http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 77, květen 1998 257
Molekuly na povel I.
Jak můžeme molekuly DNA
stříhat a zase spojovat
ZUZANA STORCHOVÁ
V novinách i nejrůznějších časopisech se často dočítáme
o úžasných úspěších molekulární biologie, genetiky,
biotechnologií a dalších podobných věd.
S překvapením zjišťujeme, že byly objeveny geny paměti,
alkoholizmu, schizofrenie, schopnosti učení, a je
nám jasné, že za chvíli bude objeven i gen optimizmu,
charizmatu či sklonů k prostopášnosti. Vědci
zřejmě zcela nekontrolovaně v laboratořích klonují
každé zvíře, které jim přijde pod ruku, vyrábějí chimérická
zvířátka s ušima na břiše a oživují dávno
vymřelé organizmy.
Skutečnost je daleko prozaičtější a zároveň mnohem
zajímavější. Molekulární biolog je většinou úplně
obyčejný člověk, který ovšem zkoumá něco neviditelného,
něco, o jehož existenci a podobě se dovídá
pouze prostřednictvím řady detekčních technik. Jeho
práce je závislá na používaných metodách, které jsou
většinou nesmírně složité a technicky, časově i finančně
náročné. Za celý svůj život i velmi dobrý
molekulární biolog dokonale zvládne jen některé
z existujících technik, jejichž spektrum se navíc neustále
rozšiřuje.
Ačkoliv prováděcí předpisy metod molekulární biologie
jsou většinou k uzoufání komplikované, princip
používaných metod je průzračně jednoduchý.
Zkusme se tedy podívat, co vlastně ti molekulárníci
v laboratořích provádějí. Není třeba se bát, že to obyčejný
smrtelník nedokáže pochopit. Už to, že jste
dočetli text až sem, svědčí o vaší dostatečné kvalifikaci
– molekulární biolog totiž ke své práci potřebuje
znát pouze 4 písmena: A, G, C a T.
Několik užitečných vlastností DNA
Objektem zájmu molekulárních biologů jsou bílkoviny
a nukleové kyseliny (nukleové znamená jaderné
a ony se skutečně vyskytují v jádře, i když nejenom
tam). Nechme bílkoviny prozatím stranou
a soustřeďme svůj zájem na nukleové kyseliny, které
se v organizmech vyskytují ve dvou podobách. Obě
mají podobnou strukturu, složení i vlastnosti a liší
se jen v drobných, ale podstatných detailech. Kostra
ribonukleové kyseliny (RNA) je tvořena cukrem
ribózou, zatímco u deoxyribonukleové kyseliny najdeme
kupodivu deoxyribózu. Drobný chemický rozdíl
mezi těmito dvěma molekulami způsbuje, že RNA
je mnohem reaktivnější a méně stabilní než DNA.
Proto je jako trvalý dědičný materiál v buňce používána
DNA, zatímco RNA slouží jako poslíček na přenos
a zprostředkování údajů z DNA. Jednotlivé molekuly
cukru jsou u nukleových kyselin spojeny pomocí
fosfátového zbytku a na každý cukr je navázána
jedna molekula dusíkaté sloučeniny – báze. Základní
jsou čtyři báze, označované jako A – adenin,
G – guanin, C – cytozin a T – tymin, které najdeme
u DNA. Nicméně znalost těchto čtyř písmen molekulárnímu
biologovi přece jenom nestačí. V RNA je
totiž místo tyminu báze uracil – U, která se ovšem
chová jako úplně prachobyčejný tymin. Cukr s navázanou
bází a fosfátem se nazývá nukleotid, a každá
molekula nukleových kyselin je tedy vlastně polynukleotid
– prostě moc nukleotidů za sebou. Pořadí
nukleotidů v molekule je onou závažnou genetickou
informací, která určuje vaši plešatost, barvu očí,
počet rukou a kdovíco ještě.
Jednotlivé nukleotidy se mohou spojovat nejenom
do řad za sebou pomocí fosfátů, ale také se mohou
chytit napřaženými ručičkami bází. Tato vazba je slabá
a funguje dobře pouze tehdy, když je těch ručiček
dostatek. Jak známe i z vlastního života, nemůže
se ovšem za ručičku držet každý s každým. Pro
nukleové kyseliny platí pravidlo, že se drží jen adenin
s tyminem (nebo uracilem) a druhou dvojici tvoří
jen cytozin s guaninem. Dodržování tohoto pravidla
je pojištěno docela jednoduše – adenin, tymin
a uracil mají dvě ručičky a pasují tedy pouze k sobě,
zatímco trojručičkový guanin má na vybranou jenom
cytozin, taktéž s třemi ručkami. A protože tři ruce
jsou více než dvě, je vazba mezi guaninem a cytozinem
o něco silnější.
Spojení molekul nukleových kyselin do dvouřetězce
je možné pouze tam, kde jsou proti sobě ty báze,
které se umějí držet za ručičky. A protože je vazba
mezi bázemi poměrně slabá, nestačí k udržení molekul
jenom jedna nebo dvě dvojice.
Mgr. Zuzana Storchová (*1970) viz Vesmír 77, 15, 1998/1
Struktura jednoho vlákna DNA, úseku složeného ze čtyř nukleotidů;
vlevo zjednodušeně, vpravo s vyznačením stavby nukleotidů obsahujících
adenin, cytozin, guanin a tymin (adenin a tymin jsou purinové
báze, cytozin a tymin pyrimidinové)
T T A C G T G A C T T A C G T G A C
´
C C G C T A C C C A A T G C A C T G
258 VESMÍR 77, květen 1998 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Této vlastnosti řetězců se říká komplementarita
(doplňkovost) a je jednou z nejzajímavějších vlastností
nukleových kyselin – umožňuje totiž jejich roz-
množování.
Jen díky tomu, že před každým rozdělením buňky
na dvě nové dojde ke zdvojení genetického materiálu,
může se dědičná informace dědit.
Stříhání a štípání
Opravdový rozmach molekulární biologie, tedy přesněji
kejklů s nukleovými kyselinami, byl umožněn
objevem restrikčních endonukleáz. Tito vnitromolekuloví
střihači nukleových kyselin (téměř přesný
překlad jejich názvu) pocházejí z bakterií, kde mají
zcela speciální a mimochodem velmi zajímavou úlohu
– rozstříhají každou cizí nukleovou kyselinu, která
náhodou vleze do buňky. Během 70. let bylo objeveno
obrovské množství restriktáz z nejrůznějších
bakterií. Nejzajímavější jsou ovšem restriktázy II.
typu, které dovedou stříhat DNA v úplně přesném
místě. Vždycky v molekule najdou stejné místo, kde
přeruší vazbu mezi cukrem a fosfátem a zanechají
po sobě pouze dva volné konce. Rozeznávané místo
ovšem nemůže být jen tak ledajaké. Vždy má jednu
zajímavou vlastnost – čteme-li ho protisměrně na
obou řetězcích, zjistíme, že má stejné pořadí bází.
Takové oblasti dvoušroubovice DNA říkáme palindrom.
Jen takové místo dovedou restriktázy II. typu
najít. Takto například vypadá místo a zásah restriktázy
EcoRI, která byla izolována z bakterie
Escherichia coli, kmene R.
Dnes známe už řadu restriktáz, které štěpí na nejrůznějších
místech. Díky jejich činnosti můžeme rozsekat
dlouhé molekuly DNA na různé kousky, které
mají konce o známém pořadí nukleotidů. K čemu
nám ale takové kousíčky molekul vlastně jsou?
Spojování a lepení
Restriktázy by samozřejmě nikdy nedosáhly takové
slávy, kdyby neexistovaly jejich protějšky – ligázy,
které umějí kousky molekul zase spojit. Restriktáza
rozbije vazbu mezi cukrem a fosfátem, ligáza ji zase
spojí. Musíme jí k tomu samozřejmě vytvořit vhodné
podmínky a dodat energii. Hlavně ale musíme spojovat
molekuly, jejichž konce k sobě patří. Lze tedy spojit
pouze kousky DNA vzniklé štěpením restriktázou
EcoRI, a nikoliv vzniklé po štěpení EcoRI a BstUI. Jinak
k sobě naštěpené kousíčky prostě nepasují.
To, co po ní zůstalo, se jmenuje lepivé konce, protože
se to může přilepit k jakékoliv jednořetězcové
molekule se stejným pořadím nukleotidů.
Jiná restriktáza BstUI z mikroorganizmu Bacillus
stearothermophillus, kmene U, po sobě zanechá jiné
stopy. Vzniklý konec se jmenuje tupý a myslím, že
je zřejmé proč.
Stejně jako výše zmiňované restriktázy, i ligázy jsou
zcela běžnými enzymy buněk, tentokrát dokonce nejenom
bakteriálních. Bez nich by vůbec celá ta mašinérie
DNA v buňce nefungovala. My jsme je pouze poznali,
porozuměli jejich činnosti a naučili se je využívat.
K čemu to celé vlastně je?
Díky restriktázám můžeme jakoukoliv DNA naštěpit
na menší molekuly s definovanými konci. Díky ligázám
spolu dovedeme kousky se shodnými konci spojit.
Trik spočívá v tom, že můžeme spojit jakoukoliv
DNA z jakéhokoliv organizmu s molekulou pocházející
z jakéhokoliv organizmu jiného. Stačí, když mají
spojované kousky stejné konce. A tak můžeme kousek
molekuly DNA, který v člověčích buňkách vydává
instrukce k výrobě inzulinu, spojit s kouskem DNA,
který umožní jeho udržení v bakteriích. Když pak takovouto
pospojovanou, chimérickou, rekombinantní
DNA, vzniklou z kousků molekul dvou různých organizmů,
přeneseme do bakterií (a ještě s tím provedeme
nějaké další složité kejkle), můžeme docílit toho,
že nebohé bakterie začnou ve velkém vyrábět inzulin.
No, a hádejte, jak se dneska (nejenom) inzulin vyrábí.
Štěpení a spojování molekul DNA je základní metodou
molekulární biologie a představuje vstupní
bránu k dalším technikám. Projděte si ještě jednou
celý článek – není to jednoduché? ¨
/Tento výzkum je hrazen částečně z grantu GA ČR 30251/1996/
To ovšem neplatí jenom pro spojování lepivých
a tupých konců, ale i pro spojování dvou lepivých
konců s různým pořadím nukleotidů. Jakmile přečnívající
ocásky nejsou komplementární, tedy pořadí
bází sobě neodpovídá, nemohou se báze lepivých
konců chytit za ručičky a ligáza nemá co spojovat.
Replikace DNA se děje kopírováním
a doplňováním od sebe oddálených
vláken molekuly DNA.
Nukleotidy se doplňují podle principu
komplementarity bází (A–T,
G–C), vlákna se zdvojují semikonzervativním
způsobem (dceřiné
molekuly mají jedno vlákno původní
a jedno se vytvoří nově).
Vzorem pro nová vlákna DNA je
mateřská molekula DNA. Polynukleotidová
vlákna vznikají
z deoxyribonukleosidtrifosfátů
dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Proces
je katalyzován DNA-polymerázou
a podílí se na něm celý komplex
dalších enzymových bílkovin. Replikace
molekuly DNA začíná v jejím
určitém místě (iniciačním místě,
počátku).
V buňce prokaryont je na cyklické
DNA jen jedno takové místo,
replikace se odtud šíří oběma
směry.
V pentlicovém chromozomu
eukaryont je v jedné lineární molekule
mnoho takových míst. Replikační
vidlice postupují obdobně
jako u prokaryont oběma směry.
Větší počet replikačních
počátků na velkých chromozomech
eukaryont umožňuje současnou
replikaci jednotlivých úseků
chromozomu. Největší chromozom
octomilky by se z jednoho
místa replikoval 16 dní, ve skutečnosti
však jeho replikace trvá tři
minuty. Schéma na tomto obrázku
je třeba považovat pouze za hypotetický
model. Nově syntetizované
úseky jsou vytečkovány.
(Podle: A. Romanovský a kol.,
Obecná biologie, SPN, Praha 1985;
Jan Nečásek a kol., Obecná genetika,
SPN, Praha 1979).
CGAATCGAATTCGTAC CGAATCG AATTCGTAC
GCTTAGCTTAAGCATG GCTTAGCTTAA GCATG
´GCTTAGCTTAA GATGGC
CGAATCG GAACCTACCG
CGAATCGAATTCGTAC GCTTAGCTTAA CGACCTGC
GCTTAGCTTAAGCATG CGAATCG GCTGGACG
´
TGACTGCGCGACCTGC TGACTGCG CGACCTGC
ACTGACGCGCTGGACG ACTGACGC GCTGGACG