Mikroby a lidské tělo Mikrobiologie a imunologie – RV2BP_MIKR Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz, 777 031 969 Abych se představil l MUDr. Ondřej Zahradníček l povolání: klinický mikrobiolog, asistent na LF MU; učíme u nás bakalářské obory, mediky, zubaře i studenty PřF a od loňska i PedF l budou se střídat přednášky a cvičení l zájemci se u mne mohou přihlásit a mohou se přijít podívat přímo k nám Učební materiály l Odpřednášené prezentace budou vyvěšeny ve Studijních materiálech předmětu l Tamtéž také visí skripta l V případě zájmu mohu dodat různé další materiály Náš ústav V naší praktikárně Mikroby a lidské tělo l Současné děti vědí často velmi mnoho o zvířatech v ZOO, o rostlinách v zahradě i v lese, díky naučným seriálům vědí i něco o evoluci, o buňce, i o orgánových systémech lidského těla l Vědí ale málo o organismech, které žijí v nich samých; pokud už se dozvědí něco o mikrobech, jsou to spíše organismy z potoka či z lesní hrabanky než ty, které osidlují je samé Mikroby v lidském těle l Každý z nás si s sebou neustále nosí přibližně kilo mikroorganismů. Nejvíc je jich ve střevě. Proto taky je těch mikroorganismů, co s sebou máme, o něco víc, když jdeme „na velkou“, ne když se odtamtud vracíme J l Kromě toho neustále potkáváme různé mikroby, které nás přechodně osidlují a mohou být na povrchu našeho těla nebo uvnitř něj nalezeny l A konečně jsou tu i mikroby, které nám škodí a způsobují infekční nemoci či různé záněty Jsou vlastně hodné, nebo zlé? l Mach a Šebestová se ocitli v krku svého spolužáka Kropáčka, aby zabíjeli zlé bakterie. Obecně představa mnoha laiků je, že bakterie jsou něco zlého, škodlivého, způsobujícího nemoc l Ve skutečnosti z tzv. „klinicky významných mikrobů“ jsou mnohé buď neškodné, anebo školí jen za určitých okolností: například když se přemnoží a dostanou se tam, kam nemají Kdo zkoumá mikroby l Mikroby se zabývají mikrobiologové. Mikrobiologie spadá pod biologické vědy a jako taková se studuje na přírodovědeckých fakultách l Mikroby lidského těla se zabývají kliničtí mikrobiologové. Klinická mikrobiologie je přechodný obor mezi biologickými a lékařskými vědami. Kliničtí mikrobiologové jsou proto dílem lékaři a dílem přírodovědci, případně jiní odborníci Co zkoumají kliničtí mikrobiologové l Kliničtí mikrobiologové ani tak nezkoumají mikroby, od toho jsou mikrobiologové „classic“, ti, kteří dělají analýzy DNA a hledají vzájemné příbuzenské vztahy mezi mikroby, jejich vlastnosti a složení l Kliničtí mikrobiologové spíše zkoumají (někdy velmi křehké J) vztahy mezi mikrobem a jeho hostitelem. Klinického mikrobiologa většinou nezajímá izolovaná Escherichia coli, ale spíše třeba Escherichia coli adherovaná na stěnu močového měchýře. Escherichia coli v močovém měchýři Co je to mikrob l Musí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické l Musí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá Z druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická. Co jsou všechno mikroby l Mikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů l Jako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a úžasné Co tyhle mikroby umí l Přežívají v moři v hloubce 10 km l Přežijí i teploty kolem 110 stupňů Celsia l Vydrží značnou radioaktivitu l Jsou schopny místo kyslíku „dýchat“ síru či dusík (zkrátka, mají jiný akceptor elektronů než atom kyslíku) l Mnoho věcí ovšem umějí i mikroby lékařsky významné, jak si povíme dále Klinicky významné mikroby l Klinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka = tvůrce, ale pro člověka = objekt) l „Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají l Každý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy). Hlavní klinicky významné mikroby l Viry (a priony) l Bakterie (třeba streptokok nebo Escherichia) l Houby (kvasinky a plísně) l Paraziti – přesahují pojem mikrob: – Vnitřní paraziti l Prvoci (třeba původce malárie) l Motolice (třeba motolice jaterní) l Hlístice (třeba roup nebo škrkavka) l Tasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná) – Vnější paraziti (vši, blechy, štěnice) Listeria monocytogenes Tvary a uspořádání bakterií l Koky ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích (neříkejme raději „streptokoky“ a „stafylokoky“, bylo by to matoucí) l Tyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté a i tyčinky můžou být různě uspořádané l Spirochety – tenké spirálovité bakterie l Beztvaré bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar) Zprohýbaná tyčinka – helikobakter Spirochety Typ buněčné stěny bakterií l Grampozitivní bakterie mají tlustou a jednoduchou buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně mechanicky. Při barvení podle Grama jsou fialové. Například stafylokoky. l Gramnegativní bakterie mají tenkou, ale o to složitější buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně chemicky. Při barvení podle Grama jsou červené. Například escherichie. l Gramem se nebarvící bakterie buněčnou stěnu nemají (mykoplasmata) nebo ji mají hodně jinou (mykobakteria). Grampozitivní Bakterie s bičíky (Escherichia coli) Pouzdro a biofilm l Pouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání l Biofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě. O biofilmu bude více v další části této prezentace Neobarvené pouzdro V barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší; mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo Vznik biofilmu l Na začátku je pevný povrch a plovoucí bakterie + l Bakterie přilne na povrch l Následuje shlukování dalších bakterií l Bakterie začnou produkovat polysacharidovou hmotu l Až vznikne třídimenzionální struktura zvaná biofilm Detekce biofilmu na jazyku J Význam tvorby biofilmu u bakterií Bakterie mohou lépe regulovat početnost populace – v rámci biofilmu se totiž informují produkcí určitých látek (tzv. quorum sensing) Bakterie se stávají odolnější vůči vnějším vlivům: – desinfekčním prostředkům – antibiotikům (nemusí zabrat!) – imunitní reakci hostitele Biofilm tvoří jak bakterie běžné flóry (z hlediska organismu spíše pozitivní), tak i patogeny. Patologický biofilm – příběh l Muž, 58 let, v roce 2001 zaveden kardiostimulátor, v roce 2002 opakovaně hospitalizován na interním oddělení s teplotami nejasného původu l V kultivaci krve (hemokultivaci) prokázán Staphylococcus epidermidis s velmi dobrou citlivostí l Několikrát dlouhodobě přeléčován vysokými dávkami antibiotik v kombinacích Příběh – pokračování l Zpočátku vždy dobrá odezva, poté se ale vždycky objevují znovu teploty. l Je proto nasazena terapie velmi silnými antibiotiky, po zlepšení stavu je pacientovi vyměněna elektroda a to vede k celkovému zlepšení stavu pacienta. Sporulace l Sporulace je něco jako zimní spánek, ale mnohem dokonalejší než je zimní spánek zvířat. Opakem spory je vegetativní forma života buňky l Spory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně l Spora vzniká tak, že se buňka rozdělí na dvě části. Ty se však neoddělí úplně: jedna, ze které se stane spora, je obklopena tou druhou, které zůstává vegetativní forma. Takové spoře říkáme endospora l V extrémních podmínkách vegetativní buňka hyne a zůstane pouze spora l Za příznivých podmínek spora vyklíčí l Nepleťme si spory bakterií a spory hub! Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví při téměř žádném barvení Fyziologie a metabolismus bakterií l Tak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus l Katabolismus může být trojí: – Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík. Využívají ji například střevní bakterie – Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík. Využívají ji bakterie, které nacházíme ve vnějším prostředí, na rostlinách aj. – Anaerobní respirace – jiný akceptor elektronů než kyslík, pro člověka málo významné Množení bakterií l Každá bakterie má svou generační dobu l Za jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné bakterie 1024 bakterií (teoreticky) a podobně l Ideální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty l Pozor, nepleťme si generační dobu (za jak dlouho se bakterie rozdělí na dvě) a kultivační dobu (za jak dlouho vidíme výsledek na kultivační půdě) V jedné z našich laboratoří Životní podmínky bakterií l Pro život bakterií jsou nutné určité podmínky l Tyto podmínky musíme splnit také v případě, že chceme bakterie uměle pěstovat (třeba proto, abychom je přitom mohli určovat) l Nestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit l Na druhou stranu, pokud s bakteriemi bojujeme (při desinfekci, sterilizaci), nestačí obvykle potlačit jejich množení, ale musíme je úplně zahubit. Životní podmínky – pokračování l Podmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí l Nepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Vztahy mikroba a hostitele l Z hlediska klinické mikrobiologie je významný vztah mikroorganismus – makroorganismus (což může být člověk, ale také zvíře či rostlina) l Může jít o symbiózu, neutrální vztah či antibiózu l Často se používají i termíny z potravních řetězců (komenzalismus, saprofytismus, parazitismus). Virulentní mikroby jsou zpravidla – ale ne vždy – parazitické l Ne vždycky se dají mikroby jednoduše „zaškatulkovat“. Často záleží na okolnostech, jestli bude mikrob „zlý“ nebo „hodný“ Interakce mikrob – makroorganismus: mikroby napadající člověka l Mikroorganismy, které napadají člověka, jsou vybaveny různými faktory virulence – jsou to faktory, které zajišťují schopnost mikroba proniknout do organismu. Nejčastěji to bývají různé enzymy, toxiny, bakteriální pouzdro aj. l Makroorganismus se mikrobům brání řadou různých způsobů. Jde vždy o to, zda se více prosadí faktor virulence mikroba, nebo mechanismus obranyschopnosti makroorganismu Patogenita mikroorganismů l Existují mikroby nepatogenní – neschopné vyvolat nemoc. Většinou jsou to ty, které vůbec nejsou schopny do organismu proniknout. l Existují mikroby podmíněně patogenní, které vyvolávají nemoci jen za určitých podmínek. Často jsou to prospěšné bakterie, které jsou většinou „hodné“ a jen výjimečně začnou „zlobit“, když se třeba dostanou kam nemají, nebo když zmutují l Existují i mikroby obligátně patogenní, které vyvolávají nemoc vždy, když se dostanou do těla v dostatečném počtu a vhodným způsobem Patogenita a virulence Virulence okamžitá vlastnost konkrétního kmene mikroba (kmen = populace z jedné buňky) Kmeny tedy mohou být avirulentní – tedy v daném okamžiku úplně neškodné, neschopné napadat makroorganismus méně či více virulentní – tedy disponující různou mírou schopnosti napadnout makroorganismus. Patogenita vlastnost určitého mikrobiálního druhu Nepatogenní: nejsou schopny vyvolat u daného živočišného druhu nemoc. Potenciální (oportunní) patogeni: vyvolávají chorobu jen někdy Obligátní (primární) patogeni vyvolávají nemoc "vždy" Příklad působení patogenního mikroba Mikroflóra jako ekosystém l Kdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem l Podobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc. Na čem záleží, jak těžký průběh bude mít infekční nemoc? l Faktory na straně mikroba: vybavenost faktory virulence (může být dána třeba i tím, že mikrob sám je napaden bakteriálním virem – bakteriofágem) l Faktory na straně makroorganismu: stav imunity, stav anatomických bariér, hormonální rovnováha, případné základní onemocnění a spousta dalších věcí l Forma vzájemného setkání mikroba a makroorganismu Normální mikroflóra a její význam l Na různých místech lidského těla je přítomna tzv. normální (běžná) flóra či mikroflóra. l Je tvořena komenzálními či saprofytickými mikroby, které jsou hostiteli více či méně prospěšné: – kolonizací příslušné sliznice brání tomu, aby byla osídlena patogeny – podílejí se na stavu mikroprostředí, např. pH – ve střevě likvidují nestravitelné zbytky – mohou mít i další pozitivní efekty pro hostitele (např. tvorba vitamínů střevními bakteriemi) Kde mikroflóra je a kde není l Mikroflóra není ve tkáních, v parenchymu orgánů, v krvi, v mozku ani mozkomíšním moku. Zde je každý nalezený mikrob velmi pravděpodobně patogenem l Mikroflóra není ani v některých dutých orgánech, např. v jícnu, v plicích, v močovém měchýři (kromě starých osob) či v děloze l Mikroflóra je zejména v dutině ústní a hltanu, v tlustém (a zčásti i tenkém) střevě, v.pochvě a v menším množství také na kůži Mikroflóra v průběhu života člověka l Plod nemá žádnou běžnou flóru, po narození zvolna začíná osidlování l Během prvních měsíců a let života se běžná mikroflóra vyvíjí (zejména střevní v souvislosti se změnami potravy) l U žen se mění vaginální mikroflóra v důsledku hormonů při menarche, dále při začátku pohlavního života a pak v menopause l U starších osob dochází k dalším změnám (např. se často ustanoví „běžná flóra“ v močovém měchýři, dříve sterilním) Mikroflóra jako ekosystém l Kdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem l Podobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc. Přehled běžné mikroflóry Normální osídlení dýchacích cest l Nosní dutina nemá specifickou flóru, přechází tam však mikroflóra z kůže (přední část) a hltanu (zadní část) l V hltanu (stejně jako v ústní dutině) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme l Plíce a dolní dýchací cesty jsou normálně bez většího množství mikrobů l Na ostatních místech (hrtan) jsou různé přechody (hrtan – jako v hltanu, ale méně) Normální osídlení trávicích cest l Rty znamenají přechod kožní a ústní flóry l V ústní dutině (stejně jako v hltanu) nacházíme ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů aj. Mnohé další tam jsou, ale většinou je nevykultivujeme l Jícen a žaludek jsou za normálních okolností bez většího množství mikrobů l V tenkém a zejména tlustém střevě nacházíme zpravidla asi 1 kg anaerobů, dále enterobakterie, enterokoky, kvasinky, někdy i nepatogenní améby l Řiť je opět místem přechodu střeva a kůže Normální situace v ústní dutině l Ústní dutina je i za normální situace velice složitý ekosystém, složený z různých druhů bakterií, usazených materiálů, lidských buněk a dalších složek l Bakterie se v dutině ústní přitom nevyskytují v.nějakém chaosu, ale v komplikovaném, strukturovaném útvaru, zvaném biofilm. V daném případě jde o vícedruhový strukturovaný biofilm, ve kterém např. anaeroby jsou přítomny ve větší hloubce než aerobní bakterie Močové cesty zdravého člověka Ledviny – normálně bez mikrobů Pánvičky ledvinné – normálně bez mikrobů Močovody (uretery) – normálně bez mikrobů Močový měchýř mladých a středně starých osob – normálně bez mikrobů Močový měchýř seniorů – i za normálních okolností může být osídlen mikroflórou, která nečiní problémy a stává se „běžnou flórou“ Močová trubice – normálně bez mikrobů, část přilehlá k ústí však může být osídlena zvenčí Normální stav pohlavních orgánů l Za normálních poměrů nejsou mikroby – U ženy v děloze, vejcovodech, vaječnících – U muže v prostatě, chámovodech, varlatech l Specifickou normální flóru má vagina (laktobacily, příměs různých aerobních i anaerobních mikrobů) l Vulva tvoří přechod vaginální a kožní flóry l U muže je specifický předkožkový vak, vedle kožní flóry jsou tu i např. nepatogenní mykobakteria apod. Normální osídlení kůže l Přestože kůže je pro mikroby nejdostupnější, je její osídlení mnohem chudší než v.případě např. úst, pochvy či tlustého střeva l Mikrob, který chce žít na kůži, musí snášet vyschnutí a vysoké koncentrace solí l Na kůži se tedy normálně vyskytují – koaguláza negativní druhy stafylokoků – zlatý stafylokok – malé množství je normální – korynebakteria a příbuzné G+ tyčinky – malá množství kvasinek Péče o střevní mikroflóru l V rekonvalescenci průjmů, ale i např. po celkové antimikrobiální terapii (kde mohlo dojít k vybití části mikroflóry) je vhodné snažit se o obnovu normálního stavu l Používají se jogurty (nesladké, netučné), kyselé zelí, různé preparáty (Hylac) – Některé obsahují substráty pro „dobré“ bakterie, to jsou prebiotika. – Některé obsahují přímo ty dobré bakterie, to jsou probiotika – Některé obsahují oboje, to jsou symbiotika Péče o vaginální mikroflóru l Také vaginální ekosystém může být narušen antimikrobiální léčbou či nějakým onemocněním l Také zde doporučují „lidové receptury“ např. aplikaci jogurtu do pochvy l Jinak lze doporučit prebiotické či probiotické vaginální čípky l Důležitá je také výživa a úprava hormonálních hladin (antikoncepce) Diagnostika mikrobů Cíle mikrobiologické diagnostiky Odhalení původce nemoci (patogena) Někdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (hlavně u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to ve fázi výzkumu) Někdy také: určení faktorů virulence Co je to vzorek Vzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: l kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) l stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. Při diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen Kmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba Kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Přehled metod l Metody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt – Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem – Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu l Metody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu 1. Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu l V případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk l V případě mikroskopování vzorku můžeme vidět – mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů – buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty – jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Typy mikroskopie l Elektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů l Optická mikroskopie – Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby – Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety) – Fixované a barvené preparáty, například: l Barvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické l Barvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC l Barvení dle Giemsy – na některé prvoky Gramovo barvení – princip 1 l Grampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. – Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť… – …a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem… – …se neodbarví ani alkoholem. l Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. Gramovo barvení – princip 2 2. Kultivace Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) l Bakterie často pěstujeme na umělých půdách l Bakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) l Za 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly l Vláknité houby se pěstují mnohem déle l Viry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Kultivace bakterií – podmínky l Bakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. l Některé jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy l Používáme různá kultivační média, sloužící k.určitým účelům l Aerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry l Striktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO[2]. Připravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce Smysl kultivace bakterií l Proč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? – Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) – Abychom získali kmen – pouze pevné půdy – Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Pojem kolonie l Kolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) l Kolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. l V některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) l Popis kolonií má významné místo v.diagnostice Kultivace v praxi l Vzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu l U pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé kolonie a mohli dále pracovat s.kmeny mikrobů l Tekuté půdy – jsou půdy pomnožovací – základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát – nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací) Tekuté půdy Pevné (agarové) půdy l Abychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen  kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. Co se dá popisovat u kolonií l Velikost l Barva l Tvar (okrouhlý…) l Profil (vypouklý…) l Okraje (výběžky..) l Povrch (hladký, drsný) l Konzistence (suchá…) l Průhlednost l Vůně/zápach l Okolí kolonie V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Pevné půdy Existují různé typy pevných půd l Diagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar) – Chromogenní půdy – zvláštní druh diagnostických půd l Selektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s.10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků) l Selektivně diagnostické půdy – např. Endova (rostou tam jen některé G– bakterie = selektivita + rozlišení bakterií podle štěpení laktózy = diagnosticita) l Obohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar) l Speciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům) Krevní agar l Nejběžnější půda v klinické mikrobiologii. Roste na ní většina bakterií. Výhodný je také tím, že různé bakterie se na něm různě chovají (rozkládají či nerozkládají krvinky) Příklad selektivně diagnostické půdy – Endova půda Endova půda umí také rozlišit bakterie podle toho, jestli dovedou štěpit laktózu, nebo ne (diagnostická vlastnost). Půdy se používají i k testování citlivosti na antibiotika l V tomto případě se bakterie naočkují po celé ploše a na půdu se nakladou kulaté papírky napuštěné jednotlivými antibiotiky (antibiotické disky). Antibiotika difundují agarem. Je-li kmen citlivý, vytvoří se zóna citlivosti. l Nejčastěji se používá bezbarvá MH půda, na které je zároveň dobře vidět i pigmenty bakterií Postup očkování výtěru z krku Výtěr z krku – reálný výsledek Pěstování anaerobních bakterií 3. Biochemická (a jiná) identifikace kmenů Biochemické identifikační metody l I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano l Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor l Existuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Jednoduchý příklad: Katalázový test l Katalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H[2]O[2]) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H[2]O[2] à 2 H[2]O + O[2] Jiný test …a další testy Někdy se zkoumají i vzájemné interakce dvou různých bakteriálních kmenů Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí l Testy se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček. l Počet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát l Liší se v technických detailech. Vždy je však substrát lyofilizovaný, bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) Zahraniční soupravy 4. Pokus na zvířeti Pokus na zvířeti Pokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou ale výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes. 5. Průkaz nukleové kyseliny Průkaz nukleové kyseliny l metody bez amplifikace nukleové kyseliny (klasické genové sondy) l metody s amplifikací (namnožením) – PCR (polymerázová řetězová reakce) – LCR (ligázová řetězová reakce) l Principiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice) l Nevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba „přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit. Praktické poznámky l Vzorky, které budou zkoumány metodou PCR, se odebírají poněkud jinak, než vzorky ke kultivaci. Mikrob nemusí nutně přežít, zato je důležité – aby DNA nebyla kontaminovaná nějakou DNA zvenčí – aby vzorek neobsahoval nějakou látku, která přivodí tzv. inhibici reakce l Proto se zpravidla používá suchý tampon, nikoli tampon s transportní půdou l Je nutno pracovat sterilně, a je nutno používat netalkované rukavice (talek může inhibovat reakci) 6. Průkaz antigenu + průkaz protilátky Metody založené na interakci antigen – protilátka l O antigenech a protilátkách bude řeč příště, dohromady s obranyschopností těla proti mikrobům l Prozatím budiž jen řečeno, že můžeme detekovat antigen pomocí protilátky, anebo protilátku pomocí antigenu Shrnutí: Práce laboratoře v praxi Práce laboratoře v praxi l Do laboratoře přijde vzorek l K nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky) l K přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci: nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek srdeční chlopně odebraný při operaci Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! Děkuji za pozornost