Laboratorní cvičení č. 5
1. Stanovení osmotického tlaku buněčné šťávy metodou hraniční plazmolýzy
Princip
Rostlinnou buňku lze přirovnat k osmometru. Buněčná stěna je propustná pro vodu i pro
rozpuštěné látky a osmotických pochodů se neúčastní. Nositelem semipermeability je
cytoplazmatická membrána a membrány uvnitř buňky, zejména tonoplast. Je-li rostlinná
buňka ponořena do vhodného plazmolytika, které je vzhledem k osmotické hodnotě buněčné
šťávy hypertonické (má vyšší koncentraci), nastává jev zvaný plazmolýza. Rozumí se tím
výdej vody z buňky do hypertonického roztoku přes semipermeabilní membrány. Zmenšuje
se objem vakuoly a klesá turgorový tlak protoplastu na buněčnou stěnu. Ta je značně
elastická, zatímco byla původně napjatá, začne zpočátku zmenšovat svůj objem tak, že se
mění i velikost celé buňky. V okamžiku, kdy je buněčný turgor nulový, přestane se buněčná
stěna smršťovat. Ale tonoplast s vakuolou se zmenšuje dál. Dochází k odtrhování protoplastu
od buněčné stěny. Ponechá-li se takto plazmolyzovaná buňka v hypertonickém prostředí, pak
odumírá. Přenese-li se včas do prostředí hypotonického (destilovaná voda), buňka začne
znovu nasávat vodu, až se protoplast dostane do původního stavu. Tento je se nazývá
deplazmolýza. Jako plazmolytika je třeba používat látky, které nepůsobí na buňky jedovatě, a
pro které jsou membrány impermeabilní.
Ve vakuolách rostlinných buněk jsou přítomny směsi rozmanitých látek, jako cukrů,
organických kyselin a jejich solí i solí anorganických. Sledování průběhu plazmolýzy je
jednou z metod, kterou můžeme zjistit koncentraci buněčné šťávy a z ní pak vypočítat
hodnotu jejího osmotického tlaku. Je třeba zjistit koncentraci plazmolytika, kdy nepatrně
dochází k odtržení protoplastu od buněčné stěny, což nastává nejdříve v rozích buňky. Tento
stav plazmolýzy je označován jako plazmolýza hraniční. Průměrná koncentrace buněčné
šťávy pozorovaného souboru buněk pak odpovídá koncentraci roztoku, v němž hraniční
plazmolýza nastala u 50 % pozorovaných buněk.
Materiál a pomůcky
Cibule kuchyňská (Alium cepa, odrůda Karmen), vodní mor kanadský (Elodea
canadensis) nebo douška (Egeria sp.), 1 M roztok sacharózy, destilovaná voda, odměrný
válec, kádinky, preparační souprava, podložní a krycí sklíčka, mikroskop.
Postup
Připravte vždy 20 ml roztoků sacharózy o koncentracích 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M, 0,6
M a 0,8 M podle následujícího výpočtu pro míchání roztoků různých koncentrací:
c1*V1 = c2*V2
kde c2 je koncentrace původního roztoku sacharózy (v našem případě 1 M), V2 je objem
roztoku, který chceme získat (20 ml), c1 je výsledná koncentrace roztoku, V1 je objem 1 M
roztoku, který použijeme pro zředění.
Příklad: 0,2 M roztok sacharózy
c1*V1 = c2*V2
V1 = c2*V2/c1
V1 = (0,2*20)/1 = 4
 na přípravu 0,2 M roztoku sacharózy budeme
potřebovat 4 ml 1 M roztoku sacharózy (a 16 ml destilované
vody)
Dopočítejte ředění pro ostatní roztoky.
Do připravených roztoků umístěte po jednom vzorku svrchní epidermis suknic cibule
kuchyňské (Alium cepa) a lístek vodního moru/doušky (Elodea canadensis/Egeria sp.).
Nechte inkubovat asi 30 minut, pravidelně promíchávejte. Poté z jednotlivých vzorků
připravte nativní preparáty. Mikroskopujte, v každém preparátu spočítejte sto buněk a
stanovte, kolik z nich je plazmolyzovaných.
Koncentrace roztoku
sacharózy
% plazmolyzovaných
buněk
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,8
Zjištěné hodnoty vyneste do grafu (na ose x bude koncentrace sacharózy, na ose y %
plazmolyzovaných buněk). Z grafu odečtěte, při které koncentraci roztoku nastala hraniční
plazmolýza u 50 % buněk.
Vypočtěte osmotický tlak buněčné šťávy podle van´t Hoffovy rovnice:
π = R*T*c*i
kde π je osmotický tlak (jednotka kPa); R je molární plynová konstanta (R = 8,31447 J.mol-
1.K-1
); T je teplota (jednotka K, Kelvin), při které byl pokus prováděn (teplotu laboratoře
převedete na Kelviny přičtením hodnoty 273); c je molární koncentrace roztoku (jednotka M,
mol.dm-3
); i je konstanta zohledňující disociaci rozpuštěné látky, pro neelektrolity i = 1.
Výsledek uveďte v Mpa.