Trofická pojiva: 1. krev a krvetvorba 2. lymfa, 3. tkáňový mok 4. lymfatické orgány Volné buňky pojivových tkání Leukocyty Vycestovávají do vaziva přes stěny kapiár – diapedeze Hlavní součást trofických pojiv – krve Granulocyty Agranulocyty Neutrofily Lymfocyty Eozinofily Monocyty Bazofily Nezralý neutorfil- tyčka Stanovení krevních skupin Krátké ilustrativní video https://www.youtube.com/watch?v=J5xSUhyXyIE Aglutinace je imunitní děj, reaguje protilátka s korpuskulárním antigenem, která vede ke vzniku aglutinátu „vločkové konzistence. U reakce zv. hemaglutinace jsou korpuskulárním antigenem erytrocyty. Výsledný shluk erytrocytů je dobře pozorovatelný pouhým okem a je dostatečně pevný při standardním způsobu třepání. Nevýhodou hemaglutinace je nízká citlivost a omezená životnost erytrocytů. Aglutinační reakce se obvykle hodnotí vizuálně tzv. na čtyři křížky a jsou to metody jednoduché a levné, ale také málo citlivé. Používají se hlavně pro průkaz antigenů erytrocytů a celé řady bakteriálních antigenů. Základem je reakce: Aglutinogen (tj antigen) reaguje s aglutininem (tj protilátka) za vzniku aglutinátu – sraženiny (imunokomplexu). krevní skupina antigen A B 0 AB v membráně erytrocytů A B H A i B Pomůcky: podložní víčka na diagnostiku krevních skupin s kulovitými otvory, desinfekce, vatičky, pero na odebírání krve z prstů, bodce, tubičky s heparinem, epiny, stojánek, roztírací umělohmotné tyčky, pipeta s rozměren 1 μl - 10 μl, rukavice; 1.červené krvinky všech skupin - 2.lahvičky s protilátkami proti krevním antigenům: POUŽITÁ DIAGNOSTIKA •Monoklonální diagnostikum anti-A (výrobce Sanquin, Holandsko; dodavatel EXBIO Olomouc s.r.o.), ředění 1:32 •Monoklonální diagnostikum anti-B (výrobce Sanquin, Holandsko; dodavatel EXBIO Olomouc s.r.o.), ředění 1:8 •Lektin anti-H (výrobce Sanquin, Holandsko; dodavatel EXBIO Olomouc s.r.o,ředění 1:2 •Monoklonální diagnostikum anti-H (výrobce Immucor Gama, Německo; dodavatel APR Praha s.r.o. Postup: •Odběrovým perem v rukavicích odebereme kapky krve z prstu do heparinové tyčinky •kapku krve dáme na podložní sklíčko a okamžitě rozetřeme •z heparinové tyčinky necháme krev stéci do epiny ve stojánku. •z naředěných protilátek proti A,B,O krevním skupinám odebereme 5 μl pipetou a nakapeme na podložní sklíčko s kulovitými prostory. •pak z odebrané krve v epině vezmeme a dáme 5 μl krve do 0,5ml fyziologického roztoku a zamícháme, odtud nabereme 5 μl zředěné krve a nakapeme na sklíčko do nakapaných protilátek. Vezmeme umělohmotné roztírátko a kapku krve s kapkou protilátek smícháme a čekáme na výsledek - srážení, který si prohlédneme v mikroskopu •nachystáme kontrolní vzorky kr. skupin komerčně zakoupené k porovnání •Výsledek: Pokud došlo k aglutinaci, tj ke srážení krvinky s protilátkami za vzniku aglutinátu, jde o danou krevní skupinu. Pokud nedošlo k tomuto ději, nejedná se o danou krevní skupinu. •Výsledek: Pokud došlo k aglutinaci, tj srážení krvinky s protilátkami za vzniku aglutinátu, jde o danou krevní skupinu. Pokud nedošlo k tomuto ději, nejde o danou krevní skupinu. Při hodnocení brát v úvahu výskyt recesivních alel. •Vyhodnocení: •Vyhodnotíme citlivost reakce, tj. uvedeme, při kterém ředění byla reakce ještě pozitivní. Používáme hodnocení na čtyři křížky: •++++ (100% aglutinace) aglutinát se po protřepání vůbec nerozpadá +++ (75 %) ++ (50 %) + (25 %) 0 (bez aglutinace) lze snadno roztřepat až na původní erytrocytární suspenzi •Krev patří do skupiny…. Vzorky krve s protilátkami a výsledky srážení srážení srážení Vytvoření krevního roztěru: Barvení krevních roztěrů Na podložní sklíčko nakápneme kapku nesražené krve a dalším sklíčkem s nenabroušenými hrany krev rozetřeme v úhlu asi 45⁰ V poslední době je na trhu několik typů tzv. souprav pro rychlé bavení, které jsou sice mnohem pohodlnější z hlediska vlastní manipulace i časové úspory, výsledky barvení však jsou zpravidla o něco horší (např. granula nejsou tolik výrazná, celkový odstín je našedlý apod.) Může tak snáze dojít k záměně např. neutrofilu za eozinofil apod. Ve cvičeních budeme používat sadu pro rychlé barvení Leukodif (Pliva Lachema a.s.). Barvení sestává ze 4 kroků a každý krok je tvořen sérií (v tabulce uvedena v závorce) několika ponoření do patřičného roztoku. Nátěr vždy ponoříme jen na dobu 1 sekundy do patřičného roztoku podle následujícího předpisu: 1. Fixace v methanolu (5 x 1s) 2. Kyselé barvení v Eosinu (3 x 1s) 3. Zásadité barvení v Azuru (5 x 1s) 4. Opláchnutí ve stabilizačním pufru (PBS). Poté necháme usušit a hodnotíme. leukocyty tyčka (prekurzor neutrofilu) 1-2 % neutrofil 55-60 % eozinofil 2-3 % bazofil 0,5 % monocyt 5-7 % lymfocyt 30-40 % neutrofil tyčka lymfocyt monocyt eosinofil bazofil neznámý suma 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 100 Krevní diferenciál U zdravého jedince by měl být výsledek následující: Zjištěné počty buněk se zapisují do speciální tabulky (viz dále). Zápis do tabulky TEORIE Aglutinace (shlukování) krvinek Reakce antigen-protilátka. Membrány erytrocytů – mohou mít antigen – aglutinogen A nebo B (mukopolysacharidy). Reaguje s protilátkou v plazmě – aglutininem anti-A (a.&) nebo aglutininem anti-B (a.ß) (oba γ-globuliny). U jednoho jedince není nikdy stejný aglutinogen a antiaglutinin. Krev člověka: 4 základní skupiny (podle aglutinogenu v membránách). Krvinky 0 (bez antigenu) shlukují A,B krvinky A shlukuje B a 0, krvinky B shlukuje A a 0, krvinky AB nemají protilátky. krev skup Podskupiny A1 – A6, další aglutinogeny D(Rh) – systém 13 a-genů (C,D,E aj.). Nejvíce antigenní D. D přítomen = Rh +. Aglutininy anti-D normálně nejsou přítomny, tvoří se při setkání s krví Rh+. Dědičnost krevních skupin. Krevní skupiny u zvířat: více než u lidí. Vznik antigenů před vývojem primátů. Známy i u slepic, kachen, králíků, koz. Neidentifikovány u morčat, myší, koček a poikilotermů. Mezitaxonová aglutinace D:\Dokumenty\DISKC\Dokumenty\Pajdák\fyziol predn\krev\krev skup.bmp