Úvod k druhému praktiku Mikrobiologie a imunologie – RV2BP_MIKR Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Kostka Nepřímá diagnostika a antibiotika Modul A Nepřímý průkaz Antigen a protilátka lAntigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. (Anebo sice z organismu vlastního, ale v tom případě jde o přestárlé či vadné, popř. zvrhlé buňky.) lV mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď lProtilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele (člověka, ale také zvířete) jako odpověď na antigenní výzvu Metody lékařské mikrobiologie lPřímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Příklady: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. lNepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky) Dva způsoby, jak využít interakci mezi antigenem a protilátkou: Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Interpretace lPrůkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta lPrůkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: –Množství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru – viz A1) –Třída protilátek: IgM či IgA/IgG (více v A2) –(Avidita protilátek) Jak interpretovat nepřímý průkaz lAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG lPacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) lChronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. IgM a IgG 1 1 2 2 Třeba i po letech Jak provést reakci „kvantitativně“ lJe velmi těžké zjistit koncentraci protilátek proti konkrétnímu antigenu (ne tedy celkové množství imunoglobulinů) v.jednotkách mol/l, mg/l apod. lAle dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum. –Reaguje-li i po mnohonásobném ředění à à v séru je velké množství protilátky –Reaguje jen při nevelkém zředění séra à à v séru je jen malé množství protilátky Dynamika titru lPrůšvih je, že každý má jinou úroveň protilátkové odpovědi. Proto samotná hodnota titru mnoho neříká lZměna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. IgM a IgG 1- akutní sérum 1 2 - rekonvalescentní 2 Proč nestačí samotný titr lNěkdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v akutní fázi titr dosti nízký C:\Uživatel\Ondra\Pracovní věci\Výuka\Výukové materiály\Medici\Obrázky\Dva pacienti.GIF nVelmi reaktivní pacient naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký Čtyřnásobný vzestup titru lAbychom mohli říci „tento pacient je pravděpodobně NYNÍ nemocný“ (= nejde o případ, kdy by šlo o stav o dávno prodělané infekci), zpravidla vyžadujeme nejméně čtyřnásobný vzestup titru mezi prvním a druhým odběrem krve (tedy za 10–14 dnů) lPři geometrické řadě s koeficientem dva jde o posun o dva důlky. Dynamika titru – další aspekty lZvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ lV některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce). I ten by měl být nejméně čtyřnásobný. lVelikost titru rozhodně neodpovídá vývoji klinických příznaků. Množství protilátek často vrcholí, až příznaky zmizí. Příklady různých projevů dynamiky titru l1 – 2: sérokonverze l3 – 4: vzestup titru l5 – 6: pokles titru C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Dynamika titru.bmp Geometrická řada lTechnicky nejjednodušší způsob, jak ředit sérum pacienta, je použití geometrické řady s koeficientem dva. lVycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém předředění (např. 1 : 5, 1.:.10, 1 : 20 a podobně) lV každém dalším důlku je dvojnásobné ředění oproti předchozímu, například tedy řada 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160… Počítání ředění v serologii lPozor, v serologii např. ředění 1 : 4 znamená jeden díl séra a tři díly fyziologického roztoku (tj. čtyři díly celkem)! lPři „biochemickém“ počítání (počet dílů séra ku počtu dílů diluentu) bychom naše geometrické řady museli značit např. 1 : 9, 1 : 19, 1 : 39, 1 : 79. To by bylo značně nepraktické Geometrická řada: jak ji udělat a) bez předředění původního séra C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada.bmp b) s předředěním původního séra lSamozřejmě, předředění nemusí být zrovna 1 : 100, může to být třeba 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 či jakékoli jiné. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Geometrická řada 2.bmp Úkol A1: Klinická situace lMáme šest pacientů podezřením na klíšťovou encefalitidu, všichni mají neurologické potíže a udávají přisátí klíštěte lKlíšťová encefalitida je nemoc poměrně běžná ve střední Evropě. Ačkoli má horší průběh u dospělých (zejména seniorů), lidé pohříchu nechávají očkovat spíše své děti než své rodiče. A1: Klíšťová encefalitida lDestičku si postavte na výšku tak, abyste měli písmeno A vpravo nahoře a číslo 12 vpravo dole. –V prvním a druhém řádku je první pacient (Karel) –ve 3. a 4. řádku druhá pacientka (Ludmila) –v 5. a 6. řádku třetí pacient (Marek) –a tak dále lPrvní z obou řádků vždy odpovídá akutnímu, vzorku séra, druhý vzorku odebranému za dva týdny lV prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 10 lJde o to, zjistit titry a zhodnotit jejich vývoj v čase Příklad odečítání výsledku Bez názvu Průběh protilátkové odpovědi lProtilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce lProtilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou IgM a IgG (novorozenec je tedy může mít od matky) Protilátky ostatních tříd lProtilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) lProtilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi lS protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Reakce se značenými složkami lNa povrch se postupně navazují jednotlivé složky lMísto jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje lJe-li to pravda, složka se naváže lPokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec lNa konci řetězce je vhodné značidlo (u reakce ELISA např. enzym, který se detekuje reakcí s vhodným substrátem) Možnosti uspořádání složek žlutě vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta lPovrch-antigen-protilátka-značidlo (P) lPovrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) lPovrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) lPovrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) lKonjugát je značená protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu lKonjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) lJe to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG lDokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky lPoužití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek ELISA C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\02 pathscan_elisa.jpg www.cellsignal.com C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\04 ELISA.jpg virology-online.com ELISA – praktické provedení lZpravidla máme k dispozici destičku s jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry lPřed vlastními důlky pacientů mohou být důlky: –Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) –K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola –Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) lVždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v.destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta. ELISA – ukázka (www.medmicro.info) ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! A2: popis pacientů lP: zdravá těhotná žena, doma kočky lQ: jiná těhotná žena, bez koček lR: mladá dáma toulající se v lesích; bez koček, zato však v kontaktu s prostředím kontaminovaným trusem divokých zvířat lS: senior, pracující v zahradě, po které se procházejí kočky Schéma naší ELISy v úkolu A2 BL R BL R K- S K- S CO x CO x CO x CO x K+ x K+ x x x x x P x P x Q x Q x x = další pacienti, kteří nás nezajímají IgA IgG Modul B: Antibiotika Metody zjišťování citlivosti in vitro lZjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři lNezaručí stoprocentní účinnost léčby lPřesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií lV běžných případech kvalitativní testy (citlivý – rezistentní) lV indikovaných případech kvantitativní (zjišťujeme MIC). Jde zpravidla o rizikové kmeny u rizikových pacientů. Difúzní diskový test (B1) lNa MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie lPak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem lAtb difunduje z disku agarem dál lU standardní Petriho misky se používá zpravidla šest disků, někdy se dává ještě sedmý doprostřed Difúzní diskový test – pokračování lKoncentrace atb klesá se vzdáleností od disku (a tedy i jeho schopnost inhibovat) lPokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) lJe-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difusní diskový test po lopatě Antibiotika n1 Bakterie se bojí antibiotika. Velká zóna – někdy dokonce tak velká, že se ani nedá změřit. n2 Bakterie se nebojí antibiotika, jsou na ně rezistentní. Malá, anebo vůbec žádná zóna kolem atb disku. REZISTENTNÍ CITLIVÝ Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními atbpsae21 www.medmicro.info Někdy jsou příliš velké zóny negoca Jsou-li zóny tak velké, že se nedají změřit, tak je neměřte a prostě rovnou napište, že kmen je na dané antibiotikum citlivý. Zeleně jsou vyznačeny teoretické okraje zón – všimněte si, že z.naprosté většiny buď splývají, nebo jsou mimo misku Foto O. Z. Mikrodiluční test (B2) lAtb je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá lNejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC lV přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní lJedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test – ukázka C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Antibiotické testování\P3160025u.JPG Foto O. Z. Mikrodiluční test – odečítání lVe sloupcích 1, 3, 4 a 5 je hodnota MIC příliš vysoká než aby mohla být změřena. C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Antibiotické testování\P3160025ux.JPG Odečtení mikrodilučního testu lZjistěte a zapište hodnoty MIC pro dvanáct testovaných antibiotik lZakalený důlek = roste to tam lNezakalený důlek = neroste to tam lNeroste to tam = je to inhibováno lNejmenší koncentrace, která inhibuje je minimální inhibiční koncentrace lMIC £ breakpoint à kmen citlivý lMIC > breakpoint à kmen rezistentní Příklad odečítání lE: MIC >32, breakpoint =16, závěr: rezistentní lF: MIC = 32, breakpoint = 16, závěr: rezistentní lG: MIC = 8, breakpoint = 32 závěr: citlivý lH: MIC £ 0,5 breakpoint = 8, závěr: citlivý C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Antibiotické testování\P3160025ux.JPG E F G H E F G H 32 64 128 64 >16< 32 64 32 8 >16< >32< 16 4 8 16 >8< 2 4 8 4 1 2 4 2 0,5 1 2 1 0,25 0,5 1 0,5 E-testy (B3) lPodobné v principu difúznímu diskovému testu lMísto disku se však použije proužek lV proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (získáno díky speciální technologii – proto jsou tak drahé) lZóna není kruhová, ale vejčitá. lTest je kvantitativní lNa papírku je stupnice – jednoduché odečítání (viz obrázek na další obrazovce) E-testy – vyhodnocení lHodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek etest etest www.uniklinik-ulm.de Někde používají speciální velké misky C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Antibiotické testování\01 caso01_4.jpg www.unifesp.b C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Fotoatlas\Klinická mikrobiologie\Klin1.jpg Přeji Vám hezký zbytek dne… Foto O. Z.