Úvod k prvnímu praktiku Mikrobiologie a imunologie – RV2BP_MIKR Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Kostka Diagnostika mikrobů Cíle mikrobiologické diagnostiky lOdhalení původce nemoci (patogena) lNěkdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (hlavně u bakterií a kvasinek, nedělá se u parazitů a vláknitých hub, u virů je to ve fázi výzkumu) lNěkdy také: určení faktorů virulence Co je to vzorek lVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. lPři diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen lKmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Přehled metod lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem –Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu lMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů Modul A Mikroskopie Co vidíme v mikroskopu lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět –mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů –buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty –jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Gramovo barvení Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma) nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium). Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá. Dift1 Prohlédněte si preparáty čtyř různých kmenů bakterií (A, B, C, D) a kmene kvasinky (E). Bakterie budou koky i tyčinky, G+ i G-; šikovní a pozorní studenti uvidí v G+ tyčinkách i spory A1: Mikroskopie kmene Foto: archiv MÚ P1010003 A2: Mikroskopie vzorku Prohlédněte si dva vzorky. První je nátěr sputa, druhý nátěr hnisu z močové trubice muže s kapavkou Foto: archiv MÚ Modul B: Kultivace + PCR Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) lBakterie často pěstujeme na umělých půdách lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) lZa 24 (někdy až 48) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly lVláknité houby se pěstují mnohem déle lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce P1010008 Foto: archiv MÚ Smysl kultivace bakterií lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k.identifikaci Pojem kolonie lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) lKolonie je tedy vždy tvořena jedním kmenem. lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice S3 Foto: archiv MÚ B1: Prohlédněte si půdy l1. bujon l2. VL-bujon l3. selenitový bujon l4. Sabouraud l5. Löwenstein-Jenssen l6. KA l7. Endo l8. MH l9. NaCl l10. VLA l11. XLD l12. ČA l13. Levinthal l14. Slanetz-Bartley Přehled půd – první část Název Druh Barva Typ Pro bujon tekuté půdy nažloutlá pomno-žovací aeroby VL-bujon tmavší anaeroby selenitový bujon narůžovělá selektivně pomnož. salmonely Sabourau-dův agar pevné půdy ve zkumavce bílá selektivní* houby Löwentein-Jensen zelená obohacená TBC krevní agar pevné půdy v.misce červená obohacená diagnostická většinu bakterií Endova půda růžová selektivně diagnostická především enterobakterie *pouze jsou-li přidána antibiotika Přehled půd – druhá část Název Druh Barva Typ Pro MH pevné půdy na Petriho miskách skoro bílá speciální atb citlivost NaCl hnědá selektivní stafylokoky VL-agar červená jako KA anaeroby XLD (a blízký MAL) oranžová selektivně diagnostická salmonely čokoládový agar hnědá obohacená hemofily, neisserie Levinthalův agar nažloutlá obohacená hemofily Slanetz-Bartley růžová selektivně diagnostická enterokoky Přehled běžné mikroflóry Kůže, nos, boltec, zevní zvukovod, kožní adnexa Stafylokoky (i zlaté), korynebakteria, kvasinky Hltan a ústní dutina Ústní streptokoky a neisserie Hemofily, malá množství pneumokoků, meningokoků, anaeroby, nepat. treponem. Tlusté (i tenké) střevo Anaeroby, enterobakterie, enterokoky, Entamoeba coli Vagina Laktobacily, malá množství nejrůznějších mikrobů Přechody (rty apod.) Směs zástupců obou míst B2: Otisky povrchu těla lV úkolu B2 máte různé otisky povrchu lidského těla. Povšimněte si, že téměř všechny obsahují bílé tečky, to jsou kožní stafylokoky. lOtisk prstů obsahuje tedy především stafylokoky lNa jazyku se nacházejí také ústní streptokoky lNa rtu najdeme směs streptokoků a stafylokoků lNa penisu stafylokoky s příměsí jiných bakterií, např. aerokoků B3: Kultivace výtěrů lV úkolu B3 máte výtěry. Na rozdíl od B2 jsou bakterie rozočkované, a lze provést výtěry i z míst, odkud by se otisky provést nedaly. lVýtěr z nosu připomíná otisky z kůže, obsahuje také hlavně stafylokoky lVýtěr z ucha je podobný lVýtěr z krku připomíná otisk z jazyka (ústní streptokoky) lVýtěr z řiti obsahuje střevní enterobakterie. Máte jej i na Endově půdě, která se zde většinou používá Základní schéma reakce PCR lV první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý. lV druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru lVe třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace Vývoj PCR byl umožněn výzkumem vedoucím k objevení Taq polymerázy z termofilní bakterie Thermus aquaticus, která umí přežít vysoké teploty. 07 PCR_sketch_3 04 thermocycler Thermocyklery kinich.cifn.unam.mx 08 110 http:///images/110.jpg Proč je důležitá interní kontrola lVelmi běžným jevem je, že dochází k tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) lProto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce lOvšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). To ale nevadí, pozitivní reakce totiž nemůže být inhibována Možné výsledky PCR lPozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být. lNegativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce lVzorek i IC negativní = inhibice reakce Přehled interpretace Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace negativní pozitivní negativní negativní negativní inhibice reakce pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní negativní (vysoce) pozitivní pcrtbc upravený Příklad gelu – (www.medmicro.info) Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder ß Vlastní reakce ß IC B4: Vyhodnocení PCR lPokuste se na obrázku rozlišit –pozitivní výsledky (je vidět proužek vlastní reakce) –negativní výsledky (proužek vlastní reakce vidět není, ale je vidět proužek kontroly) –inhibici reakce (není vidět žádný proužek) Modul C: identifikace kmenů Biochemické identifikační metody lI mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano lBakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Možnosti praktického provedení lRychlé testy (vteřiny až minuty) –Katalázový test –Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) lTesty s inkubací (hodiny až dny) –Jednoduché zkumavkové testy –Složité zkumavkové testy –Sady jednoduchých zkumavkových testů –Testy v plastové destičce (miniaturizace) –Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm 08 oxidase3 Příklady dalších testů: oxidázový test (diagnostický proužek) medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Provedení testu v praxi Obrázek20 Foto: archiv MÚ 11 indole …a další testy 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 Foto: O. Z. http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: O. Z. Příklad kombinace metod v diagnostice lNeznámá bakterie Jiné G+ kok Enterokok Stafylokok Streptokok Streptokok s viridací Streptokok s hemolýzou Streptokok bez hemolýzy Pneumokok Ústní streptokok S. pyogenes S. agalactiae (SAG) Streptokok non-A-non-B StreptococcusPyogenes mikroby.blox.pl C1 – Identifikace kombinací různých metod. lPokuste se identifikovat tři bakterie, jejichž vlastnosti máte popsané v tabulce, pomocí přiloženého klíče Vyhodnocení destičkových testů lZ takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). lPříklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + lJe několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“ Možné způsoby hodnocení lPorovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. lPřepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno lVýsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické lPočítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru. Oktalové kódy – co to je a proč lMatematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) lZ praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá opačně – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však počítáme většinou naopak Přepočítávání trojic – – – 1 2 4 0 + – – 1 2 4 1 1 – + – 1 2 4 2 2 + + – 1 2 4 1 + 2 3 – – + 1 2 4 4 4 + – + 1 2 4 1 + 4 5 – + + 1 2 4 2 + 4 6 + + + 1 2 4 1 + 2 + 4 7 Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l – S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l ? + – + + + – – – – – – – – + + + + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 0 6 3 Pravděpodobnost výsledku lJe jasné, že, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme lPřesto tato šance nikdy není celých 100 % lDá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je –na 99,3 % Janičkella elegans –na 0,5 % Evičkella pulcherima –na 0,2 % něco úplně jiného lJe pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo provede další rozlišující testy Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene lVe skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: –% pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného –Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je Tin = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude Tin nižší než 1,00 C2: Vyhodnoťte Enterotest 16 u dvou kmenů lPokuste se identifikovat dva kmeny pomocí Enterotestu 16 (resp. obrázku jeho výsledku). Podívejte se také na to, jak dobře/špatně je kmen identifikován. Přeji Vám hezký zbytek dne… 40 CatalaseResults1 http://www.telmeds.org