1
ACh II - MS
Analytická chemie II:
Úvod do hmotnostní spektrometrie
Jan Preisler
312A14, Ústav chemie PřF MU, UKB, tel.: 54949 6629
preisler@chemi.muni.cz
• Specializovaný kurz: C7895 Hmotnostní spektrometrie biomolekul
http://bart.chemi.muni.cz/courses.htm
• Prezentace s využitím:
• Daniel C. Harris: Quantitative Chemical Analysis, 7th Edition, 2007,
Chapter 22: „Mass Spectrometry“, W. H. Freeman and Company
• Gary D. Christian, Purnendu K. Dasgupta, Kevin A. Schug: Analytical
Chemistry, 7th Edition, 2014, Chapter 22: „Mass Spectrometry“, Wiley
ACh II - MS 2
Obsah
I. Základní koncepty MS
II. Hmotnostní analyzátory vzorku
III. Ionizační metody a aplikace MS
IV. Seminář
ACh II - MS 3
Základní koncepty
Mass spectrometry, MS
Stručná historie
Hmotnostní spektrum
Definice rozlišení
Izotopové vzory
Interpretace spekter
Fragmentace
ACh II - MS 4
Stručná historie hmotnostní spektrometrie
1803 Daltonova atomová teorie
“hmota se skádá z atomů; všechny
atomy maji stejnou hmotu”
… ne tak docela: izotopy
Důkaz izotopů:
- spektroskopie: nepatrný posun čar
... vyžaduje kvalitní přístroj
- MS: snadné stanovení
ACh II - MS 5
Stručná historie hmotnostní spektrometrie
První hmotnostní spektrometr
1911 J. J. Thomson: Parabola MS (Phil Mag. 1911, 21, 225)
“Paprsky pozitivní elektřiny” 1913 http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/atoms/faq/how-does-mass-spec-work.shtml
Magnetický sektor s energetickým analyzátorem
1919 F. W. Aston: Mass Spectrograph (Phil. Mag. 1919, 38, 209)
Elektronová ionizace
1940 C. Berry: Struktura organických sloučenin
Nové ionizační techniky (FAB, PD, ESI a MALDI)
1980+ Analýza těžkých a velmi těžkých molekul
2014 Kvalitativní, strukturní i kvantitativní analýzu anorganických
organických a biologických molekul, často ve spojení s chromatografií;
široká škála komerčních hmotnostních spektrometrů
Zpráva o stavu MS v ČR
Počet instalací do září 2015:
• Nezahrnuje GC-MS (≈500), ICP-MS (nepočítaně)
• Jde pouze o odhad instalovaných, nikoli funkčních
přístrojů
398 MS LC-MS
86 MALDI MS
1 spektrometr/22 tis.
obyvatel
1 spektrometr/163 km2
6
2
Přehled instalací přístrojů LC-MS a MALDI MS
(do září 2015)
Celkový počet instalací: 398 Celkový počet instalací: 86
0
10
20
30
40
50
60
2015
2014
2013
2012
2011
2010
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1995-99
• počet za rok 2015 je o cca ¼ nižší; loni v září instalováno 28 LC-MS, do
konce roku 39
• počet LC-MS instalovaných od r. 2006: 304
• vliv nasazení MALDI MS pro identifikaci mikroorganismů v klinické praxi
• počet MALDI MS instalovaných od r. 2006: 75
0
5
10
15
2015
2014
2013
2012
2011
2010
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1997-99
7
8
ACh II - MS 9
Hmotnostní spektrum
Iontový signál vs. m/z
Iontový signál, intenzita
libovolné jednotky (counts, arbitrary units, a.u.)
normalizace signálu: intenzita nejvyššího píku = 100%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
m/z
normalizace iontového signálu
ACh II - MS 10
Hmotnostní spektrum
Hmotnost, m
a.m.u., u, Da (Dalton), počet atomových hmotnostních jednotek
číselně rovný molární hmotnosti
m/z - účinná hmotnost, Th (Thomson)
Počet nábojů, z
počet elementárních nábojů iontu
obvykle ±1
výjimky, např. elektrosprej: |z| >> 1
Ionty: pozitivní a negativní, ne kationty a anionty
Hmotnostní spektrometrie, ne spektroskopie
ACh II - MS 11
Vybrané veličiny v hmotnostní spektrometrii
Hmotnostní rozlišení (Mass Resolution, Resolving Power)
...Míra separace dvou přilehlých píků.
Definice:
1. FWHM (full width at half maximum), R = m/m1/2
2. Nejmenší rozdíl hmotností (m), při kterém lze ještě rozlišit sousední
píky s definovaným údolím (10 - 90%) mezi píky.
3. Max. hmotnost, při které lze ještě rozlišit píky s jednotkovým rozdílem
hmotností.
Energie iontu
• Joule, J
• elektronvolty, eV
atomy misto molů ... elektronVolty místo Joulů. 1 eV = 1.6 x 10-19 J
jednoduchost: urychlovací napětí = 100 V, náboj = 1 ... E = 100 eV
vhodné pro srovnání s energií ionizační, vazebnou, s energií fotonu atd.
Tlak, p
1 atm = 760 Torr = 101 325 Pa = 1,01325 bar = 14,70 PSI
ACh II - MS 12
Rozlišení, Rozlišovací schopnost, R(FWHM)
1400
146.0
208



m
m
R
(příměs Pb v mosazi)
Vhodné pro píky s
gausovským, lorentzovským
nebo trojúhelníkovým profilem,
pro hmotnostní spektrometry
B, TOF, FT ICR, O
3
ACh II - MS 13
Rozlišovací schopnost
10%
50%
92%
ACh II - MS 14
Jednotkové rozlišení
http://www.jeolusa.com/DesktopModules/Bring2mind/DMX/Download.aspx?Command=Core_Download&EntryId=283&PortalId=2&TabId=337
Uvádí do jaké hmotnosti lze
rozlišit pík od píku o
jednotku vyšší
Vhodné pro kvadrupólové
hmotnostní spektrometry
ACh II - MS 15
Izotopy
... atomy stejného prvku lišící se hmotností
Vede k „jemné“ izotopové struktuře píků
Např. izotopy uhlíku: 99% 12C, 1% 13C
Výsledná kombinace je funkcí počtu uhlíkových atomů v molekule:
C: 99% 12C 1% 13C
C2: 98% 12C12C 2% 12C13C 0.01% 13C13C
C3: 97% 12C12C12C 3% 12C12C13C 0.04% 12C13C13C 10-4 % 13C13C13C
Relativní výskyt molekul v %:
C60: 12C60 100 C100: 12C100 100
12C59
13C 66 12C99
13C 110
12C58
13C2 21 12C98
13C2 60
12C57
13C3 4.6 12C97
13C3 22
ACh II - MS 16
ACh II - MS 17
Izotopy vybraných prvků
Kalkulátory izotopových profilů; např.:
http://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm
ACh II - MS 18
Praktické důsledky výskytu izotopů
+ Objasňování struktury
+ Použití izotopových vnitřních standardů
- Snížení citlivosti u těžších molekul
- Nutnost vysokého R při vysoké m/z pro správné stanovení m/z
Se stoupajícím n přestává být monoizotopická forma dominantní a intenzity
různých forem jsou porovnatelné (široká obálka) ... viz příklad dále.
4
ACh II - MS 19
0
20
40
60
80
100
%Int.
616 617 618 619 620 621 622 623 624 625
Mass/Charge
Molecular formula: C30H45N6O6S Resolution: 20000 at 50%
617.3
618.3
619.3
620.3 621.3 622.3 623.3
Peptid, Mmono~ 617
ACh II - MS 20
0
20
40
60
80
100
%Int.
1234 1236 1238 1240
Mass/Charge
Molecular formula: C60H90N12O12S2 Resolution: 20000 at 50%
1234.6
1235.6
1236.6
1237.6
1239.6
Peptid, Mmono~ 1 234
ACh II - MS 21
0
20
40
60
80
100
%Int.
1852 1854 1856 1858
Mass/Charge
Molecular formula: C90H135N18O18S3 Resolution: 20000 at 50%
1852.9
1851.9
1853.9
1854.9
1855.9
1857.9
Peptid, Mmono~ 1 852
ACh II - MS 22
0
20
40
60
80
100
%Int.
3704 3706 3708 3710 3712 3714
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 20000 at 50%
3705.9
3704.9
3707.9
3708.9
3703.9
3709.9
3710.9
3712.9
Peptid, Mmono~ 3 704
ACh II - MS 23
0
20
40
60
80
100
%Int.
5555 5560 5565 5570
Mass/Charge
Molecular formula: C270H405N54O54S9 Resolution: 20000 at 50%
5559.8
5560.8
5557.8
5561.8
5562.85556.8
5563.8
5564.85555.8
5566.8 5569.8
Peptid, Mmono~ 5 556
ACh II - MS 24
0
20
40
60
80
100
%Int.
13405 13410 13415 13420 13425
Mass/Charge
Molecular formula: C360H540N272O272S12 Resolution: 20000 at 50%
13414.4
13412.4
13416.4
13411.3
13417.4
13410.3 13418.4
13419.4
13409.3
13420.4
13408.3
13422.4
Protein, Mmono~ 13 407
5
ACh II - MS 25
0
20
40
60
80
100
%Int.
18520 18530 18540
Mass/Charge
Molecular formula: C900H1350N180O180S30 Resolution: 20000 at 50%
18533.4
18535.418530.4
18536.4
18529.4
18537.5
18528.3
18538.5
18527.3
18539.5
18526.3
18541.5
18524.2
18544.6
Protein, Mmono~ 18 520
ACh II - MS 26
0
20
40
60
80
100
%Int.
37050 37060 37070 37080
Mass/Charge
Molecular formula: C1800H2700N360O360S60 Resolution: 20000 at 50%
37066.0
m/z ~ 12
Protein, Mmono~ 37 050
ACh II - MS 27
Izotopy: objasňování struktury
ACh II - MS 28
Izotopy: objasňování struktury
ACh II - MS 29
Izotopy: objasňování struktury
ACh II - MS 30
MS s vysokým rozlišením (R = 104 – 105)
6
ACh II - MS 31
Stanovení izotopových poměrů
ACh II - MS 32
Interpretace hmotnostních spekter
Reakce v plynné fázi – fragmentace, přesmyky ...
• Identifikace píku molekulového iontu
• Stanovení počtu dvojných vazeb a aromatických jader
• Objasnění píků fragmentů a fragmentačních reakcí
ACh II - MS 33
Fragmentace
ACh II - MS 34
MS izobarů, izomerů
ACh II - MS 35
Značení fragmentace
H
2
N - CH - C -
OR
1
NH - CH - C -
OR
2
NH - CH - C -
OR
3
NH - CH - COOH
R
4
x
3
a
1
y
3
b
1
z
3
c
1
x
2
a
2
y
2
b
2
z
2
c
2
x
1
a
3
y
1
b
3
z
1
c
3
H+
ACh II - MS 36
Hmotnostní spektrometry
Hmotnostní spektrometr ... přístroj, který z analyzované látky produkuje
ionty a stanovuje jejich hmotnost, přesněji poměr hmotnosti a náboje
Součásti spektrometru
1. Iontový zdroj (zařízení na zavádění vzorku, iontová optika)
2. Hmotnostní analyzátor (iontová optika, magnet, detektor)
3. Vakuové pumpy (nízké, vysoké a ultra vysoké vakuum)
4. Řídící a vyhodnocovací elektronika, software
Magnetický sektor
Kvadrupólový analyzátor
Iontový cyklotron (FT-ICR-MS)
Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOFMS)
Iontová past (IT)
Orbitrap
7
ACh II - MS 37
ACh II - MS 38
Magnetický sektor, B
ACh II - MS 39
Kvadrupólový filtr, Q
ACh II - MS 40
Kvadrupólová iontová past (Ion Trap, IT)
ACh II - MS 41
Průletový analyzátor (Time-of-flight MS, TOFMS)
s iontovým zrcadlem (reflektor, reflektron)
ACh II - MS 42
Ionizační techniky a aplikace
Doutnavý výboj (GD)
Elektronová ionizace (EI)
Chemická ionizace (CI)
Indukčně vázané plazma (ICP)
Ionizace rychlými atomy (FAB)
MS sekundárních iontů (SIMS)
Termosprej (TSI)
Iontový sprej (IS)
Elektrosprej (ESI)
Plazmová Desorpce (PD)
Laserová Desorpce (LD)
Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI)
atd. atd.
8
ACh II - MS 43
Ionizace
Tvorba iontů: ztráta elektronu, H+
zachycení elektronu, H+, Na+, Ag+ ...
Ionizace: měkká/tvrdá
anorganická/organická
on-line/of-line
kontinuální/pulzní
ACh II - MS 44
Měkké a tvrdé ionizační techniky
Tvrdá: vysoký stupeň fragmentace, tvorba molekulárních iontů
Měkká: tvorba protonovaných molekul (pseudomolekulárních iontů)
Elektronová ionizace Chemická ionizace
M + e-  M+. + 2e- M + RH+  MH+ + R
ACh II - MS 45
Elektrosprej (Electrospray Ionization, ESI)
ACh II - MS 46
Elektrosprej
ACh II - MS 47
Elektrosprej
ACh II - MS 48
Hmotnostní spektrum ESI cytochromu c
MW (cyt.c) ~ 12 220
Tvorba vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+s „obálkou“ ve tvaru zvonu.
Odstupy mezi píky nejsou stejné (narozdíl od izotopového vzoru).
9
ACh II - MS 49
ACh II - MS 50
MALDI
Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
ACh II - MS 51
Hmotnostní spektrum MALDI
MALDI MS směsi proteinů kravského mléka
Zobrazovací hmotnostní spektrometrie
Mass Spectrometry Imaging, MSI
Distribuce lipidů
v myším mozku
Např. MALDI MSI
• vizualizace prostorového rozložení látek v tkáních
• bez derivatizace
• distribuce léčiv a metabolitů
ACh II - MS 53
Chemická ionizace za atmosferického tlaku, APCI
Atmospheric pressure chemical ionization
ACh II - MS 54
Příklady aplikací
1. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS, MSn)
Kolizně indukovaná disociace (CID)
2. Separace – MS
3. Hmotnostní spektrometrie iontové mobility, IMMS
10
ACh II - MS 55
Tandemová hmotnostní spektrometrie
MS/MS, MSn
Kolizně indukovaná disociace (CID), kolizně aktivovaná disociace (CAD)
Trojitý kvadrupólový filtr:
prekurzor produkt
ACh II - MS 56
Kolizně indukovaná disociace
kladně nabité ionty záporně nabité ionty
ACh II - MS 57
Spojení separace - MS
Zpravidla on-line
Sprejovací techniky: ESI, API...
LC – MS
CE – MS
ACh II - MS 58
HPLC – UV herbicidů
Směs 6 herbicidů,
c = 1 ppb
ACh II - MS 59
HPLC – MS herbicidů
Celkový iontový proud (Total Ion Current, TIC)
… integrovaný iontový signál (proud) přes celý měřený rozsah m/z
… vhodný pro celkový obrázek o chromatografii a nalezení nových píků
… nevhodný při analýze komplexních směsí
ACh II - MS 60
HPLC – MS herbicidů
Monitorování vybraného iontu (Selected Ion Monitoring, SIM)
… detekce při vybrané m/z
… pro experiment navržený pro monitorování pouze vybraného iontu
… pro více iontů peak switching
11
ACh II - MS 61
Analýza estrogenu v odpadních vodách
... 17a-ethinylestradiol, antikoncepce, negativní vliv na ryby již
v koncentracích ~ppt
... velmí nízké koncentrace, složitá matrice vzorku
MS/MS estrogenu
ACh II - MS 62
Monitorování vybrané reakce (Selected reaction monitoring, SRM)
… analogie SIM s využitím tandemové MS
… pro více rekcí multiple reaction monitoring, MRM
Vzorek: estrogen v odpadních vodách po prekoncentraci; 3,6 ng/l
HPLC – MS/MS (MRM)
295,2  145,0
295,2  159,0
Analýza estrogenu v odpadních vodách
ACh II - MS 63
Hmotnostní spektrometrie iontové mobility
(Ion Mobility Mass Spectrometry, IMMS)
... na pomezí mezi hmotnostní spektrometrií a elektroforézou
ACh II - MS 64
IMMS
ACh II - MS 65
Seminář
1. Pík iontu o m/z = 100 má pološířku 0,25. Jaké dva ionty lišící se o 1
a.m.u. bude ještě schopen rozlišit? (Předpoklad: R nezávisí na m/z.)
2. Jaká rozlišovací schopnost je třeba k separaci CH3CH2
+. od HCO+.?
3. Poměry m/z 2503, 2002, 1668, 1430, 1251, 1112 a 1001 patří píkům
téže látky v jediném spektru ESI MS. Jaká je MW této látky?
4. Co můžete říci o hmotnostním spektru organické sloučeniny:
Hodnoty m/z byly určeny s tolerancí ~ 0,1.
m/z
I.S.
1000,0
1000,3 1000,7
1001,0
ACh II - MS 66
Seminář
5. Odhadněte dobu letu iontu koňského cytochromu c (MW = 12 384) v
TOF MS na obrázku.
6. Jaký bude poměr intenzit píků benzenu C6H6
+ při m/z = 79 a 78?
7. Jaký bude poměr intenzit píků hexanu C6H14
+ při m/z = 87 a 86?
(+20 kV)
laserový puls
odpuzovací
elektroda s
naneseným
vzorkem
driftová zóna (2 m) detektor
vstupní a výstupní mřížky
12
Seminář
ACh II - MS 67
8. Jaký mod (pozitivní, negativní) a jaké pH vzorku byste zvolili k detekci
a) ibuprofenu
b) peptidu
c) fosfopeptidu
d) nukleové kyseliny
9. Pokuste se odvodit vztah pro m/z jako funkci B, U a r
v magnetickém sektoru.
ACh II - MS 67
. . . . .
. . .
r
U
+
iontový
zdroj
B
vstupní
štěrbina
detektorm2
m1
m1/z1 <> m2/z2
Seminář
ACh II - MS 68
10. Co můžete říci o 2 různých spektrech téhož peptidu? (Počátek
osy m/z nezačíná v nule, měřítka os jsou různá.)
11. Pro 2 sousední píky téže látky v hmotnostním spektru ESI byly
změřeny tyto hodnoty: (m/z)1= 1000,3 a (m/z)2 = 1500,1. Určete
nominální m analytu.
12. Proč je v hmotnostním spektrometru vakuum?
m/z m/z
S S
ACh II - MS 69
Další otázky (Christian a kol.: Analytical Chemistry)
ACh II - MS 70
ACh II - MS 71
ACh II - MS 72