Úvod k prvnímu praktiku Mikrobiologie a imunologie – RV2BP_MIKR Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz, 777 031 969 Diagnostika mikrobů Cíle mikrobiologické diagnostiky Odhalení původce nemoci (patogena) Někdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (hlavně u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to ve fázi výzkumu) Někdy také: určení faktorů virulence Co je to vzorek Vzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: l kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) l stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. Při diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen Kmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba Kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Přehled metod l Metody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt – Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem – Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu l Metody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Modul A Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu l V případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk l V případě mikroskopování vzorku můžeme vidět – mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů – buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty – jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Gramovo barvení Modul B: Kultivace + PCR Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) l Bakterie často pěstujeme na umělých půdách l Bakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) l Za 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly l Vláknité houby se pěstují mnohem déle l Viry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Připravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce Smysl kultivace bakterií l Proč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? – Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) – Abychom získali kmen – pouze pevné půdy – Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k.identifikaci Pojem kolonie l Kolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) l Kolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. l V některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) l Popis kolonií má významné místo v.diagnostice B1: Prohlédněte si půdy 1. bujon 2. VL-bujon 3. selenitový bujon 4. Sabouraud 5. Löwenstein-Jenssen 6. KA 7. Endo 8. MH 9. NaCl 10. VLA 11. XLD 12. ČA 13. Levinthal 14. Slanetz-Bartley Přehled půd – první část Přehled půd – druhá část Přehled běžné mikroflóry B2: Otisky povrchu těla V úkolu B2 máte různé otisky povrchu lidského těla. Povšimněte si, že téměř všechny obsahují bílé tečky, to jsou kožní stafylokoky. l Otisk prstů obsahuje tedy především stafylokoky l Na jazyku se nacházejí také ústní streptokoky l Na rtu najdeme směs streptokoků a stafylokoků l Na penisu stafylokoky s příměsí jiných bakterií, např. aerokoků B3: Kultivace výtěrů l V úkolu B3 máte výtěry. Na rozdíl od B2 jsou bakterie rozočkované, a lze provést výtěry i z míst, odkud by se otisky provést nedaly. l Výtěr z nosu připomíná otisky z kůže, obsahuje také hlavně stafylokoky l Výtěr z ucha je podobný l Výtěr z krku připomíná otisk z jazyka (ústní streptokoky) l Výtěr z řiti obsahuje střevní enterobakterie. Máte jej i na Endově půdě, která se zde většinou používá Základní schéma reakce PCR l V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý. l V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru l Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace PCR a teplota Thermocyklery Proč je důležitá interní kontrola l Velmi běžným jevem je, že dochází k tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) l Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce l Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). To ale nevadí, pozitivní reakce totiž nemůže být inhibována Možné výsledky PCR l Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být. l Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce l Vzorek i IC negativní = inhibice reakce Přehled interpretace Příklad gelu – (www.medmicro.info) B4: Vyhodnocení PCR l Pokuste se na obrázku rozlišit – pozitivní výsledky (je vidět proužek vlastní reakce) – negativní výsledky (proužek vlastní reakce vidět není, ale je vidět proužek kontroly) – inhibici reakce (není vidět žádný proužek) Modul C: identifikace kmenů Biochemické identifikační metody l I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano l Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor l Existuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Možnosti praktického provedení l Rychlé testy (vteřiny až minuty) – Katalázový test – Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) l Testy s inkubací (hodiny až dny) – Jednoduché zkumavkové testy – Složité zkumavkové testy – Sady jednoduchých zkumavkových testů – Testy v plastové destičce (miniaturizace) – Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test l Katalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H[2]O[2]) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H[2]O[2] à 2 H[2]O + O[2] Příklady dalších testů: oxidázový test (diagnostický proužek) Provedení testu v praxi …a další testy Zahraniční soupravy NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) Příklad kombinace metod v diagnostice Neznámá bakterie C1 – Identifikace kombinací různých metod. l Pokuste se identifikovat tři bakterie, jejichž vlastnosti máte popsané v tabulce, pomocí přiloženého klíče Vyhodnocení destičkových testů l Z takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). l Příklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + l Je několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“ Možné způsoby hodnocení l Porovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. l Přepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno l Výsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické Počítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru. Oktalové kódy – co to je a proč l Matematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) l Z praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá opačně – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však počítáme většinou naopak Přepočítávání trojic Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) Pravděpodobnost výsledku l Je jasné, že, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme l Přesto tato šance nikdy není celých 100 % l Dá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je – na 99,3 % Janičkella elegans – na 0,5 % Evičkella pulcherima – na 0,2 % něco úplně jiného l Je pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo provede další rozlišující testy Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene l Ve skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: – % pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného – Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je T[in] = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude T[in] nižší než 1,00 C2: Vyhodnoťte Enterotest 16 u dvou kmenů l Pokuste se identifikovat dva kmeny pomocí Enterotestu 16 (resp. obrázku jeho výsledku). Podívejte se také na to, jak dobře/špatně je kmen identifikován. Přeji Vám hezký zbytek dne…