http://www.vesmir.cz | Vesmír 89, říjen 2010 617
Eukaryotická buňka je poněkud komplikovaná.
Její útroby protínají lipidické membrány
vytvářející škálu trubic a váčků, které se
různě spojují a oddělují. Říkáme jim organely
a  odehrávají se v  nich specializované
pochody – kupříkladu v jádře dochází k přepisu
DNA do RNA nebo v Golgiho komplexu
k syntéze nových lipidů.
Důvodů této kompartmentace může být řada:
l metabolické dráhy koncentrované do malého
prostoru jsou výkonnější, neboť enzymy
si mohou rychleji předávat substrát;
l  na různých místech mohou probíhat částečně
protichůdné reakce, aniž by se enzymy
nadarmo trápily v jalovém cyklu;
l prostorové oddělení procesů udržuje časovou
posloupnost některých dějů, a  tak se
RNA nejdříve v jádře sestříhne a pak teprve
v cytoplasmě přeloží do proteinu.
Většina membránových útvarů v  buňce
pochází z endomembránového systému, který
počíná jadernou membránou, obepíná
endoplazmatické retikulum a  postupně se
diferencuje do všech možných váčků sekrečního
systému buňky.
Každá eukaryotická buňka má také mitochondrii
(viz rovněž Vesmír 75, 553, 1996/10;
86, 179, 2007/3). Ta může tvořit obrovskou retikulární
síť (obr. 1) roztaženou a propletenou po
celé buňce (tak ji známe třeba z našich buněk),
anebo vytváří miniaturní váčky, které nacházíme
u některých jednobuněčných anaerobních
organismů a  které snadno přehlédneme i  na
elektronovém mikroskopu. Mitochondrie je
vždy vymezena dvojitou membránou, která se
dělí nezávisle na okolních organelách. Uvnitř
se kromě proteinů nachází také DNA, která
tvoří malý mitochondriální genom a exprimuje
se do několika málo proteinů a molekul
RNA (mitochondrie našich buněk mají celkem
37 genů, 13 z nich kóduje proteiny).
Původ mitochondrie
Asi před dvěma miliardami let se spojily osudy
dvou buněk. Vznikl endosymbiotický
vztah, který trvá dodnes. Během milionů let
se host svému hostiteli podvolil, z větší části
obětoval svou nezávislost a stal se pouhou
organelou. Zatím neznáme podobu hostitelské
buňky, avšak nedávné objevy vystopovaly
příbuznost pohlceného endosymbionta
s  dosud živými alfaproteobakteriemi, které
ne náhodou sdružují celou řadu nitrobuněčných
bakterií (např. Rickettsia).
Alfaproteobakterie jsou stejně jako mitochondrie
ohraničeny dvěma membránami.
Mi­tochondrie s nimi navíc spojuje sekvenční
podobnost genů kódovaných mitochondriál­
Pavel
Doležal
Jak dostat protein přes membránu
Mitochondriální evoluce
molekulární
biologie
Pavel Doležal, Ph.D. (*1975) pracuje na katedře Parazitologie PřF
UK. Ve sklepní laboratoři ve Viničné 7 se svou skupinou zkoumá
mechanismy transportu proteinů přes mitochondriální a  bakteriální
membrány. Tato výzkumná orientace je kombinací jeho vzdělání
na University of Melbourne a Přírodovědecké fakulty UK, kde
má studium mitochondriální evoluce velmi silné zázemí. (pavel-
dolezal@yahoo.com)
1. Morfologie
mitochondrií. Přestože
všechny mitochondrie
jsou potomky jedné
endosymbiotické
bakterie, v průběhu
evoluce se organela
dramaticky adaptovala
podle potřeb
organismu. Zatímco
metazoa přeměnila
mitochondrii
na dynamickou
retikulární síť (A),
některá anaerobní
jednobuněčná
eukaryota dnes
využívají služeb
jednoduchých,
avšak stále
dvoumembránových
váčků (B), které
dokonce ztratily
i poslední zbytky
mitochondriálního
genomu.
A) HeLa buňky
s mitochondriální sítí
obarvenou červeně
pomocí fluorescenční
sondy Mito Tracker
Red, která se
specificky hromadí
v místech s velkým
membránovým
potenciálem.
B) Mitozomy (zeleně)
– minimalistické
mitochondrie v buňce
Giardia intestinalis,
jednobuněčného
eukaryotického
střevního parazita
obratlovců včetně
člověka. Mitozomy
byly detekovány
pomocí specifické
protilátky proti
mitochondriálnímu
proteinu IscU. Modře
jsou obarvena dvě
jádra jedné buňky
G. intestinalis.
A B
618 Vesmír 89, říjen 2010 | http://www.vesmir.cz
ní DNA, ale i genů pro některé mitochondriální
proteiny, které jsou kódovány v jaderné
DNA. Roli korunního svědka v případu
původu mitochondrie sehrál jednobuněčný
bičíkovec Reclinomonas americana, který
plave v  kdejaké louži. Jeho mitochondriální
genom je dosud největší, jaký známe. Má
téměř 100 genů, které jsou sekvenčně podobné
těm bakteriálním a zároveň jsou na mitochondriální
DNA seřazeny ve stejném pořadí
jako na bakteriálním chromozomu.
Kam se ale poděly stovky a  možná tisíce
genů, které si s  sebou přinesla první endosymbiotická
alfaproteobakterie? Některé
se podle všeho ztratily během přeměny endosymbionta
na organelu a  některé se přestěhovaly
do jádra hostitele. Zde jsou pod
dohledem hostitelova transkripčního aparátu,
který tak snáze kontroluje jejich expresi.
S velkým stěhováním genů do jádra však
vyvstává významný problém, který musela
eukaryotická buňka záhy vyřešit. Jak dostat
zpátky do mitochondrie potřebné proteiny,
které jsou teď kódované v jádře a překládané
na volných ribozomech v cytoplazmě?
Transport proteinů přes membrány
Obecně využívají živé organismy k transportu
proteinů (opomeneme-li membránovou fúzi)
„díry a motoru“. To znamená, že pasivní proteinový
pór v membráně spolupracuje s molekulárním
chaperonem (Vesmír 77, 15, 1998/1), který
opakovanou vazbou na přenášený substrát
pohání celý transport. K tomu, aby byl protein
nasměrován ke správné membráně, vyvinuly
živé organismy systém molekulárních adres.
Jsou to proteinové sekvence s určitým pořadím
aminokyselin, jež jsou součástí přenášených
proteinů. Rozpoznávají je specifické receptory
zakotvené v sousedství póru. Protože jsou
póry příliš úzké, putují proteiny přes membrány
jako rozložené polypeptidy, a  tak mohou
být jejich adresy snadno rozpoznány.
Přenášet proteiny přes membrány dokážou
i všechna prokaryota (obr. 2). Sekretují do okolního
prostředí nebo zabudovávají do své vnější
membrány nejrůznější efektorové molekuly.
Nejdůležitějším kanálem ve vnitřní bakteriální
membráně je SecY translokáza, která v trochu
pozměněné podobě pracuje na plné obrátky
také v  membráně našeho endoplazmatického
retikula (protein Sec61). Další bakteriální
translokáza YidC pomáhá SecY při vkládání
komplikovaných proteinů do vnitřní membrány.
Snad nejzáhadnější je zatím translokáza
TAT, která je schopná, byť pomalu, přenášet
přes membránu již sbalené proteiny a  proteinové
komplexy. Způsob transportu systémem
TAT je dosud nejasný, ale stojí v popředí zájmu
biotechnologických oborů, neboť by umožnil
obejít obtížné postupy pro izolaci rekombinantních
proteinových komplexů.
Cesta tam a zase zpátky
Všechny tyto tři translokázy byly přítomny
také v membráně první mitochondrie (obr. 2).
Ta tedy mohla vesele uvolňovat své proteiny
do cytosolu hostitele. Mohly ale také pomocí
těchto kanálů vstupovat proteiny zpět do mitochondrie?
Translokázy TAT a  YidC toho nejsou
konstrukčně schopné. Řada dílčích prací
však ukazuje možnou účast proteinu Sec61 na
exportu proteinu z endoplazmatického retikula.
Zda jedna a ta samá molekula kanálu přenáší
proteiny oběma směry, nebo jde o dvě oddělené
populace, či zda se dokonce Sec61 tohoto
procesu účastní jen jako podjednotka vlastního
kanálu, není dosud známo.
Ať už byl ale SecY schopen po určitou dobu
importu proteinů do mitochondrie nebo ne, jisté
je, že to netrvalo dlouho. Pouze jediný organismus
má stále ve svých mitochondriích gen
pro SecY. Je jím právě Reclinomonas americana,
který si kromě SecY ve svém mitochondriálním
genomu ponechal i komponenty TAT a YidC.
Studium této jedinečné mitochondrie však ukazuje
spíše na unikátní případ zpomalené mitochondriální
evoluce nežli na funkční adaptaci
translokázy. V mitochondriích tohoto prvoka
jsou zároveň přítomny komplexy TIM, TOM
a SAM, které dnes fungují u všech eukaryot
jako univerzální mitochondriální translokázy.
Jejich přítomnost u všech eukaryo­tických linií
napovídá, že byly vytvořeny záhy po vzniku
mitochondrie. Kde se ale vzaly?
Mitochondriální translokázy
Nejdříve krátce k  jejich funkci, jak ji známe
z  kvasinkových nebo savčích mitochondrií
(obr.  3). Adresové sekvence mitochondriálních
proteinů rozeznávají receptory Tom20
(rozpustné proteiny) nebo Tom70 (membránové
proteiny) na vnější mitochondriální membráně.
Receptory spolu s  dalšími proteiny
tvoří komplex TOM (translocase of the outer
membrane), který je vystavěn kolem centrálního
kanálu Tom40. Tom40 je vzdáleně příbuzný
bakteriálním porinům, které přenášejí
celou řadu metabolitů přes vnější bakteriální
membránu. Poriny i  Tom40 mají velice kompaktní
soudkovitý tvar, a  jsou proto ideální
jako nezávislé transportní jednotky. VšechAbstract:
Mitochondrial
evolution by Pavel Doležal.
Mitochondrion has played
crucial role in the evolution of the
eukaryotic cell. Some two billion
years ago this organelle, which
now produces most of the cellular
ATP and mediates programmed
cell death, used to be a free-living
gram-negative bacterion. The
early endosymbiotic relationship
was followed by the transfer of
bacterial genetic information
into the host cell nucleus and
resulted in the enslavement
of the endosymbiont. Hence
mitochondrial proteins are
translated on free cytosolic
ribosomes and transported
into the organelle. To this aim
eukaryotic cell installed new
translocases in the mitochondrial
membranes. Origin of these
multimeric complexes nicelly
illustrates mechanisms of
molecular evolution. This review
summarizes several aspects of
the mitochondrial evolution and
our current ideas on the origin of
mitochondrial translocases.
cytosol
mezimebránový prostor
matrix
SAM TOM
Oxa1 TIM22
23
TIM23TAT
SAM
Oxa1 Sec
baktérie „klasická“ mitochondrie
SAM TOM
TIM22
23
TIM23TATOxa1 Sec
mitochondrie
Reclinomas americana
vnitřní
membrána
vnitřní
membrána
2. Z bakterie je organela.
Změna směru transportu
proteinů přes mitochondriální
membránu si vyžádala
inventuru membránových
translokáz. Uprostřed je
schematicky znázorněna
mitochondrie Reclinomonas
americana, která má jak
prokaryotické, tak eukaryotické
rysy. Šipky znázorňují směr
(a velikost) transportu proteinů.
ny mitochondriální proteiny, ať už směřují
do mitochondriální matrix nebo do vnější
membrány, musejí projít skrze Tom40. Poté si
je rozeberou importní dráhy specificky vyladěné
na jednotlivé mitochondriální subkompartmenty.
Jakmile hydrofobní proteiny vnější
a  vnitřní membrány vstoupí do vodného
prostředí mezimembránového prostoru mitochondrie,
riskují, že skončí jako proteinové
sraženiny. Proto je záhy obalí malé Tim proteiny
a drží se jich až do kontaktu s membránou.
Proteiny vnitřní membrány rozeznává komplex
TIM22 (translocase of the inner membrane),
zatímco rozpustné proteiny mitochondriální
matrix odlišný komplex TIM23. Import
proteinů do vnitřní membrány vyžaduje přítomnost
mebránového potenciálu, který vzniká
během dýchání mitochondrie. Proteiny
mitochondriální matrix navíc potřebují ATP,
aby mohl pracovat chaperon Hsp70, který proteiny
vtahuje dovnitř. Tento volně rozpustný
protein musí být v  blízkosti translokačního
kanálu. To zajišťuje skupina proteinů vytvářejících
PAM (presequence translocase associated
motor), jehož úkolem je zakotvit Hsp70
k membráně a stimulovat jeho aktivitu.
Protože ani jeden z  těchto komplexů se
u  bakterií nevyskytuje, mělo se dlouhou
dobu za to, že nám opět chybí „evoluční článek“.
V  posledních několika letech se však
ukázalo, že pro řadu podjednotek importních
komplexů můžeme nalézt alespoň částečné
bakteriální homology (obr. 3).
Některé bakteriální proteiny se během
mitochondriální evoluce dostaly do nových
komplexů (např. bakteriální komplex BAM
se změnil na mitochondriální SAM), jiné prošly
„molekulárním roubováním“, kdy se jejich
funkční domény pospojovaly s jinými doménami
a  vytvořily proteiny zcela nové (např.
bakteriální TimB byl pozměněn na mitochondriální
Pam18). Výsledkem jsou naprosto unikátní
membránové komplexy, které pracují
jako izolované funkční moduly.
Srovnávací evoluční studie ukazují, že klíčové
složky komplexů SAM, TOM, TIM
a PAM jsou společné pro všechny skupiny
eukaryotických organismů. Ty si ale nezávisle
vytvořily řadu dalších podjednotek, které
umožnily „vyladění“ mitochondriálního
importu pro své specifické proteiny.
Přestože import proteinů do mitochondrií
patří mezi nejlépe prostudované transportní
systémy, dosud neznáme mechanismus importu
pro řadu funkčně nesmírně důležitých proteinů.
Mezi ně patří zejména regulátory programované
buněčné smrti ze skupiny Bcl-2,
které se na daný podnět doslova zapichují
do vnější mitochondriální membrány. Navíc
existují pozorování vezikulárního transportu
mezi mitochondriemi a dalšími organelami.
Ale o tom až někdy příště.	 Ö
44
50
40
TOM
smallTIMs
7
Oxa1
TIM22
23
21
TIM23
16
23 17
PAMHsp70
22Oxa1
SAM
18
65
20
70
7 Mdm10372222 Mim1 35
50 54
18
12
40
TOM
Saccharomyces Giardia
Cpn60
Cpn10
40
MPP
MIP
IMP
1
2
PAM
16
Hsp70
18
Cpn60
Cpn10
MPP
A B
3. Evoluce importu proteinů do mitochondrie. A. Znázorněny jsou podjednotky
jednotlivých komplexů vnější a vnitřní mitochondriální membrány, tak jak byly
popsány zejména v buňkách Saccharomyces cerevisiae. Žluté hvězdičky ukazují
na proteiny, které mají sekvenční homology v prokaryotické říši. Některé z nich
se účastní zcela jiných buněčných procesů a byly „poupraveny“ pro jinou funkci.
B. Pro srovnání jsou znázorněny podjednotky importních drah u G. intestinalis,
jejíž mitozomy představují v současnosti jedny z nejprimitivnějších mitochondrií.
Současný stav této organely odráží dlouhou nezávislou evoluci eukaryotické linie,
kam G. intestinalis patří, i její adaptaci na parazitický život bez kyslíku.
inzerce