8. cvičení: Stanovení lyzozymu metodou jednoduché radiální difúze


Lyzozym jako enzym rozkládá polysacharid murein, který je základní komponentou buněčných stěn
bakterií. Lyzuje především grampozitivní baktérie, které mají mureinovou vrstvu nechráněnou vnější
lipopolysacharidovou membránou. Vyskytuje se nejen u obratlovců (sliny, sekrety, krevní sérum,
mléko, moč, pot, játra, cytoplazma fagocytů apod.), ale i u bezobratlých (hemolymfa) a některých
rostlin (Papaya latex, Ficus apod.). Jednou z nejjednodušších metod stanovení lyzozymu je
imunodifúze v agarózovém gelu.

Princip

Při této metodě je jedna ze složek (bakterie, protilátky nebo senzibilizované erytrocyty)
rozpuštěna v agarózovém gelu a druhá (lyzozym, antigen, sérum s komplementem) difunduje z jamky
radiálně do okolního gelu. Obě složky spolu interagují a dochází k lýze bakterií lyzozymem
projevující se jako vyčeření okolí jamky. Aktivitu lyzozymu odráží velikost plochy, ve které došlo
ke změně zakalení gelu.

Při manipulaci je potřeba dodržet správnou teplotu tak, aby byl gel tekutý, ale zároveň aby
nedocházelo k denaturaci proteinů teplotou.

Výhody a nevýhody: jednoduchost, časová náročnost, nutná zkušenost a zručnost.

Chemikálie a roztoky

▪bakteriální kultura - Micrococcus luteus (CCM 169)

▪1,25% agarózový gel s bakteriální kulturou

▪zásobní roztok lyzozymu [2,5 mg/ml]: 1 mg lyofilizovaného lyzozymu má aktivitu přibližně 47 000
jednotek. Rozpuštěno v borátovém pufru.

▪borát-fosfátový pufr (BFP), pH 7,4


Měřený vzorek

▪myší sérum, sliny, slzy, moč nebo hemolymfa zavíječe voskového, fyziol. roztok


Přístroje a pomůcky

Skleněná plotna 5 x 5 cm, Petriho misky na vlhkou komůrku, borát-fosfátový pufr, korkovrt napojený
na vývěvu pro vysekávání jamek do agarových ploten, filtrační papír, polystyrenové zkumavky (2,5
µl), pravítko, pipety, epiny, nálevku nebo kelímky na moč

Příprava skleněných ploten s agarózovým gelem:

1. Vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy.

2. Skleněnou plotnu (5 x 5 cm) očistíme alkoholem a necháme uschnout.

3. Připravenou skleněnou pipetu několikrát propláchneme horkou vodou.

4. Na plotnu naneseme skleněnou pipetou 2,4 ml důkladně promíchané agarózy s bakteriální kulturou.

5. Gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše.



Z Petriho misky a vlhkého filtračního papíru připravíme vlhkou komůrku. Do ní umístíme skleněnou
plotnu s agarózovým gelem, aby nevyschl. Každá plotna musí mít kalibraci, proto si do dvojice
připravíme kalibrační řadu pěti zkumavek podle následujícího schématu.

Postup:


.









Výstupem této metody je 1. tabulka obsahující hodnoty:

1. druhých mocnin průměrů prstence

2. koncentrace lysozymu

3. aktivity lysozymu

2. graf závislosti koncentrace lysozymu standardů (osa X) na druhé mocnině průměrů prstenců v mm
(osa Y) tj standardní křivka (rovnice regrese) a podle této křivky zjištění koncentrace vlastních
vzorků.

     Osa X – koncentrace lysozymu

     Osa Y – druhá mocnina průměrů prstenců (mm)