli o jejich stavu ještě před jejich narozením. Součástí nastavení screeningového programu měl být i systém řádné ochrany takovýchto osob, který zaručuje reprodukční svobodu, nedirektivní genetické poradenství a interpretaci testů a nutnost informovaného souhlasu. V rámci Evropské unie, Evropského hospodářského společenství a Švýcarské federace je toto zakotveno v Úmluvě na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny. V kapitole IV, článku 11 s uvádí: ‚Jakákoliv forma diskriminace osoby z důvodu jejího genetického dědictví je zakázána.‘ To je upřesněno v zákoně č 373/2011 Sb., kde se uvádí, že výsledky genetických vyšetření nesmějí být využity k diskriminaci testovaného ani geneticky příbuzných osob. Cystická fibróza nejčastější autozomálně recesivní onemocnění u evropských populací multiorgánové onemocnění •nadměrné množství solí v potu •plíce a dýchací cesty •slinivka břišní •mužská sterilita •primární příčina – mutace v genu kódujícím CFTR protein → iontový kanál hlavní funkce CFTR proteinu – chloridový kanál → přenos chloridových aniontů přes membránu •chybějící/nefunkční protein → nerovnováha iontového prostředí → porucha transportu vody → abnormálně viskózní hlenovitý sekret na epitelech → klinické projevy především u evropských populací, v neevropských populacích je výskyt CF výrazně nižší •frekvence přenašečů – přibližně 1 z 26-30 •výskyt u 1 dítěte na 2500-4500 novorozenců •v ČR udáván 1 ze 4023 (dle výsledků NS nižší – 1 z 6946) →? vliv prenatální/preimplantační diagnostiky a možných důsledků z pozitivního nálezu? Cystická fibróza Riziko u dítěte Oba rodiče nemocného dítěte jsou zdravými nosiči patologie způsobujícího CF. Riziko narození dítěte s CF je u každého těhotenství takového páru 25%. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob CFTR gen 2000 patologických variant Cystic Fibrosis Mutation Database http://www.genet.sickkids.on.ca/StatisticsPage.html Cystická fibróza Cystická fibróza Třída I – Narušená syntéza proteinu Třída II – Abnormální zpracování a intracelulární transport proteinu Třída III – Porucha regulace proteinu Třída IV – Narušení vodivosti chloridového kanálu Třída V – Redukovaná syntéza a zhoršený intracelulární transport proteinu Třída VI – Snížená stabilita proteinu Amaral, M.D., 2015. Novel personalized therapies for cystic fibrosis: treating the basic defect in all patients. J. Intern. Med. 277, 155–166. upraveno Cystická fibróza Molekulární diagnostika Metoda analýza teploty tání pomocí real-time PCR Cystická fibróza Molekulární diagnostika Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Elucigene CF-EU Cystická fibróza Pokud chloridový kanál na povrchu buněk zcela chybí, což odpovídá stavu u vůbec nejčastější mutace způsobující CF, tj. F508del, samotný ivacaftor zůstává neúčinný. Pro takový typ molekulárního poškození je zapotřebí využít jiné skupiny léků, které dovedou ovlivnit vlastní tvorbu bílkoviny ve vnitru buňky a jimž se souhrnně říká korektory proteinu CFTR. Mezi nejlépe prozkoumané korektory CFTR patří léčebný přípravek lumacaftor (někdy označovaný jako látka VX-809; Vertex Pharmaceuticals). lumacaftor usnadňuje transport proteinu CFTR na buněčnou membránu a interferuje s potranslačním procesem jeho seskládání Ivacaftor Pro pacienty s cystickou fibrózou (CF), kteří mají mutaci třídy III G551D, je od roku 2012 k dispozici kauzální léčba. Mechanismus účinku léku spočívá v opravě funkce chloridového kanálu CFTR, poškozeného touto mutací. Aktivuje nefunkční CFTR na povrchu buněk a otevírá jej pro chloridové ionty. Potvrzená účinnost nového léčebného postupu, reprezentovaného právě lékem ivacaftor, přináší reálnou naději, že bude časem možné řešit základní příčinu onemocnění i u pacientů s dalšími typy mutací v genu CFTR. Molekulární diagnostika ovlivňuje léčbu Karen 5. 11. 1982 – 25. 3. 2002 Molekulárně genetické testy činí preventivní kroky Srdeční kanalopatie Dědičná arytmogenní onemocnění  defektní iontové kanály, jejich podjednotky nebo asociované proteiny => chyba v akčním srdečním potenciálu => arrhythmie Syndromy - Long QT Syndromes - Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia - Brugada Syndrome Manifestace krátká pauza v srdečním tepu, chvění srdce, závratě a blackout =>synkopa, náhlá smrt Long QT syndromy Prevalence 1:2000 13 genů – 3 major genů => 3 major syndromy LQT 1 (physical exercise and emotional stress; KCNQ1) LQT 2 (sudden noices; KCNH2) LQT 3 (sleep and rest; SCNA5) 40 a více asociovaných genů Diagnostika Kardiologická vyšetření – ECG, testing after physical exercise, Holter Genetické testování – Sanger sequencing, Next generation sequencing SeqNext (JSI Medical Systems) Therapie  Beta blockers  Pacemaker  Implantable cardioverter defibrillator (ICD) Molekulárně genetické testy činí preventivní kroky Prenatální vyšetření Zdroje fetální DNA - invazivní výkony • amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, • choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů • fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky Krev je složena z buněk a plazmy. V plazmě každému z nás kolují krví úlomky jeho vlastní dědičné informace, jeho DNA. Pocházejí z rozpadlých jader uhynulých a zničených buněk nejrůznějších orgánů. 1 Plazma 2 Destičky 3 Bílé krvinky 4 Červené krvin Volná DNA cfDNA Prenatální vyšetření Zdroje fetální DNA - neinvazivní výkony Volná fetální DNA cffDNA Ženám se poměrně záhy po otěhotnění objeví v krvi také zlomky dědičné informace vyvíjejícího se embrya. V plazmě těhotné ženy se nachází směs úlomků DNA matky a plodu. „Dětské“ fragmenty tvoří asi desetinu všech zlomků DNA, jež lze v krvi matky najít. Neinvazivní prenatální screening NIPS Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivně paralelní sekvenace (MPS) Masivně paralelní sekvenování (MPS) Detekce fetálních aneuploidií Metodou masivní paralelní sekvenace (MPS) NIPS – srovnání Chromozomy Aneuploidie, pohl.chr. Mikrodeleční syndromy Vícečetná těhotenství IVF Stanovení fetální frakce Výsledek Týden těhotenství Nepro- kazatelný výsledek Cena MaterniT21 PLUS Sequenom, US 21, 18, 13, X Y, 16, 22 ANO ANO ANO ANO ANO do 7 dnů 10 < 1,5 % 25.500,- Kč VisibiliT Sequenom, US 21, 18, Y ne ne ANO ANO ANO do 7 dnů 10 < 1,5 % 13.850,- Kč Harmony Ariosa, US 21, 18, 13, X, Y ANO ne ANO (dvojčata) ANO ANO do 11 dnů 10 < 4 % 16.500,- Kč Prenascan BGI, Honkong 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ANO ANO ne Do 2-3 týdnů 10 v řádu procent 13.950,- Kč Verifi Verinata, US 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ANO ANO ANO 7-11 dnů 10 ? cca 1000 USD Panorama Natera 21, 18, 13, X, Y ANO ANO ne ne ANO 9-12 dnů 9 ? Cca 800 USD LifeCodexx Germany 21, 18, 13 ne ne ne ? ne 6 / 10 10 ? 1.150/825 EUR Gendia Belgium 21, 18, 13 ne ne ANO (dvojčata) ? ? Do 2 týdnů 10 ? 690 EUR BambniTest, Berry Genomics Co.,Ltd, Shanghai 21, 18, 13, X, Y ANO ne ? ? ? ? ? ? cca 500 USD Clarigo Multiplicon Belgium 21, 18, 13, X, Y ANO ne ne ANO ANO Do 2 týdnů 12( 8) v řádu procent 12.500,- Kč * Informace uvedené v tabulce jsou doplněny na základě dostupných publikací a firemních materiálů Neinvazivní prenatální screening NIPS • RH faktor • Pohlaví plodu • monogenní choroby získané od rodičů možnost detekce de novo mutace Objektivní detekce of de novo variant! Genom/exom sekvenování „patient-parent trios“ Pro filtrování de novo mutace trio přístup Veltman & Brunner. Nat Rev Genet 2012 Genetická analýza „Patient-parent trio“ a Patient reads Mother reads Father reads 4 miliony zděděných variant, 100 de novo variant na osobu Vysoce kvalitní sekvencování genů na bázi tria spolehlivě detekuje a mapuje de novo bodové mutace a CNV • De novo mutace jsou většinou otcovského původu a jejich počet se zvyšuje s pokročilým věkem otců • De novo mutace mohou hrát důležitou roli v genetice mužské neplodnosti De novo mutace Genetické choroby 1) Genomové – početní chromozomové aberace – dojde ke změně celého genomu (polyploidie, aneuploidie) 2) Chromozomové – mutační změna postihla strukrutu chromozomu 3) Genové - mutační změna v genu Eva 35 let Jan 51 let očekávají potomka Dosud se všechny studie zaměřovaly na zvýšené riziko poškození u starších matek. Je například známo, že čím je žena starší, tím více vzrůstá riziko, že se jí narodí dítě postižené Downovým syndromem. Vyšší věk otce představuje riziko pro vývoj takových neuropsychiatrických poruch, jako je schizofrenie a autismus, achondroplázie, dětské rakoviny a vrozené srdeční vady. Počítejme s věkem Parental ages at childbirth 66 68 68 73 V době narození ženy vaječníky obsahují asi 1 mil. folikulů s vajíčky, v pubertě toto číslo klesne na zhruba 300 000. V reprodukčním věku dojde k ovulaci max. 450 vajíček. Všechna již předtím, než se narodí prožijí 24 dělení. Meióza, tzn. tvorba zralého oocytu je započata 3 týdny před narozením ženy, zastaví se v profázi 1. meiotického dělení a pokračuje v ovulaci v aktuálním věku ženy. S postupujícím věkem ženy klesá kvalita achromatického aparátu a zvyšuje se hormonální nestabilita, která může způsobit nondisjunkci chromozomů. Žena Výskyt geneticky abnormálních embryí v závislosti na věku ženy 0% 20% 40% 60% 80% 100% do 35 let 35-40 41 a víc let Riziko vzniku trizomie stoupá s věkem matky (viz obrázek). V současnosti neexistuje ani účinná prevence, ani cílená léčba těchto chromozomálních vad a životní prognóza postižených je často nepříznivá. Spermatické buňky se však od okamžiku, kdy chlapec vstoupí do puberty, dělí každých 16 dní. V pubertě odhadován počet mitóz od zygoty po zralou spermatogonii v pubertě na 30 - 31. Ve věku 20let tak mužské zárodečné buňky mají za sebou již přibližně 150 cyklů dělení. Ve věku 50 let je to již 840 dělení. Čím více takových cyklů podstoupí, tím víckrát dojde k nežádoucím mutacím a tím je rovněž pravděpodobnější, že dítě bude mít vrozenou některou fyzickou nebo neurologickou abnormalitu. (Strachan, T., Read, A.P., (2004) Human Molecular Genetics 3rd ed., Garland Science, London and New York, p. 326) MUŽ matky: ~22 replikací genomu Mladý otec : ~100 replikací genomu Starší otec: ~1000 replikací genomu Gametogeneze: základní rozdíly mezi pohlavími Studium generace de novo mutací: Fyziologie zárodečných linií se liší u mužů a žen Figure adapted from Campbell et al. 2014 De novo mutace: „Parent-of-origin“ Informativní SNP De novo mutace Informativní SNP Otec Matka Dítě 1,576 maternal 5,640 paternal 28,577 unphased 80% 16% 4% 80% de novo mutací je otcovského původu! Počet DNMs u dítěte Věk otce při koncepci Efekt věku otce ~0.93 DNMs/rok Efekt věku matky ~0.25 DNMs/rok Goldmann et al. Nature Genetics 2016, see also Jonsson et al. Nature 2017 De novo mutace v mužské infertilitě? Frekvence neplodnosti: postihuje téměř 7% všech párů • Popsáno mnoho genů, o nichž je známo, že hrají roli v reprodukci • De novo mutace jsou známou příčinou mužské neplodnosti: -De novo chromozomální abnormalita: Klinefelterův syndrom XXY -De novo delece AZF oblasti na chromozomu Y • Velmi málo známých autozomálních genů mužské infertility. Většina identifikovaných genů způsobuje recesivní onemocnění McGrathet al. JAMA Psychiatry2014 Incidence rate ratio for psychiatric disorders Paternal Age at Childbearing and Offspring Psychiatric and Academic Morbidity ONLINE FIRST Brian M. D’Onofrio, PhD1; Martin E. Rickert, PhD1; Emma Frans, MSc2; Ralf Kuja-Halkola, MSc2; Catarina Almqvist, MD2,3; Arvid Sjölander, PhD2; Henrik Larsson, PhD2; Paul Lichtenstein, PhD2 1Department of Psychological and Brain Sciences, Indiana University, Bloomington 2Department of Medical Epidemiology and Biostatistics, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden 3Lung and Allergy Unit, Astrid Lindgren Children’s Hospital, Stockholm, Sweden JAMA Psychiatry. Published online February 26, 2014. Importance Advancing paternal age is associated with increased genetic mutations during spermatogenesis, which research suggests may cause psychiatric morbidity in the offspring. The effects of advancing paternal age at childbearing on offspring morbidity remain unclear, however, because of inconsistent epidemiologic findings and the inability of previous studies to rigorously rule out confounding factors. Objective To examine the associations between advancing paternal age at childbearing and numerous indexes of offspring morbidity. Design, Setting, and Participants We performed a population-based cohort study of all individuals born in Sweden in 1973-2001 (N = 2 615 081), with subsets of the data used to predict childhood or adolescent morbidity. We estimated the risk of psychiatric and academic morbidity associated with advancing paternal age using several quasi-experimental designs, including the comparison of differentially exposed siblings, cousins, and first-born cousins. Exposure Paternal age at childbearing. Main Outcomes and Measures Psychiatric (autism, attention-deficit/hyperactivity disorder, psychosis, bipolar disorder, suicide attempt, and substance use problem) and academic (failing grades and low educational attainment) morbidity. Results In the study population, advancing paternal age was associated with increased risk of some psychiatric disorders (eg, autism, psychosis, and bipolar disorders) but decreased risk of the other indexes of morbidity. In contrast, the sibling-comparison analyses indicated that advancing paternal age had a dose-response relationship with every index of morbidity, with the magnitude of the associations being as large or larger than the estimates in the entire population. Compared with offspring born to fathers 20 to 24 years old, offspring of fathers 45 years and older were at heightened risk of autism (hazard ratio [HR] = 3.45; 95% CI, 1.62-7.33), attention-deficit/hyperactivity disorder (HR = 13.13; 95% CI, 6.85-25.16), psychosis (HR = 2.07; 95% CI, 1.35-3.20), bipolar disorder (HR = 24.70; 95% CI, 12.12-50.31), suicide attempts (HR = 2.72; 95% CI, 2.08-3.56), substance use problems (HR = 2.44; 95% CI, 1.98-2.99), failing a grade (odds ratio [OR] = 1.59; 95% CI, 1.37-1.85), and low educational attainment (OR = 1.70; 95% CI, 1.50-1.93) in within-sibling comparisons. Additional analyses using several quasi-experimental designs obtained commensurate results, further strengthening the internal and external validity of the findings. Conclusions and Relevance Advancing paternal age is associated with increased risk of psychiatric and academic morbidity, with the magnitude of the risks being as large or larger than previous estimates. These findings are consistent with the hypothesis that new genetic mutations that occur during spermatogenesis are causally related to offspring morbidity. Šetření, které provedla univerzita v Indianě a švédský Institut Karolinski na vzorku 2,6 milionu lidí Bylo dokázáno, že otcové ve věku nad 45 let mají mnohem vyšší pravděpodobnost, že zplodí nemocné dítě než muži ve věku 24 let. U spermatu starších otců je totiž vyšší riziko, že vzniknou genové mutace. Například 13x pravděpodobnější je vznik hyperaktivity u dětí 2x vyšší je pravděpodobnost duševních poruch 25x vyšší je riziko maniodepresivní psychózy 2,5x vyšší pravděpodobnost, že potomek spáchá sebevraždu 2,5x vyšší pravděpodobnost , že dítě podlehne drogám nebo jiné závislosti. Tyto děti narozené starším otcům nad pětačtyřicet let navíc mají horší školní výsledky Achondroplázie Nejčastější příčina lidského trpaslictví, je geneticky podmíněnou chorobou pohybového aparátu, především receptorů odpovídajících za vazbu růstového faktoru fibroblastů. Autozomálně dominantní dědičnost Incidence achondroplázie je 1:15 000 až 1:40 000, živě narozených novorozenců, postihuje obě pohlaví a všechna etnika. Jedná se o autozomálně dominantní onemocnění způsobené specifickými bodovými mutacemi v transmembránové doméně genu FGFR3 (fibroblast growth factor receptor), jež se nachází na čtvrtém chromozómu (4p16.3). FGFR3 mutace spojené s achondroplázií jsou mutace vedoucí k zisku funkce, které podmiňují na ligandu nezávislou aktivaci FGFR3. Tato konstitutivní aktivace FGFR3 genu nepatřičně inhibuje proliferaci chondrocytů v růstové ploténce a diferenciaci progenitorových buněk kosti. Velká většina dětí s achondroplázií se narodí v rodinách, kde se malý vzrůst dosud nikdy nevyskytoval. 80–90 % případů achondroplazie je způsobeno mutacemi de novo, které se objevují v otcovské zárodečné linii, jejich frekvence se zvyšuje s věkem otců (>35 let). Rizikovým faktorem je vyšší věk otce dítěte Achondroplázie Více než 99% případů achondroplazie způsobují mutace G1138A (cca 98 %) a G1138C (1–2 %). Obě bodové mutace způsobují záměnu aminokyseliny glycinu za arginin v pozici 380 (G380R). Achondroplázie Tyto mutace buď vzniknou při gametogenezi nebo jsou na plod přeneseny od postiženého rodiče. Velká většina dětí s achondroplázií se narodí v rodinách, kde se malý vzrůst dosud nikdy nevyskytoval. 80–90 % případů achondroplazie je způsobeno mutacemi de novo, které se objevují v otcovské zárodečné linii, jejich frekvence se zvyšuje s věkem otců (>35 let). Rizikovým faktorem je vyšší věk otce dítěte Achondroplázie Achondroplázie neinvazivní prenatální vyšetření analýzou fetální DNA izolované z krve matky scoring mutace G380R v genu FGFR3 metodou analýza teploty tání na High Resolution Melting (HRM) na platformě LightCycler® 480 System pomocí LightSNiP assay. Achondroplázie LightCycler®480 Instrument LightSNiP Analysis metoda genotypování pomocí analýzy teploty tání na High Resolution Melting (HRM) na platformě LightCycler® 480 System pomocí LightSNiP assay. Achondroplázie rs28931614 FGFR3 (Exon 10) [G380R] Křivky tání a teploty tání homozygotních jedinců bez mutace G380R (zelené); A homozygotní jedinec s mutací na obou alelách (červené) Analyzováno pomocí LightSNiP assay Tm ACH: G380R Probe sequence (5´-3´) TGTGTATTGCGGATCCTCAGCTAC[A/C/G]GGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCT Neinvazivní prenatální screening (NIPS) WGS Arthur Beaudet, pediatr a vedoucí genetiky člověka na Lékařské fakultě Baylor v Houstonu „Myslím si, že budeme analyzovat genom každého člověka - každého plodu - v prvním trimestru, přinejmenším částečně. Dnes někteří pacienti mají své genomové sekvence, aby osvětlily genetická onemocnění, ale jednoho dne lidé nebudou čekat, dokud nebudou nemocní. Už budeme znát údaje při narození. To se nestane hned. Za prvé, třídění volné DNA plodu a matky vyžaduje analýzu obrovského množství opakujících se sekvencí, což je pro rutinní využití příliš nákladné. (Illumina v současné době účtuje 9 500 dolarů za účelem sekvenování genomu dospělé osoby a doposud pokusy o sekvenci fetální DNA stojí mnohem víc.) A stále existují technické problémy: výsledky fetálního genomu nejsou dosud přesné pro diagnózu. Eticky je technologie minové pole. Pokud zjistíme genetický osud našich dětí, když jsou ještě v děloze, jaký druh rozhodnutí budeme udělat? Neinvazivní prenatální screening (NIPS) WGS Dennis Lo se domnívá, že pokud postupuje sekvence fetálních DNA, testovací pracovníci by se měli omezit na hlášení pouze 20 nejčastějších závažných onemocnění. „Budeme čelit výzvě toho, co hledat a jak radit těhotným ženám. Myslím, že musíme tuto technologii používat eticky a neměli bychom analyzovat věci, které nejsou život ohrožující. Jako předispozice k cukrovce ve 40 letech. Dokonce ani nevíme, jaký lék bude za 40 let, tak proč se stresovat matku? „ !!! DNA TEST OTCOVSTVÍ BĚHEM TĚHOTENSTVÍ Z MATEŘSKÉ KRVE JIŽ V 9. TÝDNU JIŽ OD 29900,- Kč Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy: 6) terapeuticko-indikační  pomocí genetických testů je možné dopředu určit, kteří jedinci budou mít největší prospěch z užívání konkrétního léku a u kterých pacientů bude naopak podávání léku spojeno se špatnou odpovědí a častými a závažnými nežádoucími účinky  motor personalizované medicíny a cílené biologické léčby Jedinci s různými variantami genů různě reagují na léčbu, metabolizují léky různou rychlostí, proto lze očekávat, že léky budou šity na míru právě podle pacientova genomu. Dnes lékař často dlouho hledá, který z podobných léků pacientovi nejlépe vyhovuje, což prodlužuje i prodražuje léčbu, snižuje účinek léků nebo hrozí nežádoucí vedlejší účinky Lékař před vyplněním receptu požaduje genetické vyšetření, aby zjistil, který lék je pro pacienta nejvhodnější. Farmakogenetika Příklad Cytochrom P450 2C9 (CYP2C9), VKORC1 Warfarin  podílí se na metabolizmu a mechanizmu antikoagulancia warfarinu; přeměňuje warfarin na hlavní metabolit  v důsledku variantních alel pro formu cytochromu snižena účinnost tohoto enzymu participujícího v aktivaci prothrombinu  Spojeno s rizikem tromboembolických příhod  Vyšetření variant ovlivňujících metabolizmus warfarinu se tak z již celkem běžné praxe stává spíše záležitostí pro pacienty, u nichž je obtížná optimalizace dávkování léčiva podle běžných klinických schémat a je vhodné hledat příčinu jejich neadekvátní odpovědi na léčbu.  Volba antiagregační léčby by mohla profitovat ze znalosti pacientova genotypu více a optimálně vyvážit použití nákladnějšího prasugrelu, jehož metabolizmus a účinnost sice nejsou alterovány defektem cytochromu P450 formy CYP2C19, avšak má vyšší výskyt závažných (i fatálně) krvácivých příhod oproti klopidogrelu Studium závislosti účinků léků na genomu jednotlivce vedlo ke vzniku nového oboru – farmakogenomiky – vytváří podmínky pro personalizovanou medicínu. Příklady situace, kdy jedinec je predisponován svojí genetickou výbavou k selhání farmakoterapie či k abnormální, případně i toxické, reakci na podané léčivo, jsou v literatuře dobře popsány. Farmakogenetika Cytochrom P450 (CYP) Nejvíce případů, kdy je v důsledku variant genů pro jeho různé formy alterován metabolizmus léčiva Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6)  doposud popsáno 80 různých alel llele Genotype Frequency in the U.S. Caucasian population4 Frequency in the African American population4 Predicted Enzyme Activity *1 None 37 to 40% 29 to 35% Normal *2 -1584C>G, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C 26 to 33% 18 to 27% Normal *3 2549A>del 1% 0.2 to 0.6% None *4 100C>T, 1661G>C, 1846G>A, 4180G>C, 2850C>T 18 to 20% 6 to 9% None *5 deletion 2 to 4% 6 to 7% None *6 1707T>del, 4180G>C 1% 0.5% None *7 2935A>C Not known Not known None *8 1661G>C, 1758G>T, 2850C>T, 4180G>C Not known Not known None *9 2613delAGA 2 to 3% 0.3% Reduced *10 100C>T, 1661G>C, 4180G>C 2 to 8% 0.3 to 0.4% Reduced *11 883G>C, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C Not known Not known None *15 138insT Not known Not known None *17 1023C>T, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C 0.2 to 0.3% 15 to 26% Reduced *29 1659G>A, 1661G>C, 2850C>T, 3183G>A, 4180G>C Not known5 Not known5 Reduced *35 -1584C>G, 31G>A, 1661G>C, 2850C>T, 4180G>C 7.4%6 1%6 Normal *41 1661G>C, 2850C>T, 2988G>A, 4180G>C 9%6 11%6 Reduced DUP duplication Farmakogenetika Cytochrom P450 (CYP) Nejvíce případů, kdy je v důsledku variant genů pro jeho různé formy alterován metabolizmus léčiva Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6) Přibližně 5-10% z zakavkazské populace je postiženo nefunkčními alelami, které mají za následek fenotypy pomalý nebo intermediatní metabolizer. Alely CYP2D6*3, CYP2D6*4 and CYP2D6*5 representují více než 90% inaktivujících alel Alela CYP2D6*3 - frameshift mutace 1-bp delece (2637delA) v exonu 5 Alela CYP2D6*4 - incorrect splicing - transition 1934G-A na hranici intron 3 / exon 4. Alela CYP2D6*5 - delece genu CYP2D6 gene. Farmakogenetika Alely CYP2D6*3, CYP2D6*4 and CYP2D6*5 representují více než 90% inactivujících alel LightCycler® 2.0 Instrument Roche Master: Fast Start Sample data for CYP 2D6 *3 Channel 530 wt: 61.3°C mt: 55.8°C het: 55.8/61.3°C LightCycler® 2.0 Instrument Roche Master: Fast Start Sample data for CYP 2D6 *4 Channel 640 wt: 56.5°C mt: 65.5°C het: 56.5/65.5°C 2.0 Instrument Roche Master: Fast Start Sample data for hCR5 Channel 705 Control : 47.4°C Missing peak (baseline) indicates PCR failure or missing DNA. V první dekádě tisíciletí došlo k bouřlivému rozvoji studia epigenetiky a epigenetické dědičnosti, kdy se prokazuje, že rozhodující je, kdy, kde a jak moc se daný gen bude přepisovat. Dnes se odhaduje, že během života buňky se každý nukleotid někdy přepíše do ně jaké RNA, máme popsáno na tisíce dlouhých nekódujících RNA, o nichž přesně nevíme, co v jádře dělají, mohou např. fungovat jako lešení a prostorové uspořádání DNA. Mikrobiom (třetí genom) Projekt lidského mikrobiomu byl zahájen v r. 2008. Zkoumá populace mikroorganismů na pěti vytipovaných místech těla – na kůži, v ústní dutině, nosní dutině, gastrointestinálním a urogenitálním traktu. Počet různých genů mikrobiomu se odhaduje mezi 2–20 miliony, jde o geny všech eubakterií, archeí, mikroskopických eukaryot, kterých je 1 000x více než našich genů. Z genetického pohledu jsem člověkem jen z 1–0,1 %, statní geny na a v mém těle patří do mikrobiomu. Mikrobiota a její geny mají zřejmě klíčový vliv na rozvoj imunitního systému u dětí, vyrábějí vitamíny, které sami vyrobit ne umíme, drží v šachu „škodlivé“ bakterie, pomáhají s trávením, ovlivňují expresi našich genů Mikrobiota je nyní chápána jako nový orgán lidského těla. V budoucnosti se tak úsilí výzkumníků nepochybně zaměří na získání znalostí proteomu (atlasu všech proteinů, které v životě lidské tělo vyprodukuje), metabolomu (všech metabolitů), viromu (genů všech virů žijících na a uvnitř našeho těla) mikrobiomu jako celku. Epigenom Vyšší stupeň genetické medicíny představuje oprava vadné části genomu CRISPR/Cas9 půjčuje přírodní imunitní mechanismy k přesnému navedení ke kýžené části DNA (pomocí krátkého řetězce ribonukleové kyseliny), kde genové nůžky Cas (skrze stejnojmenný enzym nukleázy) dovedou do šroubovnice "střihnout" a vložit gen nový, popřípadě ustřihnout gen nežádoucí. Ačkoliv CRISPR není vždy tak přesný jako jiné, konkurenční systémy vyvinuté až o něco později, jeho výhodou je zejména cena a rychlost. Vyšší stupeň genetické medicíny představuje oprava vadné části genomu Časem může genová terapie a zvlášť imunoterapie nahradit dokonce i chemoterapii u nemocných lidí s rakovinou. Dnes je základní léčebnou strategií u onkologických pacientů • chirurgické vyjmutí nádorů, • zničení nádorové tkáně ionizujícím zářením • zabití nádorových buněk chemoterapií. Tyto klasické postupy ale mohou vyléčit rakovinu většinou jen v časných stadiích. Chemoterapie navíc organismus pacientů oslabí – toxické léky lidem utlumí krvetvorbu nebo poškodí vnitřní orgány. V budoucnosti se proto budou využívat jiné postupy. Už nyní existují výzkumy zaměřené na umělé povzbuzení imunitního systému pacienta tak, aby obranné mechanismy nádoru sám překonal. CRISPR se používá k přeprogramování imunitních buněk tak, aby rozeznaly rakovinové buňky a zaútočily na ně. Tělo se tak dovede zbavit nádorů daleko efektivněji a samo. Některé metody už dokonce úspěšně prošly i klinickými zkouškami a získaly všechna povolení. Začínají se široce využívat k léčbě pacientů onkologických a se závažnými genetickými onemocněními. Ve Spojených státech probíhá několik úspěšných studií genové terapie akutní leukemie. Vědci z West China Hospital nasadili CRISPR u pacientů s rakovinou plic a později došlo na rozšíření programu i na další formy nádorových onemocnění. Prof. MUDr. Milan Macek jr., DrSc., MHA V současné době se genetika nachází ve velmi dynamické fázi, kdy se z diagnostiky přesouvá do léčby. Nejen ve smyslu vyléčení dítěte a eventuálně i vyléčení zárodečné linie v rodině tak, že se „zarazí“ přenos onemocnění do dalších generací. To ale bohužel otevírá i velkou spoustu etických otázek. Totiž kde je příležitost, tak je i možnost komerčního využití, ale i zneužití. Bohužel tyhle genově editovací metody se mohou využít nejen pro pomoc těžce postiženým rodinám, ale i tam, kde chtějí „vytvářet děti“, které mají třeba modré oči, dlouhé nohy a blond vlasy… Prostě se do genetiky začínají vkládat lidské tužby a naděje a začíná se tak tento obor povážlivě komercionalizovat mimo jeho primární zdravotnický „mandát“, kde jde především o pomoc rodinám se závažnými vzácnými onemocněními Sydney Brenner : „vědou nejvíce hýbou nové technologie, nové objevy a nové myšlenky, a to právě v tomto pořadí“ Princip molekulárně genetické diagnostiky Rozpoznání a identifikace mutací v genech, které jsou v asociaci s danou chorobou. Jakmile je identifikována genetická příčina onemocnění na úrovni DNA, může se vyvinout specifický test k analýze relevantních genetických charakteristik pacienta Není zatím možné vyšetřit, zda proband bude trpět jakoukoliv dědičnou chorobou, vždy se vyšetřuje možnost poškození určitého konkrétního genu. Existují i vyšetření, které nezapadají do této definice, z těch běžných např. molekulárně genetická detekce aneuploidií Princip molekulárně genetické diagnostiky Rozpoznání a identifikace mutací v genech, které jsou v asociaci s danou chorobou. Jakmile je identifikována genetická příčina onemocnění na úrovni DNA, může se vyvinout specifický test k analýze relevantních genetických charakteristik pacienta Není zatím možné vyšetřit, zda proband bude trpět jakoukoliv dědičnou chorobou, vždy se vyšetřuje možnost poškození určitého konkrétního genu. Existují i vyšetření, které nezapadají do této definice, z těch běžných např. molekulárně genetická detekce aneuploidií SEKVENOVÁNÍ EXOMŮ, GENOMŮ V molekulárně genetické diagnostice jsou dva základní a navzájem zcela odlišné metodické přístupy vyšetření: •nepřímé (gene tracing) •přímé (direct testing). Molekulárně genetická diagnostika Přímá molekulárně genetická diagnostika Detekce kauzálních mutací v odpovědném genu vždy potvrdí klinickou diagnózu musíme znát: • gen , který má být analyzován • standartní (wild type) sekvenci tohoto genu Přímá molekulárně genetická diagnostika Metody detekce známých mutací (scoring) v genu asociovaném s danou chorobou Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) v genu asociovaném s danou chorobou Metody detekce známých mutací (scoring) detekce určité kauzální mutace pro danou chorobu specifickou metodou Detekce známé sekvenční změny je možná u: 1) chorob s předpokládanou alelickou homogenitou, tzn. že patologická alela příslušného genu je reprezentovaná  jedinou mutací (srpkovitá anemie)  omezeným počtem mutací (1-antitrypsinový deficit)  rozsáhlou řadou mutací rozmístěných přes celý gen, kdy jedna nebo vícemutací se vyskytují s prevalující četností (CFTR, DMD)  expanzí trinukleotidových opakujících se sekvencí (HD, MD) 2) v rodinách s již charakterizovanou mutací v příslušném genu ) ve výzkumu (k potvrzení kandidátního genu a k odlišení nepatogeního polymorfismu) Přímá molekulárně genetická diagnostika Příklady chorob s vymezeným počtem mutací Srpkovitá anemie mutace E6V v HBB genu Cystická fibróza mutace F508del v CFTR genu Huntingtonova chorea, Myotonická dystrofie, Fragilní X nestabilní expanze trinukletidových repeticí Hemofilie A velka inverze v genu pro faktor 8 Duchennova muskulární dystrofie 60-70% mutací tvoří velké delece Tay-Sachsova choroba inzerce 4pb v exonu 11 genu HEXA Lebrova optická atrofie mitochondriální mutace nukleotidu v pozici 3460, 11778, 14484 Metody detekce známých mutací (scoring) detekce určité kauzální mutace pro danou chorobu specifickou metodou Amplifikace úseku s předpokládanou delecí detekce delecí Restrikční analýza PCR produktu mutací vzniká nebo zaniká specifické místo v DNA, rozlišované restikčním enzymem Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy detekce bodových mutací PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) detekce bodových mutací PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA úspěšná amplifikace odhalí přítomnost specifické přestavby v DNA Analýza teploty tání PCR produktu pomocí real-time PCR změna teploty tání v porovnání s pozitivní a standartní kontrolou odhalí specifickou sekvenční změnu Triplet Primed PCR detekce expanze trinukleotidových repeticí v DNA Multiplex Ligation Probe Amplification MLPA detekce rozsáhlých delecí a duplikací, vhodná pro stanovení SNP genotypů a testovanání metylací v promotorové oblasti genů Přímá molekulárně genetická diagnostika • Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) postupné nebo multiplexní screenování úseků genu asociovaného s danou chorobou pomocí vyhledávacích metod odhalí jakékoliv odchylky v analyzované sekvenci DNA pacienta ve srovnání se standartní sekvencí neodliší patogenní a nepatogenní změny v sekvenci DNA jsou náročnější časově i finančně Přímá molekulárně genetická diagnostika Přímá DNA diagnostika Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scanning) Přímá molekulárně genetická diagnostika Jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA neohaluje pozici změny Denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) vysoká citlivost nutné primery s GC-clampy neodhaluje pozici změny Heteroduplexní analýza (HD) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA omezená citlivost neodhaluje pozici změny Detekce zkráceného proteinu (PTT) vysoká citlivost pro terminační mutace pouze pro terminační mutace odhaluje pozici změny Analýza teploty tání na real-time PCR, HRM vysoká citlivost doporučuje se pro sekvence cca 250 bp neodhalí pozici změny Sekvenování detekce veškerých změn v DNA nadbytek informací plně charakterizuje mutace Nepřímá molekulárně genetická diagnostika nezkoumá se přímo přítomnost nebo nepřítomnost určité poruchy v genu, ale segregace markeru, který je ve vazbě na alelu genu, jejíž porucha vyvolá vadný fenotyp. Marker, jehož segregace v rodokmenu se sleduje, se dědí totiž společně s genem, sám ale s chorobou nemá žádnou příčinnou souvislost. Ve zkoumaném rodokmenu se porovnává segregace markeru se segregací choroby Jako markery se používají DNA polymorfismy . Využití polymorfních míst lidského genomu  Identifikace osob/vzorků DNA (A. Jeffreys 1985) (lidé obvinění z kriminálních činů, oběti katastrof)  Určování paternity (VNTR, STR)  Nepřímá diagnostika monogénních chorob  Hledání nových genů (poziční klonování genů) Nepřímá diagnostika Nepřímá diagnostika Vazebná analýza je umožněna: – v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou – rozlišením dvou chromozomů pomocí markerů na DNA – přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině Základní principy nepřímé DNA diagnostiky 1) odlišení dvou chromozomů rodičů (heterozygozyta markerů) 2) určení fáze (určení haplotypu - souboru alel polymorfních míst ve vazbě) 3) určení haplotypu (chromozomu) asociovaného s patologií v rodině Přísná rodinná specifita Nikdy nepotvrzuje diagnózu užitím vazebných markerů v rodinných studiích odhalí chromozom v asociaci s nemocí v rodině Nepřímá diagnostika chr.n chr.n chr.n chr.n [mt]+[=] [mt]+[?] [=]+[=] [A1]+[A3] [A1]+[A1] [A1]+[A1] [A1]+[A3] neinformativní Nepřímá diagnostika A A 6 6 A C 3 5 A B 3 1 A B 3 1 A A 2 3 A C 2 2 A C 3 5 C A 5 6 C A 5 6 B A 1 3 A A 3 2 A D 2 2 A A 2 2 A D 2 2 A D 2 2A C 3 2 F508del neznámá mutace Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alely A - D haplotyp v asociaci s neznámou mutací A D 3 2 Nepřímá diagnostika Cystická fibróza Autozomálně recesivní dědičnost DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“