Spektrální analytické metody Elektromagnetické vlnění (též elektromagnetické záření) je děj, při němž se prostorem šíří příčné vlnění elektrického a magnetického pole. Popsáno je pomocí tzv. Maxwellových rovnic. Elektromagnetické vlnění Zahrnuje dvě složky, které jsou na sebe kolmé: • Intenzita elektrického pole E • Magnetická indukce B Vlnová délka Vztah mezi vlnovou délkou a frekvencí f – nezávisí na prostředí λ – se mění podle rychlosti c (v) – rychlost světla ve vakuu (v daném prostředí)  vc f  0 Elektromagnetické vlny se odráží i lámou. Jednotlivé druhy elektromagnetického záření se liší vlnovou délkou a tvoří spektrum elektromagnetického záření. Kvantová teorie M. Planck: Kvantová teorie A. Einstein: Fotoelektrický jev N. Bohr: Kvantový model atomu L. De Broglie: Dualita hmota-záření E = m.c2 E = h.v A. Einstein: Speciální teorie relativity Vlnění Částice Každá mikročástice o hmotnosti m pohybující se rychlostí v, se může chovat jako vlna o vlnové délce De Broglieova-Comptonova vlnová délka Vliv elektromagnetického záření na molekuly Vliv elektromagnetického záření na molekuly Elektromagnetické záření látek Všechny předměty kolem nás vydávají elektromagnetické záření. To se v případě studených těles nachází v infračervené části spektra, která není pro lidské oko viditelná. S rostoucí teplotou tělesa se vyzařování tepelného záření přesouvá ke kratším vlnovým délkám (k vyšším frekvencím). Nejnižší teplota, při které je záření daného tělesa pozorovatelné pouhým okem, se označuje jako Draperův bod – ten odpovídá zhruba 525 °C. Při této teplotě vyzařují všechny objekty, bez ohledu na materiál, z něhož jsou vyrobeny, červené světlo. Když předmět dále zahříváme, mění se postupně jeho barva z červené přes oranžovou a žlutou k bílé. Při ještě vyšších teplotách se záření posouvá směrem do ultrafialové oblasti. Naše oči ho pak vnímají jako namodralé. Záření černého tělesa Černé těleso je fyzikální abstrakce tělesa, které dokonale pohlcuje veškerou energii dopadajícího záření. V absolutně černém tělese je v rovnováze vyzařování a pohlcování záření. Wienův posunovací zákon S rostoucí teplotou zářiče se posouvá maximální hodnota spektrální hustoty zářivého toku ke kratším vlnovým délkám. T b max b = 2,9.10-3 m.K Stefanův-Boltzmannův zákon Intenzita záření vyzařovaná absolutně černým tělesem roste úměrně čtvrté mocnině termodynamické teploty. I – celková intenzita záření (podíl výkonu a plochy) [W·m−2]  - Stefan-Boltzmannova konstanta  = 5,67.10-8 W.m-2 .K-4 T - termodynamická teplota Spektrální metody se zabývají interakcemi mezi hmotou a energií. Spektroskopie Spektrometrie Absorpce Emise Rozptyl Odraz Lom Spectroscopic Techniques and Common Uses UV-VIS UV-vis region bonding electrons Quantitative analysis/Beer’s Law Atomic Absorption UV-vis region atomic transitions (val. e-) Quantitative analysis Beer’s Law FT-IR IR/Microwave vibrations, rotations Functional group analysis Raman IR/UV vibrations Functional group analysis FT-NMR Radio waves nuclear spin states Structure determination X-Ray Spectroscopy X-rays inner electrons Elemental analysis X-ray Crystallography X-rays Diffraction on crystal lattice 3-D structure analysis Stimulovaná emise a lasery Multifotonová excitace Je možná pouze u laserů, který má dostatečně silný tok záření, mizí vliv červeného prahu fotoefektu. „bulk“ (průměrná složení) vs lokální analýza Destruktivní Semidestruktivní Nedestruktivní Kvalitativní Semikvantitativní Kvantitativní Analytické metody Atomová spektrometrie Molekulová spektrometrie Spektrální metody ve viditelné a ultrafialové oblasti Emisní Absorpční Luminiscenční Atomová Molekulová Emisní a absorpční spektra Soubor frekvencí elektromagnetického záření vyzařovaného látkou. a) Spojité spektrum b) Čárové spektrum c) Pásové spektrum Emisní spektrum obsahuje elektromagnetické vlny všech vlnových délek v určitém intervalu, zdroj: rozžhavené pevné a kapalné látky(např. vlákno žárovky, roztavené kovy, …) Spojité spektrum Emisní spektra tvořené úzkými, navzájem oddělenými spektrálními čárami o různé intenzitě, zdroj: výboj v plynu za sníženého tlaku jiskrový výboj. Čárové spektrum emisní spektrum sodíku tvořené pásy s množstvím spektrálních čar těsné blízkosti, mezi nimiž jsou temné úseky, zdroj: zářící molekuly látek. Pásové spektrum emisní spektrum směsi par kadmia, rtuti a zinku Plamenové testy - emisní čáry prvků ve viditelné oblasti. Plamenová fotometrie Roztoková analýza destruktivní Stanovení snadno ionizovatelných prvků: Na, Li, K, Mg a Ca Spektrografie Semikvantitativní Semidestruktivní Jiskra El. oblouk Emisní spektra se zachycují na fotografickou desku Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES) Roztoková analýza Destruktivní K excitaci dochází v indukčně vázaném plazmatu. CCD detektor polychromátor Laser Induced Breakdown Spectroscopy LIBS Daguerrotypie, 19. stol. Sledování restaurátorských zásahů LIBS spektra originální malby a restaurovaných částí olejomalby. Molekulové pásy Spojení s Ramanovou spektrometrií LIBS Odstraňování vosku z pláten nebo dřeva (překližka) je časově náročné. Proces lze snadno automatizovat použitím laseru a detekce LIBS. LIBS spektra vosku vykazují zřetelné pásy CO a CN. Po dosažení spodní vrstvy se objevuje pík 423 nm a čištění je ukončeno. Stand-off LIBS ChemCam Malaga Analýza portálu katedrály. Stand-off LIBS Spektrometrie laserem indukovaného plazmatu (LIBS) Terénní a mobilní zařízení remote LIBS Soubor temných čar (pásů ve spojitém spektru světla), které vznikají při pohlcování záření látkou. a) Čárové spektrum b) Pásové spektrum Na rozdíl od emisních spekter nemusíme vzorek látky rozžhavit na velmi vysokou teplotu. Sloučíme-li emisní a absorpční spektrum stejné látky, získáme spektrum spojité. Absorpční spektra Kirchhoffův zákon Lambert – Beerův zákon l = tloušťka kyvety c = koncentrace roztoku ε = absorpční koeficient, ε = f(λ) Zákon platí pro monochromatické světlo ε T = transmitance A = absorbance Grafické vyjádření Lambert-Beerova zákona y = 0.02x 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0.0 20.0 40.0 60.0 concentration (uM) A = lineární funkce Jak hluboko pod mořskou hladinu je vidět? Molární absorpční koeficient mořské vody pro žluté světlo je 2.10-5 dm3.mol-1.cm-1. Člověk je schopen rozlišit objekt, pokud je poměr I/I0 větší než 0,02. log(I/I0) = - ε.d.c log(0,02) = - 2.10-5.d.55,6 d = 15 m I/I0 = 0,02 ε = 2.10-5 dm3.mol-1.cm-1 d = ? c = n/V = m/(M.V) = ρ.V/(M.V) = ρ/M = = 1000/18 = 55,6 mol.dm-3 Jaká je viditelnost v čisté atmosféře při 27 °C? Molární absorpční koeficient čistého suchého vzduchu je asi 2.10-6 dm3.mol-1.cm-1. Člověk je schopen rozlišit objekt, pokud je poměr I/I0 větší než 0,02. I/I0 = 0,02 ε = 2.10-6 dm3.mol-1.cm-1 d = ? p = 101 325 Pa T = 27 °C = 300 K c = n/V = p/(R.T) = 101325/(8,314.300) = 0,0406 mol.dm-3 log(I/I0) = - ε.d.c log(0,02) = - 2.10-6.d. 0,040 d = 209 km Příklad Příklad Fraunhoferovy čáry ve slunečním spektru jsou důsledkem absorpce světla atomy různých prvků ve sluneční atmosféře. Fraunhoferovy čáry Atomová absorpční spektrometrie V plameni V kyvetě Roztoková analýza destruktivní UV-VIS spektrofotometrie a kolorimetrie • odražené světlo = barva předmětu • černé těleso vše pohlcuje, bílé vše odráží Lidské oko UV-Vis Spectroscopy • UV- organic molecules – Outer electron bonding transitions – conjugation • Visible – metal/ligands in solution – d-orbital transitions • Instrumentation Jednopaprskový UV-Vis spektrofotometr Dvoupaprskový UV-Vis spektrofotometr 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 Wavelengths (nm) Absorbance Sample Solution Kvantitativní měření se provádí v maximu absorpční křivky. C C C C C O C O H UV-VIS spektra a struktura molekul  135 nm  165 nm n 183 nm weak  150 nm n 188 nm n 279 nm weak  A 180 nm 279 nm C O O O O max = 238, 305 nm max = 240, 311 nm max = 173, 192 nm Podobné struktury mají podobná UV spektra: Barva souvisí s rozsahem konjugovaného systému Příklad Bathochromní posun (červený posun) = posun λmax k delším vlnovým délkám vyvolaný chemickou modifikací molekuly nebo vlivem rozpouštědla. Hypsochromní posun (modrý posun) = posun λmax ke kratším vlnovým délkám. Hypochromní efekt = snížení εmax Hyperchromní efekt = zvýšení εmax fenolftalein - síla ligandového pole často odpovídá energii viditelného záření 13000 - 25000 cm-1 což vede k barevnosti většiny sloučenin přechodných kovů (v absorpčních spektrech absorpční pásy tzv. d-d přechodů) Zbarvení komplexů a UV-VIS spektra Např. zabarvení derivátů kationtu Co(NH3)63+, ve kterých je molekula NH3 substituována ligandem, který stojí ve spektrochemické řadě vlevo od NH3. S klesající silou průměrného ligandového pole se mění zabarvení: Co(NH3)63+ žlutý Co(NH3)5Cl2+ červený Co(NH3)4Cl2+ fialový Co(NH3)3Cl3 modrý Příklad: Sulfid kademnatý (CdS) má šířku zakázaného pásu 2.4 eV. Odhadněte jeho barvu. Eg = 2.4 eV = 2.4 x 1.602177⋅10-19 J = 3.84⋅10-19 J (h = Planckova konstanta) νmin = Eg/h = 3.84⋅10-19 J / 6.626⋅10-34 J . S = 5.8⋅1014 s-1 λmax = c/ νmin = 299792458 m.s-1 / 5.8⋅1014 s-1 = 517 nm => zelená barva Maximální absorbovaná vlnová délka odpovídá zelené barvě, vyšší vlnové délky odpovídající žluté, oranžové a červené barvě absorbovány nejsou. Proto je CdS žlutý až žlutooranžový. Zbarvení pevných látek Nerozpustné, měření v pevné fázi. Kolorimetrie - aplikace mobilního telefonu Kolorimetrie Signal processing Kolorimetrie Signal processing Reflektanční kolorimetrie Luminiscence a luminiscenční spektrometrie Záření o kratší vlnové délce λ (zpravidla UV) vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce λ´ (např. viditelné). Fluorescence: vymizí během několika málo nanosekund. Fosforescence: vyzařování pobíhá pomalu, po dobu i několika minut či déle. Druhy luminiscence Fluorescence Fotografie Textilie kultury Hopewell (pohřebiště Ohio Seip, J Ohio). fotografie v simulovaném denním světle (vlevo nahoře) fotografie v odraženém ultrafialovém světle (vpravo nahoře) ultrafialová fluorescence (vpravo dole) fotografie v infračerveném světle (vlevo dole) Fosforescence Chemiluminiscence Forenzní vědci používají reakce luminolu k detekci krve na místě činu. Směs luminolu ve zředěném roztoku peroxidu vodíku nanesou na místo, kde mají podezření, že se nachází krev. Železo obsažené v hemoglobinu krve reakci urychluje, a pokud je v místnosti tma a je přítomna krev, je pozorována modrá záře, která trvá 30 sekund. Forenzní vyšetřovatelé mohou tuto záři zaznamenat pomocí fotografického filmu, který lze použít jako důkaz u soudu o přítomnosti krve na místě činu. Bioluminiscence Kovařík Cucujo (Pyrophorus noctilucus ) Světluška větší (Lampyris noctiluca) Chinin v toniku = tepelné záření, jeho zdrojem je každé těleso které má teplotu vyšší než je absolutní nula. Při pohlcování se IR záření mění na vnitřní energii pohlcujícího tělesa (těleso se ohřívá). Infračervená spektrometrie (FTIR) Vibrations of Molecules Symmetrical stretching Antisymmetrical stretching Scissoring Rocking Wagging Twisting Oxid uhličitý nemá v základním stavu molekulový dipól. Některé vibrace molekul CO2 vytvářejí struktury s molekulovým dipólem. Z tohoto důvodu CO2 silně absorbuje infračervené záření. Podobně se chová i methan, vodní pára a další skleníkové plyny. Tyto plyny absorbují infračervené záření ze zemského povrchu a emitovat je zpět ve všech směrech. Příklad U hlavních plynů atmosféry, N2 a O2, k absorpci nedochází a záření prochází atmosférou do vesmíru. Noční vidění a termokamery Termografie = analýza infračervené energie vyzařované tělesem. Termografickým měřicím systémem lze zobrazit teplotní pole na povrchu sledovaného objektu. Infračervené záření je pro lidské oko neviditelné, proto se termovizní snímky vizualizují za použití okem viditelných palet, které přiřazují barvu různým teplotám (různému množství tepelného toku). Detekce infračerveného záření u hadů Zmije, krajty a hroznýši mají na tváři otvory, tzv. jamkové orgány, které obsahují membránu schopnou detekovat infračervené záření až do vzdálenosti jednoho metru. V noci umožňují hadům "vidět" obraz predátora nebo kořisti (podobně jako infračervená kamera). IR spektra jsou nejužitečnější při poskytování informací o přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických funkčních skupin. IR může poskytnout molekulární otisk, který lze použít při porovnávání vzorků. Pokud dva čisté vzorky vykazují stejné IR spektrum, lze tvrdit, že se jedná o stejnou sloučeninu. Infračervená spektrometrie ATR KBr technika NaCl kyveta Infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR) Interferogram Graf ukazuje oblasti spektra, kde obvykle absorbují následující typy vazeb. Například ostrý pás kolem 2200-2400 cm-1 by naznačoval možnou přítomnost trojné vazby C-N nebo C-C. Infračervená spektrometrie Terénní a mobilní zařízení Reflektografie Aplikace infračervené reflektografie - zviditelnění podkresby Infračervená (IR) mikroskopie IR obrázek vlákna z Monvelle (Monsanto) (a) zobrazení při 1641 cm-1 (b) zobrazení při 1735 cm-1. Infračervené spektrum (c) nylon (dolní vlákno a, b) (d) polyurethan (horní vlákno a, b) IR obrázek (1648 cm-1) řezu vlákna z Monvelle (Monsanto) Infračervená (IR) mikroskopie Princip Ramanovy spektrometrie záření o určité frekvenci je molekulou rozptýleno s posuny vlnové délky dopadajícího paprsku. Pozorované frekvenční posuny souvisejí s vibračními změnami v molekule spojenými s IR absorpcí. Intenzita Ramanových čar je 0,001 % intenzity zdroje. Fluorescence může překrýt Ramanovské záření Princip Ramanovy spektrometrie Ramanova spektrometrie Raman vs. FTIR FT IR (FT) Raman Ramanova spektrometrie s Fourierovou transformací (FT Raman spectrometry) Rozpoznání imitací Přírodní barevné korály (karoten) Barvené korály Imitace korálů Raman + FTIR mikroskopie Kombinace Raman + LIBS Mobilní zařízení pro Ramanovu spektrometrii M : 95% propustné zrcadlo pro vizualizaci plochy kamerou (Ca). HNF : holografické filtry odrážející laserový paprsek a propouští ramanovsky posunuté záření (Stokes) F filtry pro anti-Stokesovskou část spektra Ramanova spektrometrie Terénní a mobilní zařízení Analýza nástěnných maleb (kaple Ponthoz.) Ramanova mikroskopie Konfokální mikroskopie CM 3D Mikroskopický snímek vlákna mohérové vlny (Turecko) – objektiv 100x a 2násobný zoom Světelným zdrojem je laserové záření. Konfokální mikroskop poskytuje mimořádně ostrý, kontrastní, vysoce informativní obraz s vysokým rozlišením. Struktury nacházející se nad a pod rovinou fokusace nemají téměř žádný vliv na kvalitu obrazu. Hloubka ostrosti je vždy minimální. Konfokální Ramanova mikroskopie Rentgenové záření je elektromagnetické vlnění, jehož vlnové délky leží v intervalu 10-8 m až 10-12 m. Vzniká v rentgenové lampě (rentgence) při přeměně energie rychle se pohybujících elektronů na energii elektromagnetického záření Rentgenové záření Rentgenové záření vzniká změnami elektromagnetického pole v atomovém obalu (rozměry atomu 10–8 – 10–10 m) Druhy rentgenového záření: charakteristické (čárové) brzdné (spojité) Charakteristické rentgenové záření vzniká v důsledku přeměn energie ve vnitřních slupkách elektronového obalu atomu. Spektrum má čárové a poloha spektrálních čar je pro daný prvek charakteristická Moseleyho zákon Vztah mezi vlnovou délkou (frekvencí) rentgenového záření produkovaného chemickými prvky a jejich atomovým číslem. Brzdné rentgenové záření (Bremmstrahlung) vzniká jako důsledek náhlé změny rychlosti elektronů dopadajících na povrch kovu (anodu rentgenky). Spektrum je spojité. Rentgenová fluorescenční analýza (XRF) Rentgenová Radionuklidová Energiově disperzní Vlnově disperzní Portable X-Ray Fluorescence (PXRF) Rentgenová difrakční analýza (XRD) Elektronová mikrosonda Elektronová mikroskopie Fotoelektronová spektroskopie (ESCA) Ultrafialová (UPS) Rentgenová (XPS) Sledování kinetické energie fotoelektronů, Ta závisí na energii molekulového orbitalu. Particle-Induced X-ray Emission (PIXE) a Particle-Induced Gamma Emission (PIGE) Neutronová aktivační analýza Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie je založena na ionizaci prvků/sloučenin a rozdělení iontů na základě jejich poměru hmotnosti k náboji (m/z). Hmotnostní spektra molekul se využívají při analýze struktury organických látek. Kvadrupólový analyzátor Triplequad Iontová past (Ion trap) Sektorový hmotnostní spektrometr Průletový analyzátor (Time of Flight, TOF) Tandem TOF MS Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem Roztoková analýza destruktivní Laser Ablation ICP-MS Nd:YAG Excimer Kvadrupólový TOF Sektorový (MC) Pevné látky vzorkovány laserovou ablací Semidestruktivní metoda LA-ICP-MS Vzorkování laserovou ablací. Liniové skeny Plošné skeny LA-ICP-OES MC LA-ICP-MS Analýza izotopových poměrů Izotopy Analýza izotopových poměrů Sklo „Art nouveau“ Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry (LDI - TOF MS) Desorpce a ionizace atomů/molekul dusíkovým laserem (337.1 nm) Pigmenty v iluminovaných rukopisech Akrylátové barvy Desorpce a ionizace atomů/molekul dusíkovým laserem (337.1 nm) za přítomnosti matrice Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI - TOF MS) Analýza fosilních proteinů „Peptide mass fingerprint“ osteokalcinu rozloženého trypsinem: (A) extant horse (B) zebra (C) osel (D) částečně čištěný osteokalcin z 42 000 let starých pozůstatků koně. Identifikace keratinů Hmotnostrní spektra 1400 to 1700 Da vlny jaka (A) a kašmírské kozy (B) (rozklad trypsinem). Hmotnostní spektra 1700 to 2100 Da peří husy (A) a kachny (B). TOF-SIMS Secondary-ion mass spectrometry TOF-SIMS Direct inlet (přímý vstup) s ionizací nárazem elektronů (electron impact, EI) Hmotnostní spektrometrie organických molekul Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) Chromatogram v GC-MS