ANALYTICKÁ CHEMIE
Mgr. Jana Horská, Ph.D.
Katedra fyziky, chemie a odborného vzdělávání
Pedagogická fakulta MU
Poříčí 7
603 00 Brno
3. část
Instrumentální metody analytické chemie
Separační (dělící) metody
Separační (dělící) metody.2
Úvod do analytických separačním metod
̶ První krok zpracování ropy – separace na
jednotlivé frakce podle teploty varu
(rektifikační věže)
̶ složky s nejnižší teplotou varu odpařeny
jako první
̶ regulace teploty kotle a kolony – řízen
rozsah teploty varu kondenzující frakce
Separační (dělící) metody.3
Základní pojmy
̶ Jen velmi málo měřících technik používaných v analýze je specifických pro jednu chemickou
látku.
Interferent (interference)
̶ Jak odstranit interference?
̶ separace
̶ úprava matrice vzorku
̶ ředění
̶ fáze = homogenní část heterogenního systému oddělená od okolí ostrým fázovým rozhraním
(mobilní a stacionární fáze)
̶ separace (dělení) = proces oddělování jednotlivých složek nějaké směsi za účelem získání
čistých složek (většinou založeny na rozdílné distribuci dělených látek mezi dvě
různé nemísitelné fáze)
Separační (dělící) metody.4
Základní principy separace
Separační (dělící) metody.5
separace x směšování
Základní pojmy
̶ separace analytické – cílem je stanovení látek ze směsi
preparativní – cílem je získat (izolovat) čistou látku ve velkém množství
jako produkt
podmínky oddělení dvou látek:
a) v bodu varu
b) v rozpustnosti
c) v rozdělovací konstantě
d) v disociační konstantě
e) v iontové pohyblivosti
f) ve velikosti a hmotnosti molekul
Separační (dělící) metody.6
Základní pojmy
̶ Jiná možnost rozdělení dělících metod:
̶ podle toho, zda k dělení dochází uvnitř jedné fáze (např. dialýza, elektroforéza),
nebo mezi dvěma fázemi (např. chromatografie, krystalizace, destilace)
̶ https://www.youtube.com/watch?v=l7wJNRZpDT4
̶ Požadavky na dělící metodu:
̶ 1. dostatečná čistota
̶ 2. dostatečná šetrnost vůči požadované látce
̶ Podle těchto hledisek posuzujeme účinnost příslušné dělící metody.
Separační (dělící) metody.7
schéma semipermeabilní membrány
Chromatografické separace
̶ chromatografie = technika, při které jsou složky směsi separovány na základě rozdílné
rychlosti, s jako jsou unášeny zafixovanou (stacionární, nehybná) fází kolem plynné nebo
kapalné mobilní (pohyblivé) fáze
̶ využítí: a) separace
b) identifikace
c) stanovení
̶ molekuly složek (S1 , S2 , S3….) dělené směsi vnikají do obou fází, ale setrvávají v nich různě
dlouhou dobu. Molekuly složky S1, trávící více času v pohybující se mobilní fázi, jsou více
strhávány, než molekuly složky S2 , setrvávající déle ve fázi stacionární
̶ postupně se proto tyto látky (složky) od sebe oddělí
Separační (dělící) metody.8
Klasifikace chromatografických metod
Separační (dělící) metody.9
Klasifikace chromatografických metod
̶ Klasifikace podle uspořádaní:
̶ plošná chromatografie
̶ papírová (PC, paper chromatography))
̶ tenkovrstevná (TLC, thin layer chromatography)
̶ sloupcová chromatografie :
̶ kapalinová (LCC, Liquid-liquid chromatography )
̶ vysoce účinná, vysokotlaká (HPLC, high performance liquid chromatography)
Separační (dělící) metody.10
Klasifikace chromatografických metod
̶ Základní rozdělení podle separačního principu (mechanismu):
̶ adsorpční chromatografie
̶ rozdělovací (partiční) chromatografie
̶ iontová výměna
̶ Rozdělení chromatografie podle skupenství fází:
̶ kapalinová chromatografie (LC, liquid chromatography)
̶ plynová chromatografie (GC, gas chromatography)
Separační (dělící) metody.11
⃰ TLC chromatografie existuje jako rozdělovací (stacionární fází je kapalina zakotvená na pevné látce)
i jako adsorpční (stacionární fází je přímo tuhá látka) chromatografie
Separační (dělící) metody.12
Pojmy v kolonové chromatografii
̶ eluce (z lat. eluere = vymývat) = proces, při kterém jsou složky vzorku unášeny mobilní fází
vrstvou stacionární fáze
̶ eluát = mobilní fáze, která opouští kolonu
̶ eluent = rozpouštědlo, plyn nebo superkritická tekutina, která unáší složky vzorku stacionární
fází
Separační (dělící) metody.13 chromatografický sloupec
Separační (dělící) metody.14
Chromatogram
̶ závislost veličiny, která je funkcí koncentrace analytu, vynesené proti elučnímu času nebo
elučnímu objemy
̶ kvalitativní údaj = pozice maxima píku na časové ose
̶ kvantitativní údaj = plocha píku
Separační (dělící) metody.15
Efektivita separace
̶ rychlost separace
a rychlost rozšiřování zón
a) původní chromatogram
s překrývajícími se píky;
b) zlepšení způsobené větším
oddělením zón;
c) zlepšení způsobené zúžením
zón
Separační (dělící) metody.16
Rychlost pohybu látek kolonou
̶ Amobilní Astacionární
̶ distribuční konstanta K
̶ K = (aA)S/(aA)M
̶ K = cS/cM
̶ rerenční čas tR (angl. retention time), retenční objem
= čas, který uběhne od nástřiku vzorku do průchodu zóny analytu detektorem umístěným za
chromatografickou kolonou
̶ mrtvý čas tM (angl. dead time nebo void time)
= čas, který potřebuje látka nezadržovaná na stacionární fázi k průchodu chromatografickou
kolonou (všechny složky vzorku stráví v mobilní fázi takto dlouho dobu)
tR = tS + tM
Separační (dělící) metody.17
Rychlost pohybu látek kolonou
Separační (dělící) metody.18
Rychlost pohybu látek kolonou
̶ průměrná lineární rychlost pohybu látky v koloně
̶ v =
L
tR
̶ průměrná lineární rychlost molekul mobilní fáze
̶ u =
L
tM
Separační (dělící) metody.19
Rychlost pohybu látek kolonou
̶ retenční faktor kA
̶ = čas, který analyt stráví ve stacionární fázi, v poměru k času, který stráví v mobilní fázi
kA =
tR −tM
tM
=
tS
tM
(ideální případ kA = mezi hodnotami 1 a 5)
̶ separační faktor α
̶ = poměr distribučních konstant silněji zadržovaného analytu (B) a slaběji zadržovaného
analytu (A)
α = KB/KA
α =
tR,B − tM
tR,A − tM
Separační (dělící) metody.20
Rozmývání zón a účinnost kolony
̶ rychlostní teorie chromatografie
̶ popisuje tvary a šířky elučních zón
kvantitativním způsobem na základě
mechanismu náhodného pohybu molekul
v koloně
̶ pík rozmytý vpředu (angl. fronting peaks)
̶ pík rozmytý vzadu (angl. tailing peaks)
Separační (dělící) metody.21
Popis chromatografického píku
w
w
H – výška píku
W – šířka píku v základně
W1/2 – šířka píku v polovině
jeho výšky
tR – retenční čas (kvalitativní
charakteristika: závisí na druhu látky)
t´R – redukovaný retenční čas
tM – mrtvý retenční čas
plocha píku (kvantitativní údaj: závisí
na množství látky)
Separační (dělící) metody.22
Rozlišení
= Rs – parametr charakterizující míru oddělení dvou píku (složky 1 a 2)
kvantitativní měřítko grafické vyjádření rozlišení
w w
w ...šířka píku u základní linie
(angl. base line)
Separační (dělící) metody.23
Ukázka separací se třemi rozdílnými hodnotami rozlišení
dosažení požadovaného rozlišení
RS = 1 dostatečné
RS= 1,5 téměř dokonalé
RS > 2 nadbytečné
Separační (dělící) metody.24
Vliv složení mobilní fáze na výsledný chromatogram
analyty:
(1) 9,10-anthrachinon,
(2) 2-methyl-9,10-anthrachinon,
(3) 2-ethyl-9,10-anthrachinon,
(4) 1,4-dimethyl-9,10-anthrachinon,
(5) 5-terc-butyl-9,10-anthrachinon
Separační (dělící) metody.25
Plynová chromatografie (GC, gas chromatography)
̶ složky vzorku separovány na základě své distribuce mezi plynnou mobilní a kapalnou nebo
pevnou stacionární fází
̶ eluce zprostředkována tokem inertní plynné mobilní fáze kolonou
̶ 2 typy: rozdělovací – látky jsou separovány podle různého rozdělovacího koeficientu
(stacionární fází je zde kapalina, která je ukotvena na pevném
nosiči)
adsorpční – k separaci dochází na základě různé adsorpce látky z mobilní
fáze k povrchu stacionární fáze (adsorbentu)
(stacionární fázi tvoří silikagel, celulóza, aktivní uhlí nebo oxid
hořečnatý či hlinitý)
Separační (dělící) metody.26
Instrumentace GC
̶ zdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu
průtoku nosného plynu systémem
(He, Ar, N2, H2 - dle typu kolony a detektoru)
̶ dávkovač pro nanesení analytu na kolonu
(alikvot vzorku v µl) – přes tzv. septum
̶ chromatografická kolona pro separaci analytů
̶ termostat (pec) pro regulaci teploty kolony
̶ on-line detektor pro detekci separovaných analytů vycházejících z kolony
̶ PC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat
Separační (dělící) metody.27
Kolony v GC
Náplňové kolony – starší typ, málo používané
(vnitřní průměr řádově mm)
Kapilární kolony – kapiláry z křemenného skla
(vnitřní průměr 0,1 - 0,5 mm, délka 10 - 150 m)
– na povrchu potaženy polyimidem
angl. packed columns
angl. capillary columns
kapilární kolony z taveného křemene – nejpoužívanější
(angl. fused-silica open tubular columns)
Separační (dělící) metody.28
Náplně kolon v GC
mikrofotografie rozsivky, SEM
pevné nosiče – udržují kapalnou stacionární fázi na místě (jeho částice mají jednotnou velikost
a jsou pokryty tenkou vrstvou stacionární fáze)
– první a nejvíce používané připraveny z přírodní křemeliny
schránky tisíce druhů jednobuněčných rostlin,
které obývaly pravěká jezera a moře
tyto nosiče často chemicky zpracovány
dimethylchlorsilanem (DMCS)
Separační (dělící) metody.29
Náplně kapilárních kolon v GC
WCOT
- tenký film na vnitřní straně membrány
SCOT
- vrstva nosiče se zakotvenou kapalinou
PLOT
- tenká vrstva adsorbentu
Separační (dělící) metody.30
Dávkování
̶ kalibrované mikrostříkačky
̶ dělič vzorku (angl. sample splliter)
̶ autosamplery = autoinjektory
(moderní plynové chromatografy)
mikrostříkačky Hamilton
autosampler
Separační (dělící) metody.31
GC detektory
plamenově ionizační detektor (angl. flame ionization
detector, FID)
selektivní, destruktivní, velmi citlivý, pro uhlovodíky
efluent z kolony smísen s H2 a vzduchem → analyty
spáleny v plameni – v plameni dochází k
ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plamene
tepelně vodivostní detektor (angl. thermal conductivity
detector, TCD)
univerzální, nedestruktivní,
středně citlivý
všechny látky lišící se tepelnou
vodivostí od nosného plynu
Separační (dělící) metody.32
GC detektory
detektor elektronového záchytu
(angl. electron capture detector, ECD)
selektivní, nedestruktivní, středně citlivý
halogenderiváty (pesticidy) a nitroderiváty
nosný plyn ionizován radioaktivním β-zářičem –
analyty s elekronegativními skupinami vychytávají
elektrony z β-zářiče (63Ni)→ snížení ionizace
fotoionizační detektor
(angl. photoionization detector, PID)
ionizace intenzivním UV zářením
– selektivní pro UV absorbující látky
Separační (dělící) metody.33
GC detektory
hmotnostně spektrometrický detektor
(angl. mass spectrometry detector, MSD)
Separační (dělící) metody.34
GC chromatogram
Separační (dělící) metody.35
GC-MS
Separační (dělící) metody.36
Použítí GC
chromatogram whisky
hodnoty odečtené z chromatogramu
dělení nejen plynů,
ale i všech těkavých látek
Stopová analýza
Identifikace látek
(retenční data)
průmyslové, biomedicínské
a forenzní laboratoře
NESMÍ DOCHÁZET
K ROZKLADU LÁTEK!
Látky netěkavé je třeba
derivatizovat!
Separační (dělící) metody.37
Použití GC-MS při identifikaci metabolitu léčiva v krvi
glutethimid
GC chromatogram extraktu krevní plazmy pacienta
OH
4-hydroxy-metabolit
glutethimidu
MS spektrum eluce píku 1 MS spektrum eluce píku 2Separační (dělící) metody.38
Kapalinová chromatografie (LC, liquid chromatography)
̶ separace založena na rozdělení látek mezi
kapalnou mobilní fázi a fázi stacionární
̶ vysokoúčinná kapalinová chromatografie
̶ (angl. high perfomance liquid chromatography, HPLC
– jako nosič použity částice malého průměru (5 µm)
̶ v klinické laboratoři nezastupitelné místo
̶ (všechny principy dělení)
Separační (dělící) metody.39
Kapalinová chromatografie – kolonové uspořádání
̶ MF: kapalina (interaguje)
̶ klasické provedení
̶ skleněná kolona
̶ délka ~ 50 cm
̶ průměr ~ 2 cm
̶ náplň
̶ zrnitý sorbent (Al2O3)
̶ MF gravitací tlačena kolonou,
složky různě sorbovány náplní
→ dělení (separace)
Separační (dělící) metody.40
Kapalinová chromatografie – kolonové uspořádání
̶ dle chemického principu dělení složek:
kapalinová chromatografie
adsorpční chromatografie
rozdělovací chromatografie
iontová chromatografie (katex, anex)
gelová chromatografie
Separační (dělící) metody.41
Separační (dělící) metody.42
Adsorpční kapalinová chromatografie
̶ Michail Semjonovič Cvět – botanik, objevitel
chromatografie (poč. 20. stol.)
̶ naplnil např. skleněnou trubičku inulinem (polysacharid)
a lil na ni chlorofylový extrakt rozpuštěný v ligroinu
(lehkém benzinu)
̶ nechal směs ve skleněné trubici stékat a shora lil další
čistý ligroin
̶ směs se rozdělila na modrozelený chlorofyl a,
žlutozelený chlorofyl b
̶ Cvět nazval proces, který objevil, chromatografie
(řecký termín znamenající „barevné psaní“).
„Objevil chromatografii, rozdělující molekuly, ale spojující lidi.“
Adsorpční kapalinová chromatografie
̶ princip
̶ přitažlivé síly mezi SF a analytem
̶ SF v pevném stavu
̶ vhodné pro: polární látky (cukry)
̶ adsorbenty
̶ velký povrch, adsorpční místa
̶ silikagel (polární kyselý)
̶ Al2O3 (polární bazický)
̶ aktivní uhlí (nepolární)
̶ mobilní fáze
̶ nepolární analyty: nepolární MF
̶ polární analyty: polární MF
Separační (dělící) metody.43
Rozdělovací kapalinová chromatografie
̶ princip
̶ rozdělení analytů mezi dvě nemísitelné kapaliny, MF unáší analyty, SF je zakotvená kapalina
̶ složka vzorku tráví více času v té fázi, ve které je rozpustnější
stacionární fáze
Separační (dělící) metody.44
Instrumentace
̶ kolona pro separaci analytů
̶ zásobníky rozpouštědel
(mobilní fáze)
̶ čerpadla pro zajištění průtoku
mobilní fáze systémem
(řádově jednotky až desítky MPa)
̶ dávkovač pro nanesení
vzorku na kolonu
̶ on-line detektor pro detekci
separovaných analytů
̶ PC pro kontrolu systému,
sběr a vyhodnocení dat
Separační (dělící) metody.45
Dávkovací zařízení
šesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkou (objem od desítek nanolitrů po mililitry)
Separační (dělící) metody.46
Kolony v HPLC
silikagely – nejrozšířenější polární sorbent
nejčastější velikost náplně 3, 5 a 10 μm
vodíkový můstek
chemicky vázané nepolární stacionární fáze
vhodné pro separaci nasycených a nenasycených
sloučenin
Separační (dělící) metody.47
Detektory v HPLC
̶ Generovaný elektronický signál zaznamenán ve formě chromatogramu
̶ Fotometry a spektrofotometry
̶ Měření absorbance UV a VIS záření
̶ Detektory s fixní nebo variabilní vlnovou délkou
̶ Detektory diodového pole (PDA)
(schopné měřit v celé oblasti λ)
̶ Fluorometry – pro detekci fluorescenčních látek
Separační (dělící) metody.48
Detektory v HPLC
̶ elektrochemické detektory
̶ amperometrické detektory
̶ elektroaktivní analyt v průtokové cele oxidován nebo redukován na povrchu elektrody s
konstantním potenciálem – zaznamenám vzniklý elektrický proud
(př. analýza katecholaminů v moči)
̶ coulometrické detektory
̶ oxidace nebo redukce analytu – měření elektrického náboje
(př. stanovení metanefrinů, vanilmandlové kyseliny, homovanilové kyseliny nebo
5-hydroxy-indoloctové kyseliny v moči)
̶ refraktometrický detektor
̶ měří změny indexu lomu eluátu v závislosti na koncentraci analytu
Separační (dělící) metody.49
Vývoj chromatografické metody
Separační (dělící) metody.50
LC-MS
Základní části LC-MS instrumentace
Separační (dělící) metody.51
Použití
farmacie
biochemie
enviromentální vědy
forenzní analýza
potravinářství
toxikologie
LC-MS
Separační (dělící) metody.52
Gelová permeační chromatografie, GPC
̶ princip
̶ molekuly separovány podle jejich velikosti a tvaru
̶ (zadržovány v důsledku svého pronikání = permeace)
̶ stacionární fáze:
̶ pro látky rozpustné ve vodě: hydrofilní gely (sephadex)
̶ pro nerozpustné ve vodě: hydrofobní gely (styragel)
̶ vhodné pro:
analyty M > 500
proteiny
biopolymery
Separační (dělící) metody.53
Další separační metody
̶ planární techniky kapalinové chromatografie
̶ stacionární fáze na ploše;
̶ PC – papírová chromatografie (paper chromatography)
̶ TLC – tenkovrstvá chromatografie (thin layer chromatography)
̶ Postup:
̶ 1. vzorek nanesen mikropipetou na start
̶ 2. podložka se okrajem ponoří do mobilní fáze
̶ 3. MF vzlíná a unáší složky
tím rychleji, čím méně se poutají k SF
̶ 4. před dosažením konce plochy vyvíjení
ukončeno a označeno čelo
Separační (dělící) metody.54
Planární chromatografie
Separace rostlinných barviv na tenké vrstvě (Silufol)
stacionární fáze:
papír (voda poutaná celulosou)
tenké vrstvy zrnitého materiálu
na podložce (Al, sklo) - Al2O3, SiO2
mobilní fáze:
směsi rozpouštědel (voda, alkoholy,
organické kyseliny, …)
Separační (dělící) metody.55
Separační (dělící) metody.56
Planární chromatografie
Planární chromatografie
̶ Vizualizace skvrn (když nevzniká barevný produkt)
̶ usušený chromatogram lze vizualizovat:
̶ a) barvotvorným činidlem (postřikem s vhodným chemickým činidlem (ninhydrin, H2SO4,
KMnO4, I2)
̶ b) osvícením UV světlem
(fluorescence)
Separační (dělící) metody.57
Planární chromatografie
̶ charakteristikou látky je retenční faktor Rf
̶ hodnota Rf je pro dané uspořádání experimentu stálá
̶ Rf pro látku A: Rf =
𝐴
𝑧
0 ≤ Rf ≤1
̶ A…vzdálenost start – střed skvrny
̶ Z…vzdálenost start – čelo rozpouštědla
̶ hodnota Rf odpovídá kvalitě
̶ „intenzita“ skvrny odpovídá kvantitě
Separační (dělící) metody.58
Planární chromatografie
̶ chemické detekce skvrn
ve
̶ činidla používaná k chemické detekci skvrn
vedení postřiku činidlem
Separační (dělící) metody.59
Planární chromatografie
̶ kvantitativní analýza
̶ denzitometricky – zjišťuje se stupeň ztmavnutí v místě skvrny
Separační (dělící) metody.60
Další separační metody
̶ Extrakce
̶ přechod složky mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi (separační metoda)
̶ extrahované látky (analyty) na základě rozdílné rozpustnosti v použitých fázích
přecházejí do fáze rozpouštědla
̶ rozdělovací koeficienty
̶ cíl:
̶ selektivní až specifické oddělení analytu od ostatních složek vzorku
̶ druhy:
̶ 1. extrakce z pevné fáze
̶ 2. extrakce z kapaliny na pevnou fázi
̶ 3. extrakce z kapaliny do kapaliny
Separační (dělící) metody.61
Extrakce z tuhých látek
̶ Princip:
̶ S > složka > L
̶ z tuhého materiálu se rozpouští selektivně požadovaná složka ve vhodném rozpouštědle
(ostatní složky ne).
̶ macerace
̶ digesce
̶ Soxhletův extraktor – kontinuální extrakce (perkolace)
̶ Aplikace:
̶ extrakce silic, stanovení tuků
Separační (dělící) metody.62
Extrakce z kapaliny na pevnou fázi (SPE)
̶ Princip:
̶ L > složka > S
̶ SPE (angl. solid phase extraction) – extrakce tuhou fází (extrakce na pevné fázi)
̶ na povrchu pevné fáze se selektivně
adsorbuje z roztoku požadovaná složka
̶ nejpoužívanější technika
v analytických laboratořích všech zaměření
̶ čistění látek
̶ zakoncentrování
Separační (dělící) metody.63
Extrakce z kapaliny na pevnou fázi (SPE)
sorbenty:
~ 50 μm částice silikagelu
s vázanou fází:
polární ( -OH, NH2, ...)
nepolární (C8, C18, …)
aplikace
vitamíny, pesticidy ve vodě,
kyseliny ve víně, ...
Příklad aplikace SPE k přečištění nebo zakoncentrování vzorku
pevná fáze
Separační (dělící) metody.64
Extrakce rozpouštědlem – kapalné vzorky
Mikroextrakce (ME, angl. microextraction)
miniaturizace
(V = 0,001 – 0,01μl)
malý objem rozpouštědla
lehčí než voda
Separační (dělící) metody.65
Extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE)
̶ L > složka > L
̶ LLE (angl. liquid liquid extraction)
̶ rozdělovací rovnováha požadované složky v soustavě dvou nemísitelných kapalin
̶ (Složka přechází do kapaliny, ve které je více rozpustná)
̶ Nernstův rozdělovací zákon
(rozdělovací konstanta kD)
̶ Aplikace
̶ extrakce chlorovaných aromatických látek
̶ extrakce organických polutantů,
vícekroková extrakce
Separační (dělící) metody.66
Použitá literatura
̶ Crouch S., Skoog D., Holler F., West M., Fundamentals of Analytical Chemistry. United
States, 2013. 1072 s.
̶ Záruba K. a kolektiv., Analytická chemie (1.díl). VŠCHT Praha, 2016. 224 s.
̶ Holzbecher, Z. a Churáček J., Analytická chemie. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství
technické literatury, 1987. 663 s.
̶ Zýka J., Analytická příručka. 4. upr. vyd. Praha: SNTL, Nakladatelství technické literatury,
1988. 831 s.
̶ Klouda, P., Moderní analytické metody. 2. upr. a dopl. vyd. Ostrava 2003. 132 s.
̶ Okáč A., Analytická chemie kvalitativní, Academia, Praha 1966.
̶ Dostál V., Šimek J., Důkaz některých anorganických iontů vybranými analytickými reakcemi,
Skripta UP Olomouc, 2. upr. a dopl. vyd. Olomouc 2000. 76 s.
̶ Jančářová I., Jančář L., Analytická chemie. MZLU Brno, 2003, 195s.
Separační (dělící) metody.67