BUNĚČNÁ BIOLOGIE
RibOZOITI - továrna na proteiny
Komplex, v němž se setkávají dva světy
MARIAN Jedním ze základních buněčných procesů je
NOVOTNÝ translace. Při translaci, jak název napovídá,
je informace zapsaná v pořadí nukleotidů mRNA překládána do sekvence aminokyslin proteinů. Hlavní továrnou na výrobu proteinů jsou u prokaryot i eukaryot ribozomy. Proteiny v buňkách obstarávají většinu práce, a proto se jejich vzniku věnovala vždy velká pozornost. Stranou nezůstala ani komise pro udělování Nobelovy ceny, za translaci jich udělila hned několik. Jednu z nich obdrželi v roce 1968 Robert Holley, Gobind Khora-na a Marshall Nirenberg za rozluštění genetického kódu. Další, spojenou s ribozomem, dostali v roce 1974 Albert Claude, Christian de Duve a George E. Palade za rozvoj elektronové mikroskopie a ultracentrifugačních technik.1
Roku 2009 obdrželi Nobelovu cenu za chemii Ada E. Yonathová, Venkatraman Rama-krishnan a Thomas A. Steitz za své „studie struktury a funkce ribozomu" (viz životopisný rámeček). Odpověděli na otázky: Jak získat strukturu velkého nesymetrického makromolekulárního komplexu? Jak dosahuje ribozom své spolehlivosti při překladu mRNA do proteinu? Jak vzniká peptidická vazba (je její tvorba katalyzována proteinem,
nebo RNA)?
1. Struktury ribozomu odhalují, proč můžou některé tRNA vázat více než jeden kodon. Správnost párování bází na pozici 1 (A) a pozici 2 (B) kodonu je kontrolována za pomoci efektivního párování nukleotidů kodonu a antikodonu, ale také za pomoci nukleotidů 16S RNA, které zajišťují správnou geometrii vazby vytvářením vodíkových můstků a kontaktem Van der Wallsových povrchů s kodonem a antikodonem. Párování na pozici 3 (C) kodonu je však z hlediska geometrie vazby kontrolováno méně přísně (chybějí nukleotidy, které by vázaly jak kodon, tak antikodon), a proto je na třetí pozici často tolerováno více nukleotidů. Většina organismů nemá 64 tRNA a bez tolerování více nukleotidů na 3. pozici by nebyly schopny zajistit translaci. Obrázek © Marian Novotný; vytvořeno programem Pymol na základě struktury 1IBM.
Cesta za strukturou
Skupiny Yonathové, Ramakrishnana i Steitze získaly nezávisle na sobě trojrozměrné struktury malé a velké podjednotky prokaryotické-ho ribozomu s přesností, která umožňovala určit polohu valné většiny atomů celé podjed-notky (s výjimkou vodíkových atomů).
Struktury malé i velké podjednotky byly určeny rentgenovou krystalografií. Nutnou a často obtížně splnitelnou podmínkou pro použití rentgenové krystalografie je získání krystalu sloučeniny, proteinu či komplexu proteinů, které chceme studovat. Krystal si lze představit jako naprosto pravidelné, často symetrické uspořádání až tisíců miliard molekul. Podmínky, za kterých látky krystalizují, nejsou dosud podrobně objasněny, ale obecně lze říci, že čím je látka menší a jednodušší, tím snáze krystalizuje (všichni známe z kuchyně krystaly jedlé soli). Naopak čím je větší (a v případě komplexů i nesymetričtější), tím obtížnější je připravit z ní krystaly. Strukturní biologové sice už od sedmdesátých let určují struktury virových kapsid, které jsou často mnohonásobně větší než ribozom, ale virové kapsidy se skládají obvykle jen z několika málo často se opakujících proteinů s velkou vnitřní symetrií. Ribo-zom je naproti tomu složen ze dvou pod-jednotek. Malá podjednotka ribozomu má molekulovou hmotnost okolo 800 000 dal-tonů (to se rovná hmotnosti 66 666 atomů uhlíku) a skládá se z 20 proteinů a z molekuly RNA dlouhé asi 1600 nukleotidů (16S
RNA). Velká podjednotka ribozomu má velikost asi 1 500 000 daltonů a skládá se z 33 proteinů a dvou molekul RNA. Větší molekula RNA (23S RNA) je dlouhá okolo 2900
nukleotidů a ta menší (5S RNA) asi 120 nukleotidů. Jde o komplexy tak velké, že k jejich
444 Vesmír 89, červenec - srpen 2010 | http://www.vesmir.cz
ADA E. YONATHOVÁ (Weizmann Institute of Science, Izrael) *22. 6. 1939 v Jeruzalémě. Její rodiče se tam přistěhovali z Polska. V dětství neměla žádné vlastní knížky. Jako středoškolská studentka (Tichon Chadaš v Tel Avivu) si přivydělávala doučováním. Vzorem jí byla Marie Curie-Sklodowská. Po maturitě studovala Hebrejskou univerzitu v Jeruzalémě, kde získala titul bakaláře z chemie (1962) a titul magistra z biochemie (1964). V roce 1968 obdržela Ph.D. z rentgenové krystalografie ve Weizman-nově ústavu v Rechovotu. Mj. spolupracovala s NASA při výzkumech ve vesmíru. VENKATRAMAN RAMAKRISHNAN (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Velká Británie) *1952 v Čidambaramu v jihoindickém státě Tamilnadu. Má americké občanství. Doktorandské studium v oboru fyzika absolvoval na Ohijské univerzitě v USA (1976). Je vedoucím vědeckým pracovníkem ve výzkumné laboratoři molekulární biologie na Cambridgeské univerzitě ve Velké Británii.
THOMAS A. STEITZ
(Yaleova univerzita, New Haven, CT, USA) *1940 v Milwaukee. V roce 1966 získal doktorský titul v oboru molekulární biologie a biochemie na Harvardově univerzitě. Působí na Yaleově univerzitě v New Havenu a v tamějším Lékařském institutu Howarda Hughese.
popisu přestal stačit standardní formát pro popis a ukládání do databáze struktur makromolekul - proteinové databanky. Tento formát se s úspěchem používal 30 let, ale jeho tvůrci nepočítali s tím, že může být kdy určena struktura, která má více než 100 000 atomů. Proto musí být v databázi struktury ribozomů formálně rozděleny do několika substruktur, aby mohly být popsány standardním formátem. O symetrii nemůže být v případě ribozomu ani řeči.
Pokusy o krystalizaci ribozomu
Na začátku osmdesátých let, kdy Ada Yo-nathová začínala s pokusy o krystalizaci ribozomu, byla jednou z mála lidí, kteří věřili, že vůbec půjde krystaly ribozomu (difrak-tující do vysokého rozlišení) připravit. Jedním ze zásadních příspěvků Ady Yonathové bylo použití ribozomů bakterií z extrémně teplých pramenů (Geobacillus stearothermo-philus) a Mrtvého moře (Haloarcula maris-mortui). Podobné bakterie sehrály přibližně v téže době zásadní roli při vynálezu poly-merázové řetězové reakce (PCR). Jde přinejmenším o druhý případ, kdy studium zdánlivě obskurních organismů vedlo k objevu oceněnému Nobelovou cenou. Yonathová očekávala, že tyto bakterie budou mít stabilnější ribozomy než bakterie běžně studované (jako E. coli) a že poskytnou větší šanci získat krystal. Její očekávání se potvrdila, už v polovině osmdesátých let získala krystaly s rozlišením okolo 6Á, ty však nestačily k získání informace o poloze jednotlivých atomů. Ještě větší přesnosti dosáhla Yonathová
Mgr. Marian Novotný, PhD., (*1979) vystudoval biologii na Přírodovědecké fakultě UK, doktorát získal ve Švédsku na Uppsalské univerzitě. Půl roku působil též v Evropském bioinfor-matickém institutu. Nyní se na PřF UK v Praze zabývá strukturní bioinformatikou, zejména hodnocením kvality proteinových struktur a jejich souvislostí s funkcí proteinu.
dalším vylepšováním purifikace a krystali-zace a hlavně zmražením vzniklých krystalů v tekutém dusíku. Zmražené krystaly mají totiž větší trvanlivost v paprsku rentgenového záření, což usnadňuje sběr dat a snižuje požadavky na množství materiálu. Data z jednoho zmraženého krystalu mohla být sbírána i šest dní.
Dalším významným příspěvkem k získání struktury ribozomu byl i vynález CCD2 detektorů, urychlujících a zpřesňujících sběr dat.3
S pomocí těchto inovací se týmu Ady Yo-nathové povedlo v roce 1991 dospět až ke krystalům difraktujícím na hranici atomárního rozlišení (3Á).
Trvalo však dalších devět let, než byly dobře difraktující krystaly proměněny ve skutečné struktury ribozomu. Novou výzvou bylo najít způsob, jak se zorientovat v nepřehledném shluku skvrn, tedy v obrazu difraktujícího krystalu. K řešení tohoto fázového problému přispěli další dva nositelé loňské Nobelovy ceny. Především využití dat z kryoelektro-nové mikroskopie vedlo v roce 2000 k určení atomární struktury podjednotek ribozomu všemi třemi skupinami nezávisle na sobě.
Na téměř dvacetileté cestě za strukturou ribozomu zmínění laureáti objevili či rozvinuli řadu metodik, které jsou dnes neodmyslitelnou součástí určování struktur i mnohem menších proteinů.
1) Palacle byl první, který na začátku padesátých let pozoroval ribozomy.
2) CCD - charge-coupled devices (zařízení s vázanými náboji).
3) Shodou okolností byl i vynález těchto detektorů odměněn
r. 2009 Nobelovou cenou (za fyziku).
SLOVNÍČEK
kodon - trojice nukleotidů v mRNA určující zařazení jedné aminokyseliny v proteinu
antikodon - trojice nukleotidů v tRNA vázající se na kodon, je specifický pro každý typ tRNA
mRNA - molekula představující přepis genu, podle něhož je syntetizován protein
tRNA - transferová RNA; molekula nesoucí vždy jednu aminokyselinu do místa syntézy proteinu; každá aminokyselina má svou vlastní tRNA
http://www.vesmir.cz | Vesmír 89, červenec - srpen 2010 4 45
2. Struktura 70S ribozomu z teplomilné bakterie Thermus thermophilus. Zeleně jsou zobrazeny proteiny z velké (50S) podjednotky, modře proteiny malé (30S) podjednotky a zlatě jsou molekuly RNA. Obrázek © Marian Novotný; vytvořeno programem Pymol na základě struktur proteinů 2WRN a 2WRO.
Molekulární pravítko
Jedním z dalších tajemství zůstával i po desetiletích studia způsob, jímž dosahuje ribozom přesnosti při čtení kodonů a jejich překladu. K čtení využívá molekuly tRNA, které na jedné straně nesou aminokyselinu, na druhé straně mají trojici nukleotidů (antikodon), kerá se může párovat s kodonem mRNA (viz slovníček na předchozí straně). S jedním kodonem se však může efektivně párovat více antikodo-nů (viz obr. 1), neboť na třetí pozici kodonu jsou párovací pravidla mnohem mírnější než klasická watson-crickovská, která se uplatňují na prvních dvou pozicích.
Struktury určené skupinou Venkiho Rama-krishnana vysvětlují tento jev velice elegantně. Specifické nukleotidy 16S RNA, konkrétně A1492, G530 a A1493, totiž vytvářejí vodíkové můstky s nukleotidy kodonu i antikodonu pouze tehdy, pokud dojde k jejich správnému párování a geometrické orientaci. Nukleotidy podjednotky 16S tvoří „molekulární pravít-
Abstract: Ribosome - proteinfactory by Marian Novotný. The Nobel price in Chemistry was in 2009 awarded to three structural biologists who significantly contributed to the understanding of translation of information carried by RNA to proteins. Their revolutionary insights came from 3D structures of ribosomes. Ada Yonath was the first person to acquire well-diffracting ribosome crystals, Thomas Steitz solved ribosome's phase problem and identified the region of the ribosome responsible for the formation of peptide bond. Venkatraman Ramakrishnan described how is codon correctly recognized by anticodon through a „molecular ruler" in small ribosomal subunit. Their 3D structures were also used in designing new antibiotics.
Co vyprávějí šumavské smrčiny
Průvodce lesními ekosystémy Šumavy
Publikace širokého týmu odborníků se věnuje velmi aktuální problematice unikátních horských smrkových lesů na Šumavě. Autoři populární formou vysvětlují moderní pohled na dynamiku horských smrčin, přibližují nejnovější poznatky vlastních dlouholetých výzkumů šumavských horských ekosystémů i výsledky studií bavorských kolegů. Populární text je doplněn ilustracemi, fotografiemi a odbornými rámečky, které jsou určeny pro ty, kteří se chtějí s problematikou seznámit do větší hloubky.
Kniha názorně představuje složitý ekosystém horských smrčin, vzájemné dynamické soužití smrku a kůrovce, význam mrtvého dřeva pro obnovu lesa, vývoj lesů na Šumavě od poslední doby ledové i historické využívání šumavských hvozdů člověkem. Desítky grafů, mapek a fotografií názorně dokumentují popisované souvislosti, dlouhodobé důsledky tzv. kyselých dešťů i klimatických změn, či účinky různého lesnického hospodaření na citlivé horské ekosystémy, a zároveň uvádějí na pravou míru některé mediální mýty.
ko", které „měří" správnost párování, a zvyšují přesnost čtení, jež je určena komplementaritou nukleotidů kodonu a antikodonu. Na třetí pozici 16S RNA nic nekontroluje, a proto je na ní tolerováno více párů než na prvních dvou pozicích.
Vznik peptidické vazby
Peptidická kovalentní vazba, která spojuje dvě aminokyseliny, vzniká ve velké podjed-notce ribozomu (viz obr. 2), v oblasti zvané peptidyl-transferázové centrum. Struktura podjednotky 50S ze Steitzovy laboratoře poněkud překvapivě ukázala, že se v pepti-dyl-transferázovém centru vyskytuje pouze 23S RNA. Zdálo se tedy, že jednu z nejvý-znamějších reakcí v buňce nekatalyzuje žádný protein, ale molekula RNA. Tento nález dále podpořil představu, že na začátku historie života mohla hrát RNA zásadní roli. Mohla být nejen nositelem informace, ale i katalyzátorem reakcí. Až pozdější biochemické a simulační studie objasnily detailní reakční mechanismus vzniku peptidické vazby. Ribozom nesnižuje aktivační entalpii nutnou pro vznik peptidické vazby, jeho příspěvěk je spíše entropický. Peptidyl-transferázové centrum je stabilizováno síti vodíkových můstků, přes které je transportován proton vznikající po ataku aminoskupiny jedné aminokyseliny na esterovou vazbu tRNA, vázající druhou aminokyselinu. Právě tato síť vodíkových můstků je odpovědná za snížení aktivační energie reakce v ribozomu.
Teprve nové, přesnější struktury ze Steitzo-vy laboratoře ukázaly, že se na vzniku klíčové sítě vodíkových můstků podílí nejen 23S RNA, jak se původně předpokládalo, ale i molekula tRNA nesoucí aminokyselinu, molekuly vody a ribozomální proteiny. Ribo-zom je tedy unikátním komplexem, kde se setkává svět RNA se světem proteinů.
Až 50 % všech současných antibiotik ovlivňuje překlad nukleových kyselin do proteinu. Všichni tři letošní nositelé také určili několik struktur ribozomu v komplexu s různými antibiotiky. Tyto struktury nejen blíže vysvětlují mechanismus, který překladu brání, ale především poskytují nástroj pro vývoj nových antibiotik, jichž je nám s rostoucí rezistencí bakterií třeba. Tento přínos spolu s rozvojem krystalografických metod a objasněním mechanismu, jímž vzniká peptidická vazba či je rozpoznáván kodon mRNA, dobře ilustrují, že je Nobelova cena v dobrých rukou.4 V roce 2009 ji už po třinácté získali strukturní biologové.5
4) V roce 2007 byla udělena Nobelova cena za struktury spojené s přepisem (transkripcí), loni za struktury spojené s překladem (translací), a tak by se dala očekávat Nobelova cena za struktury objasňující poslední část centrálního dogmatu molekulární biologie - replikaci. Thomas Steitz je opět horkým kandidátem, spolu s ním je v pořadí i John Kuriyan...
5) Každý příběh má své „vojevůdce", kteří se těší uznání, ale taky pěšáky, kteří odvedli kus práce, bez níž by nebylo slávy. Pravidla pro udělování Nobelových cen (sdílet cenu můžou nanejvýš tři lidé) „upřela" toto vyznamenání i několika „vojevůdcům". Velkou zásluhu má například Harry Noller, jehož skupina jako první určila strukturu celého ribozomu, nebo Joachim Frank, jehož snímky ribozomu pořízené elektronovým mikroskopem umožnily vyřešit fázový problém při určování struktur ribozomu.
446 Vesmír 89, červenec - srpen 2010 I http://www.vesmir.cz