http://www.vesmir.cz | Vesmír 91, březen 2012 163
Mezi vědami o životě není mnoho těch, které v posledních
desetiletích potkal podobný rozkvět jako
genetiku. Ta svými panožkami proniká do všech
možných oborů; nejspíš si na prvním místě všimneme
disciplín věnujících se nám lidem. Teprve
v době druhé světové války se nukleové kyseliny
staly uznávanými nositelkami dědičných informací
– historie, která nezasahuje dále, než je
průměrný lidský věk. Proto mnozí z nás osobně
sledovali zrychlující se rozkvět této vědy.
Především diagnostika
V  oblasti medicíny, na rozdíl od jiných přírodních
věd, se genetika uplatňuje zatím převážně
v diagnostice. Upřesňuje diagnostiku
klinickou a snaží se identifikovat příčiny onemocnění
na úrovni genomu. Ačkoli od genové
terapie jsme si slibovali mnoho, při léčbě
je její význam zatím poměrně omezený. Zasahování
do genomu se nám ještě příliš nedaří
a  navíc před námi leží mnoho zábran.
I když jsme dosáhli značného pokroku, stále
zbývá několik tisíc zjevně geneticky podložených
onemocnění, u kterých však dosud nejsme
schopni příčinu na úrovni genomu najít.
O něco větší množství (asi 3700) dědičných
chorob zná již svého odpovědného činitele
na genové úrovni. Jde o mutace nejrůznějšího
typu, kterých je popsáno víc než 100 000
(v některých genech jsme našli jednu nebo
jen několik patogenních mutací, v jiných jich
bylo identifikováno více než tisíc). Pro „genový
standard“ se u bakterií, drozofil a třeba
myší vžilo označení wild (divoký) typ. Pro
lidskou genetiku se takový název příliš nehodí
a rozhodně je lepší použít slova normální
nebo standardní. Ani jedno však není přesné
a neříká nic víc, než že máme na mysli „obvyklý“
typ bez patogenního účinku.
Genom, jak ho známe dnes, není tvořen
jen geny, jejichž konečným produktem jsou
bílkoviny, ale obsahuje celou řadu informací,
které se realizují jinak. Kromě další skupiny
„genů“, jež kódují molekuly RNA různé
velikosti, složitosti a funkčního zařazení, obsahuje
genom značné množství DNA, o níž
toho stále ještě mnoho nevíme (známe jen její
složení, sekvenci nukleotidů, víme, že se
opakují určité různě dlouhé úseky). Kódující
část genomu se svými proteinotvornými geny
tvoří jen asi 1 % z celé DNA. Protože se
nám zdálo, že převážná část genomu je pro
jeho funkci zbytečná a svými nároky (např.
replikací) jen zatěžuje buňku, byla označena
jako „smetí“ (junk).
Doba postgenomická?
Díky projektu uskutečněném organizací HUGO,
který skončil na začátku minulého desetiletí,
se podařilo sestavit téměř kompletní
nukleotidovou sekvenci lidského genomu.
V  genetice, stejně jako v  mnoha dalších vědách,
se často přehání (zvlášť při medializaci),
a  tak se období následující po tomto
úspěšném gigantickém úsilí začalo označovat
jako postgenomická fáze vývoje genetiky. Připadá
mi to však poněkud zavádějící, protože
analýza genomu jako celku zajišťujícího
vznik a celoživotní existenci každého z nás
v  podobě pevně sestavených a  evolucí vyzkoušených
a upevněných programů zdaleka
ještě neskončila. Vlastní vývoj genomu člověka
i z hlediska lidstva, byť třeba nenápadně,
stále pokračuje. Stejně tak se mění podmínky
jeho existence. Bohužel se ukazuje, že
se tyto podmínky mění podstatně rychleji,
než stačí lidský genom sledovat. Zbývá doufat
a snažit se vyrovnat se se zákony evoluce
natolik, abychom zabránili negativním dopadům,
jež takový nesoulad může mít (a nejspíš
již má).
Jednou z  cest je působení na genom. Nějaké
zkušenosti jsme s tím již získali – dokážeme
úspěšně přenášet a měnit geny rostlin
a  výzkumně i  u  živočichů. U  člověka jsou
s  tím zatím hlavně ideologické problémy.
O  něco shovívavější jsme v  případě genové
terapie, kdy připouštíme potřebu léčby genetických
nemocí, ale zásadně odmítáme „vylepšování“
lidského genomu, které pro nás
představuje do jisté míry neprávem zavrhovanou
tvář genetiky – eugeniku. Otázkou
je, zda jednou nebudeme muset vylepšování
chápat jako léčbu.
Druhou cestou, neméně obtížnou – i když
spíše ideologickými zábranami než způsoby
realizace – je zpomalit nebo alespoň utlumit
negativní změny, kterými na nás působí
vnější vlivy (často prostřednictvím našich
vlastních produktů).
Nové poznatky, nové otázky
Opusťme úvahy o budoucnosti lidského genomu
a  všimněme si některých zajímavostí,
které jsme objevili a také způsobů, jimiž jsme
k novým poznatkům došli.
Můžeme se zmínit o další regulační úrovni
v podobě mikroRNA (miRNA). Vedla k ní
cesta přes siRNA, což jsou velice krátké molekuly
RNA namířené proti informačním
Prof. MUDr. Radim Brdička,
DrSc., (*1933) vystudoval
Fakultu všeobecného
lékařství Univerzity
Karlovy v Praze a po
dvouletém období, kdy se
věnoval praktické medicíně,
pracoval 29 let v Ústavu
lékařské biologie a genetiky
1. Lékařské fakulty
v Praze. Vedle učitelských
povinností se věnoval studiu
laboratorních potkanů
a posléze se začal zabývat
i lidskou molekulární
genetikou. V roce 1989
přešel do Ústav hematologie
a krevní transfuze a Ústavu
experimentální medicíny
AV ČR, v. v. i., odkud odešel
v minulém roce do důchodu.
Nyní je na tzv. volné noze.
Vedle krátkých pracovních
pobytů v zahraničí pracoval
dva roky v Římě v Istituto
Superiore di Sanitá. Svou
pozornost zaměřuje na
proměnlivost lidského
genomu.
Poznání sekvence lidského genomu byl jen začátek
Kam kráčíš,
Radim Brdička
molekulární
genetika
genetiko?
164 Vesmír 91, březen 2012 | http://www.vesmir.cz
molekulám RNA, jejichž rozpad vyvolávají.
Ovládají tak genovou aktivitu – vedle již
známé regulace transkripce a  editace molekul
informačních RNA – dalším procesem.
Jisté zklamání nad poměrně malým počtem
lidských genů při srovnání s mnohem
jednoduššími organizmy jsme si vynahradili
poznatkem, že proces realizace genetických
informací (genů), který používá náš genom,
umožňuje, aby se tyto informace realizovaly
ve více podobách. Většina proteinotvorných
genů je totiž schopna různou kombinací
svých částí vytvářet více než jeden typ
bílkovinné molekuly. To je ovšem jen jeden
z mnoha možných zásahů do procesu realizace
genetických informací. Může nás napadnout
poměrně logická a zatím neuspokojivá
odpověď na otázku, proč buňky investují tolik
energie do transkripce, když k  realizaci
dospěje jen její část, prvotní produkt se neustále
zmenšuje, popřípadě je konečná podoba
informační RNA třeba i zavržena. Dává
se tím přednost regulačním mechanismům
před procesy syntetickými? Vedla evoluční
zkušenost k poznatku, že napřed musí dobře
fungovat adaptabilita v  rámci individuálního
vývoje, aby se vůbec mohla uskutečňovat
adaptabilita evoluční?
Složitá proměnlivost
Dobře známým fenoménem je variabilita
genomu, umožňující lepší adaptaci na vlivy
prostředí. RFLP (polymorfismus délky restrikčních
fragmentů) a jejich moderní podoba
SNP (jednonukleotidový polymorfismus)
byly dlouho považovány za nejrozšířenější
podstavu variability genomu mezi jedinci.
Přes polymorfismy repetic (opakování)
nejrůznější délky včetně homopolymerních
úseků a  VNTR (proměnlivost počtu tandemových
repetic) jsme dospěli k  CNV (variabilitě
počtu opakování). Evoluční genetika
se tímto fenoménem intenzivně zabývala
a  pokládala ho za cestu vedoucí ke vzniku
nových genů – struktury obou kopií se od
sebe vzdalovaly, přičemž si jedna zachovala
původní funkci a tak umožnila druhé kopii
získat funkci novou. Porovnáním nukleotidové
sekvence obou kopií můžeme usuzovat,
kdy v minulosti k zdvojení došlo. Zdá se, že
CNV je v genomu dokonce častější než SNP.
Ukazuje se, že variabilita primární struktury
genomu je mnohem větší, než jsme se původně
domnívali. Přitom jde o  variabilitu lidské
individuality danou spojením gamet našich
biologických rodičů a vznikem našeho
zárodečného (a svým způsobem definitivního)
genomu, který je za našeho života velice
stabilní a je ve své výchozí podobě udržován
mnoha mechanismy.
1. Nahoře: Exonukleázová sekvenace. Kanálkem vytvořeným v membráně
α-hemolyzinem procházejí jednotlivé nukleotidy odštěpované z řetězce DNA
exonukleázou a jejich průchod je zaznamenáván. Aby tento způsob sekvenace
byl účinný, je třeba, aby každý z nukleotidů (A, G, C, T) dával jiný signál.
2. Uprostřed: Jednořetězcová sekvenace. Tento způsob sekvenace je založen na
syntéze řetězce, který je protahován kanálkem, v němž je umístěný senzor různě
reagující na procházející nukleotidy. Senzor může reagovat na změny impedance,
na vodíkové ionty uvolňované při začlenění nukleotidu do řetězce (Ion Torrent)
nebo na fluorescenci vyvolanou při zařazování značených nukleotidtrifosfátů
(SMART technologie) – viz obr. 3.
3. Dole: Podle Pacific Biosciences. DNA polymeráza
pevně ukotvená na dně kanálku syntetizuje nový řetězec
z připlavovaných fluorescenčně značených nukleotidtrifosfátů,
ale jen ty, které jsou právě zařazovány,
jsou zasaženy laserem, jehož světlo proniká dnem
kanálku jen na krátkou vzdálenost. Vyvolaná fluorescence
je detekována.
Obrázky principu sekvenčních strojů třetí generace jsou použity se souhlasem
firem, zabývajících se jejich vývojem – Oxford Nanopore a Pacific Biosciences.
http://www.vesmir.cz | Vesmír 91, březen 2012 165
Zachování integrity a  neměnnosti našeho
zárodečného genomu je věnována velká péče.
Přesto však v něm dochází v jednotlivých
buňkách k odchylkám, které mohou být bezvýznamné,
nebo také pro život postižené
buňky podstatné. V posledních letech si začínáme
více všímat nejen změn genomu, které
si můžeme přinést od našich rodičů, ale i těch,
jež vznikají během našeho života – chovají se
tedy jako dědičné, ale i jako získané. Nemění
pořadí nukleotidů, ale jejich vlastnosti; např.
metylací přeměňují cytosin na metylcytosin.
Nejsou omezeny jen na DNA, ale působí i na
bílkovinnou nosnou strukturu – chromatin,
jehož modifikace jsou mnohem pestřejší. Příčinu
a výběr umístění těchto epigenetických
změn zatím dost dobře neznáme. Epigenetickým
změnám je vzhledem k jejich působení
na genovou funkci věnována v poslední době
zvýšená pozornost. Výsledkem je mimo jiné
zjištění, jak velký – ve srovnání s tím, co
o  nich víme – význam mají. V  jistém smyslu
jsou projevy epigenetických změn obdobou
mutací a svou dynamičností také spojují
konzervativnost našeho genomu s  environmentálními
vlivy. Po metodické stránce máme
k dispozici pro identifikaci metylovaných
nukleotidů vlastně jen dva přístupy – enzymatický
a chemický. Jiné postupy např. využívají
preferenční vazbu některých bílkovin
(protilátek) na metylovanou DNA, nejsou
však dosud běžné.
Sekvenační stroje, generace druhá a třetí
Dnes, kdy začínáme mít k  dispozici nové
technologie usnadňující a  především urychlující
analýzu primární struktury genomu
(a pohybujeme se v „postgenomické fázi“), se
můžeme připravit na vstup do etapy, v níž se
budeme věnovat nejen vztahům uvnitř genomu,
ale zvláště jeho vztahům k prostředí.
Pokud termínem „postgenomická fáze“
chceme naznačit, že jsme dokončili projekt
stanovení sekvence lidského genomu, pak
máme zčásti pravdu, zdaleka to však neznamená,
že o  našem genomu víme vše. Musíme
být mnohem skromnější, zvlášť ti z nás,
kteří pamatují kdysi vážně brané tvrzení, že
obsahuje asi 100 000 genů. Dnes se spokojíme
s asi 25 000 geny a víme, že snížený počet
genů víc než dostatečně nahrazuje jejich
plasticita – schopnost realizovat se ve
více než v  jednom produktu. Klasické dogma
„gen → protein“ jsme museli vyměnit za
„gen → proteiny“ (máme přitom na mysli spíše
polypeptidy). Nezměnila se velikost našeho
genomu, ať už ji vyjadřujeme jakýmkoliv
způsobem. V době, kdy jsme se dopracovali
již ke třetí úrovni sekvenačních analýz (někdo
dokonce začíná mluvit o  čtvrté), ji obvykle
udáváme v celkovém počtu nukleotidů,
což je asi 3 × 109. Téměř kompletní analýza genomu
založená na Sangerově způsobu sekvenace
trvala v  rámci původního projektu
10 let.
Díky projektu organizace HUGO vznikly
v  řadě míst sekvenační manufaktury vybavené
přístroji založenými na detekci úseků
DNA, vytvořených touto metodou, pomocí
kapilární elektroforézy. Dnes se zmiňovaná
metoda používá v omezeném měřítku,
spíše k  ověření nálezů získaných modernějšími
technologiemi druhé a  třetí generace
(v  anglickém jazyce jsou obvykle označovány
zkratkou NGS, což odpovídá „new“ nebo
„ next“ generation sequencing).
Výrobou strojů druhé generace se ve světě
zabývalo a zabývá několik firem, které si
navzájem konkurují a  v  důsledku patentové
ochrany zvolily navzájem poněkud odlišná
řešení. Většina z  nich vychází z  poměrně
krátkých fragmentů, které získá
různými způsoby rozbíjení přirozených molekul
DNA, z nichž vytvoří tzv. knihovny. Po
stanovení sekvence jednotlivých fragmentů,
které se navzájem částečně přesahují, je právě
díky těmto přesahům seřadí tak, že vznikne
plynulá sekvence odpovídající původní
DNA. K jejímu sestavení je nezbytný počítač
s odpovídajícím výkonem a kapacitou. Stroje
druhé generace vycházejí z molekul (úseků)
DNA, které jsou klasickým způsobem namnoženy
tak, aby byl získán dostatečný signál
pro detekci, který může vycházet z  fluorescenčně
značených nukleotidtrifosfátů
(pro každou bázi je zvolena jiná barva). Nezbytným
a stále se opakujícím cyklem je zaplavení
reakčního prostoru roztokem se všemi
čtyřmi typy nukleotidů a jejich následné
odplavení.1
V zahraničí vzniká řada často komerčních
institucí, které jsou vybaveny větším počtem
strojů druhé generace různého druhu, a nabízejí
celogenomové sekvenace jako službu. Je
to jistě ekonomicky výhodné, protože využití
strojů (včetně spotřebního materiálu) a pracovníků
je optimální, nehledě na dostatek
zkušeností. To se samozřejmě týká i používaných
počítačových programů a informačních
databází. Našim grantovým systémům je bohužel
úvaha o  hospodárnosti dosud velice
vzdálená, přestože by mohla značně zkrátit
dobu řešení řady projektů. Nehledě na skutečnost
že stroje díky prudkému rozvoji nových
technologií rychle zastarávají a je třeba
je maximálně využít.
Generace čtvrtá?
Postupně se objevují přístroje, které v desítky
let vzdálené minulosti předpověděl švýcarský
věděc Wilhelm Ansorge. Nejsou založeny
na nezbytném namnožení sekvenovaných
úseků, ale mohou sekvenovat jednotlivé řetězce,
aniž by používaly jakoukoliv z  výše
jmenovaných sekvenačních reakcí. Můžeme
je považovat za stroje třetí generace založené
1. Nedokonale odstraněné zbytky původního roztoku mohou dávat nepravý signál. Sekvenované úseky musí být pevně
uchyceny, aby se jejich množství podstupující další cykly nesnižovalo. Jsou obvykle připevněny na plochém podkladu
nebo na mikrokuličkách, přičemž se musí zajistit, aby záznam reakce byl dobře oddělitelný od svazků úseků namnožených
na ploše nebo na jednotlivých kuličkách. Pro použití je podstatná velikost sekvenovaných úseků. Výrobci vycházejí
z úseků krátkých (o délce 50–150 nukleotidů), nebo delších (kolem 400 a více nukleotidů). Krátké úseky se hůře seřazují,
a proto jsou tyto postupy vhodné především tam, kde si můžeme pomoci již známou sekvencí, například u lidského
genomu. Naopak když sekvenujeme neznámý genom, přinášejí jistou výhodu delší fragmenty. Výhod a nevýhod nabízených
postupů použitých různými výrobci je celá řada, záleží pochopitelně na základní sekvenační reakci, kdy se ukazuje,
že nedostatkem pyrosekvenace je nepřesný odečet homopolymerních úseků – čím jsou delší, tím je určení počtu
nukleotidů se stejnou bází problematičtější. Výhody i nevýhody se týkají i počítačového zpracování, některé stroje produkují
výsledky snadno porovnatelné s jinými, jiné jen obtížně. Ostatně produkce základních údajů – sekvence jednotlivých
úseků – vyžaduje k získání konečného výsledku značnou a dosud časově náročnou práci počítače. I tak často zbývají
místa, která je nezbytné ověřit sekvencí na jiném druhu přístroje, nebo dokonce klasickou Sangerovou technikou.
166 Vesmír 91, březen 2012 | http://www.vesmir.cz
na principu protahování řetězce DNA senzorem
vybaveným průchodem, který je schopen
jednotlivé nukleotidy (báze) od sebe odlišit.
Tato představa dospěla k reálné podobě
ve strojích, které od minulého roku nabízí
několik firem (obr. 1–3).
Zřetelnou výhodou tohoto řešení je použití
neznačených nukleotidtrifosfátů a zjednodušení
detekčního systému, který je například
omezen jen na senzor reagující na ionty vodíku
uvolňované při postupném zařazování
nukleotidů při syntéze komplementárního
řetězce. Jistým rizikem jsou však opět homopolymerní
sekvence. Jiným příkladem může
být systém založený na uvolňování a detekci
koncového nukleotidu. Podobných řešení je
celá řada a rozběhlý boom výroby nových typů
sekvenátorů, z nichž některé jsou označovány
(ne úplně správně) jako čtvrtá generace,
tomu nasvědčuje.
Pokrok v  oblasti výroby a  nabídky stále
dokonalejších a na obsluhu méně náročných
přístrojů se značně zrychlil a proroctví o poklesu
nákladů a časové náročnosti na vyšetření
jednoho lidského genomu nabývá stále
reálnější podobu. Tomu, že náklady v  roce
2013 klesnou pod 1000 USD, začínáme věřit
jako víceméně jisté vyhlídce. Již pro stroje
nabízené dnes se uvádějí provozní náklady
pro stanovení celé sekvence lidského genomu
na asi 5000 USD. Ostatně pro rutinní
analýzu postačující pro lékařské využití nebude
nejspíš potřeba analyzovat celý lidský
genom (už nyní se často omezujeme na transkribovanou
část (exom), která představuje
přibližně jen jedno procento velikosti genomu).
Dokonce se budeme moci omezit na
vybrané oblasti, důležité pro stanovení určitých
diagnóz, popřípadě náchylností, tedy
sekvenovat jen vybrané amplikony.2
Záplava dat a zákon o DNA
Tyto technologie produkují ohromná množství
primárních dat, je proto třeba vyřešit
problémy s  jejich produkcí, s  jejich zpracováváním,
uchováváním, popřípadě přenášením,
především však s  jejich interpretací.
Založili jsme velké množství nejrůznějších
databází, s jejichž pomocí se tímto směrem
můžeme ubírat, zatím však je právě tato část
využití výsledků sekvenace nových generací
tou nejobtížnější a nejnáročnější.
Jestliže skutečně dospějeme k  rutinnímu
používání celogenomové, exomové nebo jinak
cílené sekvenace, bude nezbytné najít
i  použitelnou archivaci těchto nálezů, která
podle potřeby umožní uložená data vyhledat
a manipulovat s nimi. Snad do doby,
než se tento výhled stane reálným, budeme
mít i patřičně progresivní zákon o DNA,
protože půjde o  data nejen velice citlivá,
ale hlavně cenná z  nejrůznějších hledisek
– zdravotních, sociálních, obchodních, ale
i  vojenských. Rutinní používání pro medicínské
účely ovšem předpokládá, že se ještě
mnohem lépe vyznáme v  mezigenových
vztazích a  jejich ovládání fenotypu. I  zde
budeme stále více závislí na počítačích, které
nám budou nabízet v  úvahu připadající
závěry seřazené podle pravděpodobnostního
měřítka. Sama přesná a  správná znalost
našeho genomu nebude k rozhodování
stačit, dokud nám bude chybět povědomí
o  všech vnějších vlivech, které se na jeho
formování podílely, podílejí a  budou podílet.
Budoucí vlivy lze sice jen odhadovat, ale
v mnoha směrech se můžeme pokusit o jistou
předpověď – známe-li minulost, máme-li
dostatek zkušeností a  především odpovědnosti.
Ukazuje se, že i sám genom nám
jistou míru předpovědi nabízí. Měli bychom
však být ukáznění a této skutečnosti nezneužívat,
nýbrž úzkostlivě dbát na etiku lékařského
povolání. Bohužel poněkud zaostáváme
i  z  hlediska zvyšování povědomí
o významu a možnostech genetiky u laické
veřejnosti, ačkoliv téměř v každé detektivce
se o vyšetření lidské DNA mluví.
Opovážíme-li se shrnout metodické a technologické
pokroky v oblasti molekulárně-genetických
analýz, pak můžeme vyzdvihnout
dva zcela jednoduché principy – opakování
téže reakce do „nekonečna“, tedy vynález
řetězové polymerázové reakce (Vesmír 77,
444, 1998/8) a  souběžné provádění značného
počtu reakcí, což jsou čipové technologie
(Vesmír 77, 447, 1998/8).	 Ö
2. To ostatně můžeme již dnes. Metoda RainDance Droplet Technology (RDT), zacílená na nejrůznější místa genomu,
je schopna namnožit vybrané úseky pomocí až 20 000 párů priorů. Pomocí takto obohacené templátové DNA dokáže
stanovit sekvence až 100 000 vybraných úseků v celkovém rozsahu do 24 Mb.
Digitální fotoaparát Olympus VR-310 získali:
MUDr. Michal Malina (Praha 5), MUDr. Eva Šrámková (Náchod),
Zuzana Kosová (Jihlava).
Knihu z nakladatelství Paseka, nebo nakladatelství
Jota obdrží: Tereza Přibylová (Teplice), MUDr.
Vladimír Doležal (Praha 10), Adéla Novotná (Předměřice nad
Jizerou), Norbert Herrman (Praha 5), Biskupství Brněnské (Brno),
Ing. Jaroslav Trmal (Sušice), PhDr. Ladislav Hejdánek (Písek),
Kazi Svobodová (Praha), Milan Krsek (Luby u Chebu),
Ing. Ladislav Jezdinský (Přelouč), Ivo Prokop (Borovany), Milena
Boháčková (Libčice nad Vltavou), Vratislav Svoboda (Mníšek
pod Brdy), Tereza Holešovská (Hostivice), PaeDr. Melanie
Rojková (Havířov – Suchá), Veronika Rotová (Praha 2), Gymnázium,
Botičská 1 (Praha 2), Zelený kruh (Praha 2), Ing. arch.
Pavel Příhoda (Praha 2), Prof. Jaroslav Kulda (Praha 2), Petr
Svoboda (Praha 4), Ing. Václav Srb (Středokluky), Tomáš Mikolášek
(Vrané nad Vltavou), Městská knihovna Náchod, o.p.s.
(Náchod), Gymnázium (České Budějovice), Ing. Josef Klíma
(Brno – Líšeň), MUDr. Martin Nácovský (Varnsdorf), Aleš Maroušek
(Nový Bor), Petr Rolenec (Tanvald), Cyrilometodějské
gymnázium a MŠ v Prostějově (Prostějov), Eva Šanderová (Praha
8), Ing. Tomáš Prokop (Pardubice), Dr. Detlef Schroder (Neratovice),
RNDr. Karol Berta (Lučenec), Doc. Josef Rovenský
(Piešťany), Branislav Matoušek (Trnava).
Všem výhercům gratulujeme.
Výherci vánočního losování