372 VESMÍR 77, červenec 1998 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Díky pilné práci novinářů bulvárních i seriózních plátků
má běžný občan vcelku vyhraněnou představu
o molekulární genetice i o molekulárním biologovi.
Každému se snadno vybaví slovní spojení jako kód
života, tajemná DNA, klíčová molekula ap. Molekuly
nukleových kyselin jsou nepochybně v přírodě velmi
důležité a objevy s tím spojené zrychlí tep každému
zasvěcenci. Nicméně podobně jako všednodenní
život Maty Hari nemusel být nijak zábavný a ona
sama mohla být nudná a znuděná, o molekulární
biologii platí, že každodenní rutinní práce mnoho
vzrušení nenabízí. V jedné situaci však zavládne
v každé laboratoři hmatatelné napětí – když se snažíme
prokázat, že jsme skutečně dospěli ke kýženému
výsledku.
Ona totiž DNA, ačkoliv je molekulou vpravdě obrovskou,
není běžně viditelná. Pokud s ní tedy něco provádíme,
musíme mít předem vymyšleno, jak si výsledek
provádění ověřit. Vždycky je to metoda časově
i přístrojově náročná a tak nějak hodně za roh. Jako
byste přítomnost někoho u vás v bytě zjišťovali měře-
Molekuly
na povel III.
Jak to udělat,
aby molekula byla
dobře viditelná
ZUZANA STORCHOVÁ
Mgr. Zuzana Storchová (*1970) viz Vesmír 77, 15, 1998/1
JAK SE DĚLÁ ELEKTROFORÉZA?
Existuje samozřejmě několik možných způsobů. My si
povíme jenom o jednom (všechny ostatní jsou do značné
míry podobné). Do speciální formy na gely nalijeme
roztok a vsuneme do ní tzv. hřeben. Po utuhnutí a vyndání
hřebene získáme obdélník gelu s jamkami na nanesení
vzorku (obr. 1). Roztok DNA s modrou barvičkou
(která je také záporně nabitá a ukazuje nám, zda
vůbec a jak se záporně nabité molekuly gelem pohybují)
naneseme do jamek, zapneme elektrický proud
(stejnosměrný) a čekáme. Zatímco my neděláme nic,
molekuly nukleových kyselin se proplétají vlákny, dutinkami,
komůrkami a jeskyňkami gelu. Čím větší molekula,
tím hůře jí to jde, a tak za určitou dobu překoná
mnohem kratší vzdálenost než molekula malá, která
se dutinkami gelu snadno prosmýkne. A nejen to. Například
kruhová, pevně smotaná molekula se pohybuje
gelem mnohem rychleji než stejně velká molekula
lineární. Zkrátka na gelu se nám jednotlivé molekuly
od sebe oddělí buď podle velikosti, nebo podle trojrozměrné
struktury. A to je to, co nás zajímá.
ním otřesů předmětů na kuchyňském stole u souseda.
I zde však platí, že základní princip není obtížné
pochopit – no, a pak už si jenom vymýšlíme variace.
Zviditelněním svého druhu je vyhledávání pomocí
sondy při hybridizaci (viz Vesmír 77, 312, 1998/6).
Pokud získáme na filmu černý flek, naše DNA je ve
vzorku – vidíme ji tam. Zcela zvláštní typ „vidění“ je
prostřednictvím bakterií. DNA vneseme do bakterií
1. Schematický náčrtek elektroforetického zařízení na agarózové gely.
Do bločku s chránítky na stranách (díky nimž se vytvoří vanička)
nalijeme tekutý gel a vložíme hřeben. Po utuhnutí gelu hřeben vyndáme,
odstraníme chránítka a vložíme do vaničky mezi dvě elektrody
tak, aby povrch gelu byl pod hladinou roztoku. Naneseme vzorek
a do platinových elektrod zapojíme stejnosměrný elektrický proud.
2. Na obrázku vidíme proužky DNA vzniklé po restrikci, elektroforetické
analýze a obarvení etidiumbromidem. Po stranách jsou naneseny
hmotnostní markery, které umožňují určení velikosti frag-
mentů.
a takto upravené buňky vysejeme na médium, kde
mohou vyrůst jenom buňky s cizorodou DNA
v bříšku. Pokud tedy bakterie vyrostou, je v nich ta
správná DNA a díky bakteriím ji vidíme. Odtud pramení
ten poněkud přezíravý vztah molekulárních
biologů k bakterii Escherichia coli, která k takovým
účelům slouží. Nejčastějším způsobem, jak si DNA
prohlédnout, však zůstává elektroforéza.
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 77, červenec 1998 373
Hlavně elektřina
Molekulární biologie, tak jako kterákoli jiná činnost
člověka, jede hlavně na elektřinu. Nukleové kyseliny
jsou totiž skutečně kyseliny, tedy záporně nabité molekuly.
Za jejich (nemalý) záporný náboj mohou fosfátové
spojky mezi jednotlivými nukleotidy. Díky
tomu, že jsou negativně nabité, pohybují se
v elektrickém poli stejnosměrného proudu vždy od
katody k anodě, tedy od – k +. To samo o sobě ale
ještě nestačí. Molekuly nukleových kyselin se nepohybují
jen tak ve vodě nebo v nějakém vodivém roztoku.
Obvykle je necháme prolézat gelem, který se
připravuje například z agarózy nebo z polyakrylamidu.
Elektroforézou molekuly sice rozdělíme, máme je
na gelu, ale stejně nic nevidíme. Proto je nutné gel
s našimi vzorky obarvit. To se dělá pomocí vmezeřující
barvičky etidiumbromidu. Tato barvička se
skutečně vmezeří do záhybů dvoušroubovice DNA
a zůstane tam poměrně pevně zaklíněna – a pořád
ještě nic nevidíme. Teprve když na takto obarvenou
DNA posvítíme ultrafialovým světlem, vmezeřená barvička
začne krásně oranžově svítit. A svítí jenom tam,
kde nějaká DNA je (obr. 2).
Variace na známá témata
Ani bych snad neměla psát, co všechno nám elektroforéza
nukleových kyselin umožňuje, aby se vám
z toho nezamotala hlava. Nicméně alespoň základní
věci. Díky elektroforéze lze poměrně přesně určit velikost
molekuly. Máte-li k dispozici molekulu (nebo
radši více molekul) o známé velikosti, můžete s její
pomocí určit velikost neznámé molekuly. Zhotovíte
si kalibrační křivku (pro každý gel je jiná, neboť velice
záleží na konkrétních podmínkách elektroforézy),
4. Blotováním a následnou hybridizací získáme úplně jiný obraz než
po elektroforéze – na filmu se totiž objeví pouze ty proužky, které
nesou námi sledovaný fragment.
kde osa x určuje velikost molekuly a osa y logaritmus
překonané vzdálenosti. Z této kalibrační křivky
pak odečítáte podle vzdálenosti od jamky i velikost
neznámých molekul. Pokud máme nějakou větší molekulu
a chceme se v ní alespoň trošku zorientovat,
použijeme tzv. restrikční mapování. O restriktázách
už víme, že nám mohou každou molekulu DNA rozštěpit
na menší fragmenty – pokud v té molekule najdou
svá příslušná restrikční místa. Naštěpíme-li si
tedy molekulu DNA jednotlivými restriktázami
i kombinacemi několika restriktáz, a pak naštěpenou
DNA proženeme gelem při elektroforéze, získáme obrázek
proužků DNA. Odečtením podle kalibrační křivky
určíme jejich velikost, součtem velikostí všech fragmentů
zjistíme celkovou velikost molekuly a vzájemným
kombinováním štěpů jednotlivými restriktázami
i kombinací restriktáz získáme celkový obraz
o místech pro jednotlivé enzymy na molekule – vytvoříme
restrikční mapu (obr. 3). Ta nám pak poskytuje
základní orientaci pro danou molekulu.
Elektroforéza nám od sebe oddělí jednotlivé fragmenty
molekul nukleových kyselin. Tyto fragmenty
můžeme z gelu izolovat a dále s nimi pracovat. Elektroforézou
(ve zcela speciálním uspořádání) můžeme
analyzovat i celé chromozomy. Také můžeme provést
elektroforézu RNA. S tím si prostý výzkumník
užije pořádný kus legrace, protože, jak už víme, RNA
je třeba tvrdě bránit před RNázami.
Elektroforeticky můžeme analyzovat i proteiny.
Tam je to ovšem trochu složitější. Na rozdíl od nukleových
kyselin nemají bílkoviny vyhraněný elektrický
náboj, ale jejich celkový náboj záleží na aminokyselinovém
složení. Některé buněčné bílkoviny
jsou tedy pozitivně nabité, jiné negativně, některé
více, jiné méně. Jejich pohyb gelem není určen pouze
velikostí, ale i nábojem. Pro některé typy analýzy
to vůbec nevadí, ale někdy to je velká nevýhoda. Lze
ji ovšem odstranit tak, že elektroforézu proteinů provedeme
v nadbytku látky sodiumdodecylsulfátu
(SDS). To je taková celkem nezajímavá molekula,
záporně nabitá, s dlouhým, dvanáctiuhlíkatým ocáskem.
Jakmile potká nějakou bílkovinu, tak se na ni
namotá. Tím na ni ovšem přenese i svůj záporný
náboj, takže nám odpadne starost s rozdílným nábojem
bílkovin a ty se při elektroforéze za těchto podmínek
dělí jenom podle velikosti. Takto upravené
bílkoviny pak proženeme polyakrylamidovým gelem,
fixujeme, obarvíme – a už je vidíme!
3. Velmi jednoduchá ukázka, jak se lze pomocí restrikčního mapování
alespoň zhruba zorientovat v molekule DNA. Kruhovou molekulu
naštěpíme enzymem A, enzymem B a oběma najednou. Získané fragmenty
rozdělíme na elektroforéze a využijeme také hmotnostního
markeru DNA, který poskytuje fragmenty o známé velikosti (dráha
1). Štěpením enzymem A získáme jeden fragment o velikosti 7000
párů bází (dráha 2), zatímco v dráze 3 vidíme, že enzymem B dojde
k rozštěpení molekuly na dva fragmenty 3 a 4 kbp (kilobasepare –
tisíc párů bází). Současným štěpením oběma enzymy získáme fragmenty
1, 2 a 4 kbp. Kombinací všech dosažených informací zjistíme
jediné možné uspořádání restrikčních míst ve studované molekule i
její velikost. Toto je samozřejmě velmi jednoduchý případ. V jedné
molekule je obvykle restrikčních míst mnohem více.
374 VESMÍR 77, červenec 1998 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Nejúžasnější věci však zjistíme kombinací všech
nám dosud známých metod. Můžeme například naštěpit
DNA různými restriktázami a vzorky analyzovat
elektroforézou. DNA se rozdělí podle velikosti
a my ji z gelu přeneseme na membránu pomocí kapilárních
sil v procesu, jenž se česky (roztomile staromilecky)
jmenuje přesávka, ale v laboratorní hantýrce
mu nikdo neřekne jinak než blotování. DNA
přenesenou na membráně (a během přenosu denaturovanou)
pak hybridizujeme se sondou vyrobenou
podle nějakého fragmentu, který v naší molekule
musí být. Díky tomuto postupu získáme nejenom
restrikční mapu, ale i přesnou lokalizaci nějakého
pro nás zajímavého fragmentu v analyzované molekule
(obr. 4). Nebo izolujeme veškerou buněčnou
RNA, proženeme ji gelem, přeneseme na membránu
a hybridizujeme se sondou vytvořenou podle sekvence
nějakého úplně konkrétního, pro nás zajímavého
genu. Získáme-li potom na filmu černý flek, znamená
to, že v buňkách je přítomna RNA vytvořená podle
onoho genu, a tedy nejenže je v genomu gen přítomen,
ale navíc je i aktivní, tedy vytváří se podle něj
mRNA (a zřejmě i bílkovina). Ale hlavně je elektroforéza
opravdu jediná metoda, která umožňuje snadno
a rychle vidět studovanou molekulu. A to není
málo. o
PIERCE J. HOWARD: Příručka pro uživatele mozku
(z originálu „The owner‘s manual for the brain“ přeložil František Koukolík),
nakladatelství Portál, Praha 1998, 400 stran, náklad neuveden, cena 329 Kč
P. J. Howardovi se podařil husarský kousek. Není
odborník v kognitivní vědě ani v jiných vědách
o mozku. Je manažer. Přesto zvládl principy kognitivní
vědy natolik, že o ní napsal knihu. Protože je
Američan, který dobře zná většinu svých bližních
a ví, jaký je jejich vkus, je kniha praktická příručka.
K americkým příručkám tohoto druhu bývám nedůvěřivý.
Přestože jsem teoretik a nadto Evropan,
P. J. Howard mou nedůvěru překonal. Příručku jsem
přeložil. Je to chytrá, veselá a čtivá knížka. Nejsilnější
je v místech, o nichž jsem mylně předpokládal,
že budou nejslabší. Autor jim v knížce vyčlenil
prostor nadepsaný Užití. Mluví o tom, k čemu jsou
informace kognitivní vědy dobré v našem praktickém
každodenním životě. Kniha má šest částí.
l Chcete rychle pochopit, jak pracuje mozek? pojednává
o posledních novinkách kognitivní vědy. Stručně
a jasně vysvětluje stanovisko k tak spletitému vztahu,
jakým je vztah mozku a vědomí. Jsou v ní i základní
pojmy popisující principy stavby a činnosti mozku.
l Váš osobní almanach vypráví o tom, jak mohutně
je tělo ovlivňováno vědomím. Obsahuje kouzelnou
kapitolu o tom, jak se dá vyjít s druhým pohlavím.
Další kapitoly mluví o stárnutí, výživě, spánku. Významné
jsou informace o leváctví a praváctví.
l Vztah mozku a osobnosti se zabývá vrozenými
a získanými vlastnostmi, osobnostními rysy a psychobiologií
emocí. Obsahuje kapitolu o třech pohledech
na inteligenci.
l Vztah lidí a jejich zaměstnání je pravděpodobně
nejpraktičtější část. Zdůrazňuje výhody optimistického
pohledu na svět. Vysvětluje stres a syndrom
vyhoření, zabývá se postupy umožňujícími stres každodenně
zvládat. Významná je část pojednávající
o ergonomice.
l Část nabízející praktické postupy, jak lépe pracovat
s učební látkou, využijí zejména studenti, učitelé
a rodiče. Dovědí se toho dost i o paměti a učení.
Cenné jsou kapitoly o tvořivosti, například jak se dá
pěstovat nebo naopak ubít.
l Závěrečná část se zabývá vztahem kognitivní vědy
a filozofie. Cenná mi připadá kapitola o vývoji poznávání,
nazvaná Každodenní epistemologie. Málokde
je srozumitelněji podán výklad Kuhnova para-
digmatu.
Kniha je určena širokému čtenářskému okruhu.
Český čtenář si bude muset nejprve zvyknout na
povinnou dávku amerického optimizmu. Snad to
bude vyváženo tím, že autor dokázal k svým tvrzením
zaujmout rozumný odstup, občas i s humorem.
Pod ikonou Varování čtenářům stojí nápis: Spolknete-li
všechno, co je v této knize napsáno, může vás
to ohrozit na zdraví.
Knížka na zdraví neohrožuje. Naopak. Čím větší
počet lidí by byl schopen dodržovat alespoň některá
z pravidel uvedených v Užití pod jednotlivými kapitolami,
tím lépe. František Koukolík
PROTOKOL SEPSANÝ K VOLBĚ UČITELE
Z 18. STOLETÍ; ZNÍŤ TAKTO:
Ježto po smrti dosavadního učitele jen pět uchazečů
se přihlásilo, předsevzata s nimi zkouška před očima
a ušima celé obce v kostele, potom dále zkoušeni byli
na faře.
1. Martin Oves, zdejší švec, 30 let stár, zpíval v kostele
tři písně; ale měl by se učiti ještě mnohé melodie,
také hlas jeho mohl by býti lepší. Četl z knihy obstojně,
a slabikoval jakž takž. Tři rukopisy četl prostředně. Zodpovídal
tři otázky z rozumu dosti dobře. Recitoval
z katechismu o svátosti oltářní bez chyby. Napsal tři
řádky diktanda – 4 chyby. Počtů jest úplně neznalý.
2. Jakub Maučka, tkadlec z D., má padesátku za zády;
zpíval tři písně, ale melodie přecházela do mnoha jiných
písní, hlas měl by míti silnější, vícekráte vykvikl,
což by nemuselo býti. Četl Jana 19, 1 – 7 s deseti chybami,
slabikoval Jana 18, 23 – 26 bez chyby. Tři rukopisy
četl – slabě a zajíkal se. Z rozumu tři otázky zodpovídal
dobře. Z katechismu recitoval bez chyby. Diktanda
napsal tři řádky – 5 chyb. Počtů také neznal.
3. Václav Senohrad, krejčí z S., stařec šedesátiletý,
měl raději zůstati doma. Zpíval dvě písně; hlas má jako
bečící tele, také stále upadal do melodií jiných písní.
Četl z Josua – hrozně, slabikoval s velikým namáháním;
velké T mu bylo kamenem úrazu. Z rozumu tři otázky
– zůstal na holičkách. Maje čísti tři rukopisy, přiznal
se, že neumí. Z diktanda napsal velmi obtížně tři slova
– k nepřečtení. Počítati neuměl docela nic; počítal na
prstech jako malé dítě. Bylo mu řečeno, že jednal zpozdile,
hláse se k probě, což sám slze a vzlykaje uznal.
4. Jan Sejkora, kotlář zdejší, padesátník, zpíval tři
písně dobře. Četl a slabikoval Genesis 10, 13 – 18 dobře.
Při katechismu zpozorováno, že v některých částech
se nepocvičil. Diktanda napsal 3 řádky – ušlo to,
pokud týče se písmen, ale udělal 10 chyb. Z počtů znal
jen addici.
5. Jan Vojtů, poddůstojník z N.; ztratil v bitvě nohu, 45
let stár, zpíval tři písně dobře, má silný hlas, ale melodie
chyběla. Tři rukopisy četl hbitě. Četl a slabikoval z Genesis
10, 13 – 18 obstojně. Katechismus uměl dobře.
Čtyři otázky z rozumu – tak tak. Diktando 3 řádky, ale 8
chyb. Z počtů znal addici a trošku subtrakce.
Protože Jakub Maučka vždy „bonae famae“ byl
a přímluvčích mnoho měl, obdržel místo.
Ze sborníku VIII. seminář o filozofických otázkách
matematiky a fyziky, Brno 1997
NADKNIHOU