ÚVOD Tento učební text je určen posluchačům Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně, kteří si zapsali cvičení „Biotechnologie léčiv" nebo cvičení „Speciální praktikum z farmakogenomiky", případně seminář „Metody molekulární biologie" a všem ostatním studentům, kteří mají zájem se seznámit s praktickými aplikacemi biotechnologií ve farmaceutických oborech. Skripta budou využita také při vypracování diplomových prací na ústavech Farmaceutické fakulty Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Cílem skript je poskytnout návody k vybraným praktickým aplikacím a metodám užívaným v základním i aplikovaném výzkumu při vývoji molekulárních diagnostických metod a výrobě biotechnologických preparátů. Jelikož se jedná o návody, ke konkrétním úlohám, které budou studenti provádět přímo v rámci praktických cvičení, je text, kromě v literatuře obvykle podávaných informací, doplněn i řadou praktických poznámek blíže osvětlujících provedení jednotlivých částí úlohy. Na druhé straně je však řada kroků v pracovních postupech formulována tak, aby návod vedl studenty k jejich promyšlení a dopracování. Je proto nutné text v rámci přípravy důkladně prostudovat, vyhledat příslušné veličiny pro výpočet doplňkových příkladů a podrobně promyslet jednotlivé kroky návodu. Pro úspěšné zvládnutí jak teoretických základů, tak i praktického provedení metody je nutné vždy prostudovat všechny pasáže příslušející k dané úloze. Nezbytnou podmínkou je také účast na příslušných přednáškách z „Biotechnologie léčiv" a „Farmakogenomiky" nebo na semináři „Metody molekulární biologie". Co se týče znalostí a dovedností požadovaných pro provedení té které metody, jsou dosavadní laboratorní návyky studentů postačující. Pokud jsou v metodě používány speciální přístroje (například termocykler), budou studentům nezbytné kroky pro jejich ovládání vysvětleny přímo v laboratoři. Metody uvedené ve skriptu jsou voleny a upraveny tak, aby jejich rozhodující část bylo možné zvládnout v rámci tří vyučovacích hodin. Proto jsou některé kroky oproti běžně používaným postupům při vědecko-výzkumné práci zjednodušeny a zkráceny. 1 2 OBSAH Informační panel A - Tabulka standardního genetického kódu..................................................4 Informační panel B - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech................................5 Cvičení č. 1 Izolace genomové DNA z krve............................................................................6 Cvičení č. 2 Izolace genomové DNA z rostlinných buněk....................................................10 Cvičení č. 3 Izolace plasmidové DNA...................................................................................14 Cvičení č. 4 Odhad koncentrace a čistoty DNA na agarózovém gelu....................................18 Cvičení č. 5 Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky..............................22 Cvičení č. 6 Restrikční štěpení plasmidové DNA..................................................................24 Cvičení č. 7 Stanovení genetické modifikace ac2 u Solárium tuberosum..............................28 Cvičení č. 8 Detekce delece A32 v receptoru CCR5 metodou PCR......................................32 Cvičení č. 9 Detekce delece v genu pro angiotensin konvertující enzym metodou PCR......36 Cvičení č. 10 Detekce polymorfismu K469E v genu ICAM1..................................................40 Cvičení č. 11 Detekce polymorfismu 1007fs v genu NOD2....................................................44 Cvičení č. 12 Detekce polymorfismu v genu pro TMPT (thiopurin S-methyl transferáza) metodou real-time PCR......................................................................................48 Cvičení č. 13 Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu......................................52 Cvičení č. 14 Izolace DNA z agarózového gelu.......................................................................56 Cvičení č. 15 Izolace RNA z myší tkáně..................................................................................58 Cvičení č. 16 Zpětná transkripce a příprava cDNA genu pro G3PDH.....................................62 Cvičení č. 17 Příprava rekombinantního genu pro lidský leptin amplifikací...........................66 Cvičení č. 18 Simultánní štěpení amplikonu a vektoru............................................................70 Cvičení č. 19 Ligace vektoru a naštěpené DNA.......................................................................74 Cvičení č. 20 TA klonování amplifikačních produktů.............................................................78 Cvičení č. 21 Transformace bakteriálních buněk Escherichia coli..........................................82 Cvičení č. 22 Exprese rekombinantního proinsulinu...............................................................88 Cvičení č. 23 Elektroforéza proteinů v polyakrylamidovém gelu............................................92 Cvičení č. 24 Western Blot.......................................................................................................98 Cvičení č. 25 Výsledky příkladů............................................................................................101 3 Informační panel A - Tabulka standardního genetického kódu kodony první nukleotid druhý nukleotid třetí nukleotid U C A G U Phe (F) Ser (S) Tyr(Y) Cys (C) U Phe (F) Ser (S) Tyr(Y) Cys (C) C Leu (L) Ser (S) terminace terminace nebo SeCys A Leu (L) Ser (S) terminace Trp (W) G C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C Leu (L) Pro (P) Gin (Q) Arg (R) A Leu (L) Pro (P) Gin (Q) Arg (R) G A Ile (I) Thr (T) Ans (N) Ser(S) U Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser(S) C Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A Met nebo iniciace Thr (T) Lys (K) Arg (R) G G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G Tučně jsou vyznačeny kodónové rodiny 4 Informační panel B - Základní data o nukleových kyselinách a proteinech Počet částic v jednom molu = 6,023 x 10 Průměrná molekulová hmotnost páru bazí v DNA = 650 Průměrná molekulová hmotnost bazí v RNA = 360 Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny =110 | Pro dsDNA když A2ôo = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace dsDNA = 50 [ig/ml = 0,15_mM | Pro ssDNA když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssDNA = 33 (J,g/ml = 0,10_mM I Pro ssRNA když A260 = 1,0 v 1 cm kyvetě, pak koncentrace ssRNA = 40 (J,g/ml = 0,1 lmM Molekulová hmotnost dsDNA = (počet bp) x 650 Počet molů konců dsDNA = 2 x (hmotnost DNA v gramech) / (molekulová hmotnost) Počet molů konců vytvořených restrikčním štěpení a) kružnicová DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) b) lineární DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) + 2 x (moly DNA) ljig DNA o délce 1 000 bp = 1,5 pmol = 9,1 x 1011 molekul lHg DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 molekul ljig DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 molekul lHg DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011 molekul ljig DNA fága X (délka 48 502 bp) = 0,03 pmol = 1,8 x 1010 molekul 1 pmol DNA o délce 1 000 bp = 0,66 ng 1 pmol DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 1,77 ng 1 pmol DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 2,88 ng 1 pmol DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 4,78 ng 1 pmol DNA fága X (délka 48 502 bp) = 32,01 ng DNA o délce 1,0 kb má kódovací kapacitu 333 aminokyselin = protein o M = 37 000 Protein o M = 10 000 může být kódován DNA o velikosti 270 bp Protein o M = 50 000 může být kódován DNA o velikosti 1,55 kb 5 Izolace genomové DNA z krve (cvičení č. 1) Úvodní slovo Metody izolace DNA sestávají obecně ze tří základních kroků: 1) Odbourání buněčné stěny a membrány, neboli lyže buněk 2) Oddělení DNA od ostatních nízko a vysokomolekulárních struktur 3) Úprava vzorku a jeho uchování Při izolaci DNA ze živočišných buněk odpadává odbourávání buněčné stěny, což je naopak krok nejobtížnější například u rostlin či hub nebo u některých bakterií. Každé rozrušení buněčných stěn a membrán však musí být provedeno šetrně tak, aby docházelo k co nejmenšímu poškození nukleových kyselin. K lyži buněk lidské krve postačuje působení detergentů, z nichž nejčastěji se používá dodecylsulfát sodný (SDS). Odstranění proteinů se provádí působením proteáz, v některých laboratořích ještě dnes již poněkud zastaralé metody vytřepávání ve směsi fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu. Ribonukleové kyseliny, které se v ethanolu nebo izopropanolu srážejí spolu s DNA, lze odstranit působením enzymu RNázy. Je možné též použít diferenciální precipitace v chloridu litném. Dodatečná purifikace může zahrnovat dělení nukleových kyselin na hydroxyapatitu nebo usazování jejich v gradientu chloridu česného. Moderní metody purifikace DNA zahrnují použití různých sorbentních materiálů, které váží makromolekuly s různou afinitou. Tyto techniky jsou pak užívány ve většině dostupných komerčních souprav. Ke krátkodobému uchování izolované DNA postačují teploty 4-8 °C, po dobu několika měsíců je možné DNA skladovat při -20 °C, k dlouhodobému uchovávání se doporučuje teplota -80 °C. Jako skladovací médium slouží voda, TE pufr nebo může být DNA uchovávána po vysrážení v 70% ethanolu. Komerční souprava společnosti QIAGEN (QiaQuick Blood DNA Isolation Kit), která bude použita v tomto cvičení, je určena pro izolaci DNA z různých tělních tekutin. Je založena na principu vysoce účinné lyže proteázou, sarkosylem a chaotropními ionty. Uvolněná DNA je poté vázána na sorbentní materiál, ze kterého je po pročištění uvolněna působením roztokem s vysokou iontovou silou. Soupravou je možno z 200 (ll plné krve získat 3-12 (ig DNA. Spolu s DNA je současně izolována i RNA. Ta může interferovat v některých následných reakcích, ale není tomu tak při polymerázové řetězové reakci (PCR). Je-li pro další zpracování izolátu nutné odstranit RNA, je to možné provést působením RNázy A, která je součástí výše uvedené soupravy. Cíl cvičení Izolovat chromosomální DNA ze vzorku lidské krve. Seznam přístrojů • vodní lázeň nebo suchý blok • třepačka Vortex • centrifuga na l,5ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) • pikofuga na l,5ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm • sada pipet o objemech 20, 200 a 500 (ll • kuchyňské minutky 6 Vlastní pracovní postup Odběr krve Krev musí být odebrána do média, které obsahuje protisrážlivé látky, např. citronan sodný nebo EDTA. Není možné použít heparin, který inhibuje PCR ! Než začnete izolaci • nastavte teplotu ve vodní lázni nebo suchém bloku na 56 °C, • vzorky krve temperujte na laboratorní teplotu (15 až 25 °C), při které probíhá izolace, • otevřete krabičku s komerční soupravou a zkontrolujte neporušenost lahviček • vytemperujte pufr AE na laboratorní teplotu, • připravte pufry AW1, AW2 a Proteázu podle instrukcí uvedených na příslušných lahvičkách, • zkontrolujte pufr AL, případnou sraženinu rozpusťte při 56 °C. Bezpečnostní opatření! • po celou dobu izolace mějte nasazené jednorázové plastové rukavice, protože pracujete s potenciálně infekčním materiálem, • dodržujte pravidla bezpečnosti práce předepsaná pro laboratoř, • jakékoli zranění hlaste vedoucímu cvičení. Vlastní izolace 1) Na dno 1,5 ml mikrozkumavky napipetujte 20 (ll QIAGEN Proteázy. 2) Přidejte 200 (ll plné krve, plasmy, séra nebo jiné tělní tekutiny nebo asi 5 x 106 lymfocytů. 3) Pokud je třeba odstranit RNA, přidejte 4jul roztoku „RNase A stock solution" (Koncentrace 100 mg/ml). 4) Přidejte 200 (ll pufru AL a dobře promíchejte vortexováním po dobu 15 s. Výsledná směs musí být homogenní, aby byla zajištěna dostatečná lyže buněk ve vzorku. 5) Inkubujte homogenát při 56 °C po dobu 10 min. V tomto kroku dochází k dokonalému rozložení všech buněčných struktur ve vzorku. 6) Zkumavku krátce centrifugujte na pikofuze, aby došlo k sedimentaci na víčku sražených vodních kapek. Mohly by způsobit kontaminaci vzorku při otevírání zkumavky. 7) Ke vzorku přidejte 200 (ll ethanolu (96 - 100%) a dobře promíchejte vortexováním po dobu 15 s. Poté opět směs krátce centrifugujte na pikofuze, aby došlo k sedimentaci tekutiny usazené na víčku. Po přidání ethanolu dochází k vysrážení nukleových kyselin. 8) Přeneste směs na kolonku „QIAamp Spin Column", která obsahuje sorbentní materiál pro zachycení vysrážené DNA. Kolonka je opatřena 2,0 ml sběrnou zkumavkou. Dávejte pozor, abyste se rukavicemi, špičkou pipety nebo jinak nedotkli okraje kolonky, mohli byste si zkontaminovat vzorek. Uzavřete kolonku víčkem a centrifugujte při 6 000 g (asi 8 000 rpm) po dobu 1 minuty. Při centrifugaci musí být kolonka uzavřena víčkem pro zabránění vzniku aerosolu. 9) Po centrifugaci odstraňte zkumavku s filtrátem a přeneste kolonku do nové čisté 2,0ml zkumavky. 10) Opatrně otevřete kolonku a napipetujte 500 (ll pufru AW1 aniž byste se dotkli okraje kolonky. Uzavřete kolonku víčkem a centrifugujte při 6 000 g (asi 8 000 rpm) po dobu 1 min. Pufr AW1 obsahuje ethanol, který zabrání uvolnění vysrážené DNA z filtru, ostatní příměsi jsou pufrem AW1 z filtru vymývány. 11) Po centrifugaci odstraňte zkumavku s filtrátem a přeneste kolonku do nové čisté 2,0 ml zkumavky. 7 12) Opatrně otevřete kolonku a napipetujte 500 (íl pufru AW2 aniž byste se dotkli okraje kolonky. Uzavřete kolonku víčkem a centrifugujte při maximálních otáčkách (20 000 g, asi 14 000 rpm) po dobu 3 min. Pufr AW2 obsahuje podobně jako pufr AW1 ethanol, který zabrání uvolnění vy srážené DNA z filtru, ostatní příměsi jsou pufrem AW2 z filtru vymývány. 13) Po centrifugaci odstraňte zkumavku s filtrátem a přeneste kolonku do další nové čisté 2,0 ml zkumavky a ještě jedenkrát centrifugujte při maximálních otáčkách (20 000 g, asi 14 OOOrpm) po dobu 1 min. Centrifugaci dojde k vysušení kolonky a k dokonalému odstranění pufru AW2, jehož zbytky by mohly v následujícím kroku kontaminovat izolát DNA a poté interferovat při následných manipulacích s DNA. 14) Po centrifugaci odstraňte zkumavku s filtrátem a kolonku umístěte do nové čisté 1,5 ml mikrozkumavky. 15) Opatrně otevřete kolonku a napipetujte 200 (ll elučního pufru AE, inkubujte při laboratorní teplotě po dobu 1 min. a poté centrifugujte při 6 000 g (asi 8 000 rpm) po dobu 1 min. V tomto kroku dojde k uvolnění DNA z filtru, a ta se objeví v roztoku na dně zkumavky. Odstraňte kolonku, uzavřete l,5ml mikrozkumavku a popište ji, obsahuje vámi izolovanou DNA. 16) Uskladněte izolovanou DNA při -20 °C. Její koncentraci je možné změřit na spektrofotometru a opticky zkontrolovat elektroforézou v agarózovém gelu. Poté může být použita k dalším manipulacím, například k provedení PCR. Další informace k této problematice najdete v Marmur 1961: A proceduře for isolation of DNA from microorganisms. Journal of Molecular Biology 3, 208-218. Jedná se o první článek, ve kterém jsou popsány základní principy izolace DNA. Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press Jedná se o laboratorní manuál, ve kterém jsou popsány základní metody molekulární biologie. 8 Kontrolní otázky a příklady 1) Jestliže v jednom mililitru lidské krve je obsaženo približne 4 až 10 milionů leukocytu, kolik ug DNA je možno maximálně izolovat z 200 ul plné krve? Přitom jeden leukocyt obsahuje DNA o celkové délce 3,2 miliardy bp, a že průměrná molekulová hmotnost jednoho bp je 650. 2) Jakou hmotnost má lidský chromozóm č. 3, u něhož bylo zjištěno celkem 206,7 milionu párů nukleotidů? 3) Kolik molekul lidského chromozómu č. 1 by bylo obsaženo v 1 (ig DNA? Délka tohoto největšího lidského chromozómu je přitom přibližně 223,7 milionu párů nukleotidů. 4) Jak dlouhý je v lineárním stavu lidský chromozóm č. 1? Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm. 9 Izolace genomové DNA z rostlinných buněk (cvičení č. 2) Úvodní slovo Při izolaci DNA z rostlinných buněk je zapotřebí kompletní a rychlé rozbití výchozího materiálu. To zajistí vysoké výtěžky DNA a její degradaci působením vnitrobuněčných nukleáz. K izolaci DNA je možno použít jakýkoli rostlinný materiál, nejvhodnější jsou však měkké tkáně, zejména rychle rostoucí klíčky rostlin, které obsahují velké množství genetického materiálu, mají méně polysacharidu a polyfenolů a buňky mají tenké buněčné stěny. Rozbití buněčné stěny rostlinných buněk se provádí zpravidla mechanicky třením tkáně v třecí misce s přídavkem čistého mořského písku, použitím různých typů homogenizátorů nebo působením nárazů při protřepávání tkáně se skleněnými kuličkami (doporučený průměr kuliček je 5 mm). Existují také metody při kterých je buněčná stěna rozrušena působením celulolytických enzymů. Mechanickou homogenizaci rostlinné tkáně je možné provést buďto v čerstvém stavu nebo po jejím zmrazení v tekutém dusíku. Po homogenizaci je materiál zpracován enzymy nebo chemikáliemi podobně jak je to uvedeno v návodu ke cvičení č. 1. Komerční souprava společnosti QIAGEN (DNeasy Plant Mini Kit), která bude použita v tomto cvičení, je určena pro izolaci DNA ze všech typů rostlinných tkání včetně tvrdých semen a pro izolaci DNA z hub. Umožňuje izolaci až ze 20 mg suchého materiálu nebo 100 mg čerstvých tkaniv. Uvolněná genomová, mitochondriová a chloroplastová DNA je vázána na sorbentní materiál, ze kterého je po pročištění uvolněna působením roztoku s nízkým obsahem solí nebo vodou. Izolovaná DNA je fragmentovaná na úseky o velikosti až 40 kbp, převážně ale na fragmenty o velikosti 20-25 kbp. Maximální množství DNA, kterou lze tímto způsobem izolovat je 50 [ig. Sorbentní materiál zajišťuje kompletní odstranění všech inhibitorů PCR a jiných enzymatických reakcí. DNA je použitelná pro PCR, RAPD, AFLP, RFLP, blotting, analýzu mikrosatelitní DNA, SNA-genotypizaci, real-time PCR. Cíl cvičení Izolovat celkovou DNA ze vzorku tkáně bramboru Solanum tuberosum. Seznam přístrojů • nádoba s tekutým dusíkem • analytické váhy s přesností na mg • třecí miska s tloučkem • vodní lázeň nebo suchý blok • nádoba s ledem • třepačka Vortex • centrifuga na l,5ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) • pikofuga na l,5ml mikrozkumavky s otáčkami do 6 000 rpm • sada pipet o objemech 20, 200 a 500 (ll • kuchyňské minutky • referenční mikrozkumavka - zkumavka s vyznačenými objemy 10 Vlastní pracovní postup Než začnete izolaci • nastavte teplotu ve vodní lázni nebo suchém bloku na 65 °C, • otevřete krabičku s komerční soupravou a zkontrolujte neporušenost lahviček, • vytemperujte pufr AE na laboratorní teplotu, • pufry AW a AP3/E jsou dodávány jako koncentráty. Před prvním použitím k nim přidejte ethanol (96%) v množství předepsaném výrobcem, • zkontrolujte pufry API a AP3/E (před přidáním ethanolu), případnou sraženinu rozpusťte při 65 °C. Po přidání ethanolu už není možno pufr AP3/E zahřívat ! Příprava rostlinného materiálu • Pokud máte jako výchozí materiál čerstvé listy, pak je nastříhejte na co nejjemnější části a navažte 100 mg do třecí misky • Pokud jsou výchozím materiálem pro izolaci bramborové hlízy, resp. klíčky z hlíz, pak skalpelem nařežte a navažte 100 mg materiálu do třecí misky • V případě suchého materiálu navažte pouze 20 mg vzorku Pokud odeberete větší množství materiálu, nebude lyže účinná a výtěžek DNA bude oproti vašemu očekávání nižší. Menší odebrané množství znamená, že kapacita sorbentního materiálu nebude využita. Odebraný materiál můžete zmrazit v tekutém dusíku a skladovat při -80 °C. Podobně je možno při této teplotě skladovat i vzorky rostlinného materiálu v suchém stavu. Pokud chcete vzorky uchovávat při laboratorní teplotě 15-25 °C, pak musí být do 24 hodin po odebrání lyofilizovány. Bezpečnostní opatření! • pozor na tekutý dusík, jeho teplota je -195,8 °C ! Při manipulaci s ním použijte ochranné rukavice, • po celou dobu izolace mějte nasazené jednorázové plastové rukavice, nukleázy z vašich rukou by mohly zničit izolovanou DNA, • dodržujte pravidla bezpečnosti práce předepsaná pro laboratoř, • jakékoli zranění hlaste vedoucímu cvičení. Vlastní izolace 1) Rozdrťte rostlinnou tkáň v tekutém dusíku za použití třecí misky s tloučkem. 2) Přeneste homogenizovanou tkáň do l,5ml mikrozkumavky a nechejte tekutý dusík odpařit. Dříve než se tkáň rozpustí přejděte rychle k dalšímu kroku. 3) K homogenátu nepipetujte 400 [ú pufru API (obsahuje detergenty) a4[il roztoku RNázy A (100 mg/ml). 4) Intenzívně vortexujte. Ve zkumavce nesmíte vidět žádné shluky buněk, ty by v dalších krocích nebylo možno dobře zlyzovat v důsledku čehož byste získali menší množství DNA. Shluky buněk můžete rozbít také opakovaným protahováním suspenze špičkou pipety. 5) Inkubujte směs v suchém bloku při teplotě 65 °C po dobu 10 min. Během inkubace 2-3x promíchejte převrácením zkumavky. V tomto kroku dojde ke kompletní lyži buněk. 6) Jestliže asi po 10 minutách inkubace nedošlo ke kompletní lyži, centrifugujte lyzát při 20 000 g po dobu 5 min. a lyzát ve formě supernatantu přeneste do nové l,5ml mikrozkumavky. 7) Přidejte 130 [ú pufru AP2, promíchejte několikerým převrácením zkumavky a inkubujte 5 min. na ledu. V tomto kroku dojde k vysrážení detergentu, proteinů a polysacharidu. 11 8) Centrifugujte lyzát při 20 000 g po dobu 5 min. Některé druhy rostlinného materiálu tvoří velmi viskózni lyzáty a velká množství precipitátu. To má za následek lámání DNA v dalších krocích. Proto je vhodné odstranit sraženinu centrifugací. 9) Aplikujte lyzát na kolonku QIAshredder Mini Spin Column (má fialovou barvu) a centrifugujte při 20 000 g po dobu 2 min. Na kolonce dojde k zachycení většiny precipitátu a buněčných zbytků. Malé množství ale může protéct do jímací zkumavky, kde se usadí ve formě peletu na dně. Nezviřte tuto usazeninu během následujícího kroku. 10) Přeneste najímanou frakci do nové l,5ml mikrozkumavky, aniž byste zvířili usazeninu. Zpravidla je možno odebrat 450 [ú lyzátu, objem změřte pomocí referenční mikrozkumavky. 11) Podle změřeného množství odebraného lyzátu přidejte 1,5 objemu pufru AP3/E a promíchejte pipetováním. Například ke 450 [ú odebraného lyzátu přidejte 675 [ú pufru AP3/E. V tomto kroku dochází působením ethanolu k vysrážení nukleových kyselin. Po smíchání může dojít ke vzniku sraženiny, která ale neovlivní další purifikační kroky. 12) Přeneste 650 [ú směsi z kroku 11) včetně případné sraženiny do kolonky DNeasy Mini Spin Column. Centrifugujte při více než 6 000 g po dobu 1 min. a odstraňte proteklou fázi. Jímací zkumavku použijte v dalším kroku. V tomto kroku se DNA naváže na membránu v kolonce. 13) Opakujte krok 12) se zbytkem lyzátu. 14) Umístěte kolonku DNeasy Mini Spin Column do nové jímací mikrozkumavky. 15) Do kolonky nalijte 500 [ú pufru AW, centrifugujte při více než 6 000 g po dobu 1 min. a odstraňte proteklou fázi. Jímací zkumavku použijte v dalším kroku. 16) Do kolonky nalijte 500 [ú pufru AW, centrifugujte při 20 000 g po dobu 2 min. Odstraňte proteklou fázi i jímací zkumavku. V tomto kroku dojde k vysušení membrány v kolonce. Vysušení membrány je nezbytné proto, aby byl odstraněn zbylý ethanol, který by interferoval s následnými reakcemi. 17) Umístěte kolonku DNeasy Mini Spin Column do nové jímací l,5ml mikrozkumavky. 18) Do kolonky napipetujte 100 [ú pufru AE, pipetujte přímo na membránu. 19) Inkubujte při laboratorní teplotě (15-25 °C) po dobu 5 min. Tím dojde k nasycení membrány a uvolnění na ní navázané DNA. 20) Eluujte DNA centrifugací při více než 6 000 g po dobu 1 min. V tomto kroku dojde k uvolnění DNA z membrány. DNA se objeví v roztoku na dně zkumavky. Odstraňte kolonku, uzavřete l,5ml mikrozkumavku a popište ji, obsahuje vámi izolovanou DNA. 21) Uskladněte izolovanou DNA při -20 °C. Další informace k této problematice najdete v QIAGEN 2004: DNeasy Plant Mini and DNeasy Plant Maxi Handbook. QIAGEN 01/2004. Slater A., Scoty N. a Fowler M. 2003: Plant biotechnology. The genetic manipulation of plants. Oxford University Press. 12 Kontrolní otázky a příklady 1) Doplňte následující tabulku týkající se genomové DNA různých organismů Organismus Velikost DNA Molární Hmotnost 1 Počet molekul (bp) hmotnost molekuly vlg Člověk 3,2 x 10y Drosophila 1,2 x 10s Saccharomyces 1,6 x 10v cerevisiae Escherichia coli 4,0 x 10b Bakteriofág X 48 514 Zea mays 3,9 x 10y Poznámka Molekulová hmotnost jednoho páru bazí M (lbp) = 660. 2) Genom buňky húseničku, Arabidopsis thaliana, obsahuje v haploidní sadě 7,0 x 10 bazí. Jakou hmotnost má genom 100 000 diploidních buněk této rostliny ? 3) Jak dlouhý by byl chromozóm, který by obsahoval veškerou genomovou DNA tabáku (Nicotiana tabacum), která obsahuje 4,8 x 109 párů bazí? Připomeňme si, že vzdálenost mezi dvěma páry bazí je 0,34 nm. 13 Izolace plasmidové DNA (cvičení č. 3) Úvodní slovo Plasmidy jsou extrachromosomální kružnicové molekuly dvoušroubovicové DNA o velikostech 1 000 až 200 000 bp. Vyskytují se téměř ve všech bakteriálních rodech, jak grampozitivních tak gramnegativních, v kvasinkách i u některých vyšších eukaryot. Většinou jsou ale schopny se replikovat pouze v úzce vymezeném okruhu hostitelských buněk. Na rozdíl od chromozómů nesou pouze geny kódující druhotné znaky, např. rezistence k různým antibiotikům, které buňce pomáhají přežít za nestandardních podmínek. Jiné geny kódují rezistenci k toxickým látkám, produkci enterotoxinů, kolicinů, restrikčních a modifikačních enzymů, nebo schopnost degradovat komplexní organické sloučeniny. Plasmidy Plazmidy se replikují nezávisle na replikaci chromosomální DNA. Jejich replikační cyklus může, ale nemusí být s replikací bakteriálního chromozómu a s cyklem buněčného dělení synchronizován. V takovém případě může počet plasmidů v buňce dosáhnout až několika set kopií. Tyto plasmidy jsou vhodné pro genové inženýrství, protože mohou být z buněk izolovány ve velkých množstvích. Všechny plasmidy, v současné době používané ke klonování, jsou oproti přirozeným plasmidům upravené. O tom, zdali je plasmid pro klonování vhodný, rozhoduje především velikost. Je-li plasmidplazmid malý, dokáže účinně transformovat buňku. Vedle toho musí být plasmid v buňce stabilní a vyskytovat se v buňce ve vysokém počtu kopií, což umožňuje dosáhnout dostatečně vysoký výtěžek. Komerčně dostupné plasmidy používané v genovém inženýrství obsahují tři důležité sekvence: a) Počátek replikace, místo ori, který je podmínkou produkce nových kopií. Kromě toho většina moderních plasmidů (ty, které se v buňce vyskytují v nízkém počtu kopií) nese také lokus par, který zajišťuje rozdělení jednotlivých kopií plasmidů do dceřinných buněk během dělení. b) Selekční znak, který zajišťuje zvýhodněný růst transformovaných bakterií. I za optimálních podmínek je totiž plasmid vnesen pouze do malé části buněčné populace. Proto je třeba vyvinout selekční tlak pro podporu růstu těchto buněk. Pro tento účel bývá zpravidla použit gen, jenž se fenotypově projevuje jako dominantní rezistence k určitému antibiotiku. Nejčastěji se používají geny zodpovědné za rezistenci k ampicilinu. c) Klonovací místo, umožňující vložit do plasmidů fragment cizorodé DNA. Klonování místo je úsek DNA, umístěný mimo ostatní důležité sekvence a obsahuje rozpoznávací sekvenci pro jednu nebo více restrikčních endonukleáz (v tomto případě se označuje jako „polylinker"). Tato reštrikční místa jsou obsažena v plasmidů v jediném exempláři, což zaručuje možnost inzerce dalšího úseku DNA, aniž by byl porušen některý jiný úsek důležitý pro replikaci plasmidů. V současné době jsou polyklonovací místa konstruována tak, aby byla zajištěna dostatečná flexibilita pro klonováni různých fragmentů DNA. Navíc bývají v těsném sousedství polyklonovacích míst vloženy sekvence pro analýzu správnosti vložených fragmentů. V závislosti na průběhu izolace je možno naizolovat různé formy plasmidové DNA: V nativním stavu v buňce se plasmid vyskytuje v nadšroubovicové formě označované jako CCC-forma (covalent closed circle). Pokud jsou všechny izolované molekuly v CCC-formě, pak byla izolace ideální. Pokud dojde k přerušení jednoho řetězce DNA, pak se plasmid 14 rozvine do podoby otevřené kružnice, tzv. OC-formy (open circle). Po přerušení obou řetězců vzniká linearizovaná molekula plasmidové DNA, tzv. L-forma. Protože se CCC-forma plasmidu chová v elektrickém poli jako tyčka, putuje tato forma nejrychleji ze všech uvedených. Pomaleji se pohybuje OC-forma a nejpomaleji forma linearizovaná. V praxi získáváme zpravidla při bezproblémovém průběhu izolace plasmidové DNA největší podíl CCC-forem a malé množství L-forem. Formu OC a L je na elektroforetickém gelu nesnadné rozlišit, pohybují se podobnou rychlostí. Často pozorujeme komplexy nadšoubovicových struktur a potom hovoříme o dimerech, tetrametrech atd. Ty se pochopitelně pohybují v elektrickém poli pomaleji než výše uvedené struktury. V izolátech plasmidů se vyskytují i zbytky chromosomální DNA, která nebyla dostatečně odstraněna. Výjimečně je možné pozorovat na gelu i denaturované molekuly plasmidové DNA. Ty se pohybují ještě rychleji než CCC-formy. K denaturaci plasmidové DNA ale dochází pouze v případě, že složení izolačních roztoků nebylo správně nastaveno, zejména při pH lyzačního roztoku vyšším než 12,45. Denaturovaná DNA je nevhodná pro další práci. Standardní postup izolace plasmidové DNA sestává ze čtyř základních kroků: 1) V prvním jsou bakteriální buňky homogenizovaný a je odstraněna jejich buněčná stěna působením vhodných enzymů, například lysozymu pro Escherichia coli, lysostaphinu pro stafylokoky, apod. Vedle toho se používá proteináza K, enzym, který rozkládá proteinovou složku buněčné stěny. 2) Ve druhém kroku dojde k lyži cytoplasmatické membrány působením detergentů, zpravidla dodecylsulfátu sodného a uvolnění vnitřního obsahu buňky do vysoce alkalického prostředí. Alkalita roztoku, pH 12,45, zajistí denaturaci všech nukleových kyselin a proteinů. 3) Ve třetím kroku následuje prudké snížení pH na hodnoty kolem 7,0. Dojde k vysrážené proteinů a zbytků buněčných stěn. Dlouhá vlákna chromosomální DNA nestačí reasociovat a stanou se součástí této sraženiny. Naproti tomu malé molekuly plasmidové DNA zůstávají i při denaturaci v podmínkách pH = 12,45 vzájemně propojeny a při prudkém snížení pH znovu reasociují za vzniku kompaktních struktur. 4) V dalším kroku následuje oddělení sraženiny od reasociovaných molekul plasmidové DNA vysokoobrátkovou centrifugací. Plasmid je potom z výsledného roztoku purifikován na chromatografické koloně a vysrážen ethanolem. Komerční souprava společnosti EPPENDORF (FastPlasmid Mini Kit), která bude použita v tomto cvičení, je určena pro izolaci plasmidové DNA z 1,5 až 3,0 ml buněčné suspenze bakterií Escherichia coli. V metodě jsou roztoky používané ve výše uvedených krocích jednotlivě spojeny do jednoho roztoku. Poté, co jsou buňky zlyzovány se plasmidy naváží na pevnou fázi, ze které je purifikovaná DNA po promytí izopropanolem eluována pufrem s nízkou iontovou silou. Izolovanou DNA je možné použít pro všechny následné metody genového inženýrství. Cíl cvičení Izolovat plasmidovou DNA z bakteriální suspenze Escherichia coli. Seznam přístrojů • nádoba s ledem • třepačka Vortex • centrifuga na l,5ml mikrozkumavky s otáčkami do 14 000 rpm (20 000 g) • sada pipet o objemech 20, 200 a 500 (ll 15 Vlastní pracovní postup Než začnete izolaci • Před prvním použitím nové soupravy připravte promývací roztok přidáním izopropanolu do nádoby s nápisem „Wash Buffer", množství isopropanolu přidejte podle zadání výrobce. Řádně protřepejte a označte, že v nádobě už je izopropanol. • vychlaďte „Complete Lysis Solution" na ledu. Pokud nebyl roztok skladován v lednici při 4 °C, chlaďte po dobu alespoň 15 min. Bezpečnostní opatření! • po celou dobu izolace mějte nasazené jednorázové plastové rukavice, nukleázy z vašich rukou by mohly zničit izolovanou DNA, • dodržujte pravidla bezpečnosti práce předepsaná pro laboratoř, • jakékoli zranění hlaste vedoucímu cvičení. Vlastní izolace 1) Napipetujte 1,5 ml čerstvě narostlé bakteriální kultury do 2,0ml mikrozkumavky a centrifugujte buňky při 6 000 g při laboratorní teplotě po dobu 1 min. 2) Odstraňte supernatant pipetou tak, abyste nezvířili sediment. 3) Osušte mikrozkumavku pomocí buničité vaty. 4) Přidejte 400 [ú na ledu vychlazeného „Complete Lysis Solution". 5) Řádně promíchejte vortexováním po dobu 30 sekund. Na konci vortexování musí být všechny buňky kompletně zlyzovány. Jakékoli nehomogenizované shluky buněk snižují výtěžek plasmidové DNA, protože se k nim nedostanou všechny chemikálie a lyže je neúplná. 6) Inkubujte lyzát při laboratorní teplotě po dobu 3 min. Lyzát se projasní a bude neviskózní. 7) Přepipetujte nebo přelijte lyzát do kolonky s filtrem „Spin Column Assembly". 8) Centrifugujte při 14 OOOg při laboratorní teplotě po dobu 30 - 60 sekund. 9) Do kolonky „Spin Column Assembly" napipetujte 400 [ú promývacího roztoku „Wash Buffer". 10) Centrifugujte při 14 000 g při laboratorní teplotě po dobu 30 - 60 sekund. 11) Se sběrné zkumavky vylijte proteklou tekutinu a vraťte „Spin Column Assembly" zpět do sběrné zkumavky. 12) Centrifugujte při 14 000 g při laboratorní teplotě po dobu 1 min. Dojde k dokonalému vysušení kolonky „Spin Column Assembly". 13) Přeneste kolonku do nové sběrné zkumavky. 14) Do středu filtru v kolonce „Spin Column Assembly" napipetujte 50 [ú elučního pufru („Elution Buffer"). 15) Centrifugujte při 14 000 g při laboratorní teplotě po dobu 30 - 60 sekund. 16) Odstraňte kolonku, eluovaná DNA je v roztoku. 17) Stanovte koncentraci DNA podle cvičení č. 3 nebo 4, proveďte elektroforézu podle cvičení č. 9, posuďte kvalitu izolované DNA. Uskladněte DNA při -20 °C. Další informace k této problematice najdete v EPPENDORF: FastPlasmid Mini. Manuál. QIAGEN 2003: QIAprep Miniprep Handbook. 16 Kontrolní otázky a příklady 1) Jak se můžete přesvědčit o tom, která z forem plasmidu pozorovaná na vašem izolátu po elektroforéze je L-forma ? 2) Na uvedeném elektroforetickém snímku vyznačte různé formy plasmidu. 3) Co lze říci o průběhu izolace plasmidové DNA, jestliže je na elektroforetickém gelu vidět pruh denaturované DNA ? 17 Odhad koncentrace a čistoty DNA na agarózovém gelu (cvičení č. 4) Úvodní slovo Ke stanovení koncentrace nukleových kyselin se používají dvě metody. Jednak je možné porovnat intenzitu záření vzorku DNA „obarvené" ethidiumbromidem (metodiku barvení budete provádět ve cvičení č. 9) na agarózovém gelu s intenzitou záření DNA naředěného standardu. Toto stanovení umožňuje současně posoudit kvalitu izolované DNA, ale je výrazně ovlivněno subjektivní chybou experimentátora. Molekuly ethidiumbromidu mají planární strukturu, podobně jako báze v nukleových kyselinách. Proto se mohou interkalovat do mezimolekulových prostorů, které existují mezi sousedícími bázemi. Po ozáření nukleových kyselin s interkalovaným ethidiumbromidem ultrafialovým světlem (UV) o vlnové délce 256, 302, 312 nebo 360 nm dochází k excitaci elektronů ve struktuře ethidiumbromidu a přechodu do vyšších energetických hladin. Energie se pak přenáší na atomy ve struktuře nukleové kyseliny a uvolňuje se v podobě viditelného záření o vlnové délce 590 nm (oranžové světlo). Ethidiumbromid vmezeřený v DNA září asi 80x intenzivněji než ve volném stavu. Ozáření nukleové kyseliny obarvené ethidiumbromidem se provádí v roztoku nebo v agarózovém gelu na zařízení označovaném jako „transluminátor". Intenzita záření je závislá na množství interkalovaného ethidiumbromidu. Množství interkalovaného ethidiumbromidu zase závisí jednak na délce nukleotidového řetězce (k delším molekulám se naváže více ethidiumbromidu) a na koncentraci nukleové kyseliny (čím vyšší koncentrace nukleové kyseliny, tím více interkalovaného ethidiumbromidu). Proto je možné při porovnání molekul o stejné velikosti odhadnout jejich vzájemnou koncentraci. Při provedení metody v agarózovém gelu je možno kromě odhadu koncentrace provést i kontrolu kvality izolované DNA, posoudit obsah RNA, zkontrolovat různé formy DNA v případě izolované plasmidové DNA apod. Strukturní vzorec ethidiumbromidu H2N Cíl cvičení Odhadnout koncentraci a posoudit čistotu chromosomální a plasmidové DNA izolované ve cvičeních č. 1, 2 a 3. Seznam přístrojů a standardů • transluminátor • sada pipet o objemech 10, 20 a 200 (ll • hmotnostní standard fága X • hmotnostní standard plasmidu pUC 18 • hmotnostní standard plasmidu pCR2.1 18 Vlastní pracovní postup 1) Připravte ředící řadu hmotnostního standardu DNA fága X (zásobní koncentrace 500 (J,g/ml) tak, že jednotlivé hodnoty konečných koncentrací budou 500 ng/[j,l, 250 ng/[j,l, 100 ng/[j,l, 50 ng/[j,l, 10 ng/[j,l a 1 ng/[j,l. 2) Podobně nařeďte hmotnostní standardy plasmidů pUC 18a pCR2.1. 3) Nařeďte vzorek vámi připravené chromosomální nebo plasmidové DNA v TE pufru v poměru 1:4, 1:9 a 1:99. a) Odhad koncentrace kapkovou metodou 4) Nakapejte 5 [ú každého hmotnostního standardu ve formě kapiček vedle sebe na parafilm a smíchejte s l[ú roztoku ethidiumbromidu (zásobní koncentrace 0,15 (j,g/ml). 5) Stejně nakapejte kapičky vámi připravených ředění chromosomální nebo plasmidové DNA. 6) Vložte parafilm s kapičkami na transluminátor a vyfotografujte zářící body. 7) Srovnáním intenzit záření v jednotlivých kapičkách odhadněte nejvíce shodné intenzity v řadě standardu a vaší DNA. 8) Stanovte koncentraci DNA ve výchozím vzorku (neředěném TE pufrem). 9) Porovnejte hodnotu s koncentrací stanovenou spektrofotometricky (viz cvičení č. 5) b) Odhad koncentrace v agarózovém gelu 4) Připravte agarózový gel o koncentraci 0,8 % podle návodu uvedeném ve cvičení č. 10. 5) Smíchejte 5 [ú každého hmotnostního standardu a naředěného vzorku s 1 [ú nanášecího pufru (6 x GLB). 6) Naneste směsi do komůrek pod hladinu elektroforetického pufru. 7) Proveďte elektroforézu při 10 V/cm gelu po dobu 30 min. 8) Vyfotografujte výsledný elektroforetický gel. 9) Srovnejte intenzity záření v jednotlivých komůrkách, odhadněte nejvíce shodné intenzity v řadě standardu a vaší DNA. 10) Stanovte koncentraci DNA ve výchozím vzorku (neředěném TE pufrem). 11) Odhadněte kvalitu izolované chromosomální DNA, obsah RNA a popište formy plasmidu. 12) Porovnejte hodnotu s koncentrací stanovenou spektrofotometricky (viz cvičení č. 5) Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 19 Kontrolní otázky a příklady 1) Jaká byla původní koncentrace DNA ve vzorku, jestliže po jeho naředění v TE pufru v poměru 1:9 vykazoval stejnou intenzitu záření jako vzorek standardu o koncentraci 25 ng/ul ? Jak vzorku, tak standardu jste nanesli na gel 5 ul. 2) Jak naředíte vzorek DNA o koncentraci 600 ug/ml tak, aby při nanesení 10 ul na gel intenzita jeho záření odpovídala 5 ul standardu o koncentraci 100 ng/ul ? 3) Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 2 500 bp obsahuje 50 ul roztoku o koncentraci 100 ng/ul ? 20 Poznámky 21 Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky (cvičení č. 5) Úvodní slovo Rychlou a jednoduchou metodu stanovení koncentrace nukleových kyselin představuje proměření spektra v rozsahu 230 až 320 nm. Báze v nukleových kyselinách mají absorpční maximum při 260 nm. Obecně platí, že pokud je hodnota absorbance A260 v 1 cm kyvetě rovná 1,0, je koncentrace dvouřetězcové DNA v kyvetě 50 ug/ml. Pro jednořetězcovou DNA a RNA platí hodnota 38 ug/ml. Čistota DNA je nejčastěji odhadována na základě poměru absorbancí při různých vlnových délkách. Pro čistou DNA platí poměr: A26o/A28o= 1,80 Tento parametr je nejdůležitější a v běžné praxi nejčastěji používaný. Pokud je hodnota jiná než 1,80, pak je vzorek DNA kontaminován proteiny nebo RNA. Cíl cvičení Stanovit koncentraci a posoudit čistotu chromosomální DNA izolované ve cvičení č. 1. Seznam přístrojů • UV-VIS spektrofotometr • sada pipet o objemech 20, 200 a 500 (ll Vlastní pracovní postup 1) Zapněte spektrofotometr. 2) Do kyvety napipetujte 100 (ll roztoku AE (eluční pufr ze cvičení č. 1) a proveďte nastavení nulového pozadí (tzv. blank). 3) DNA izolovanou ve cvičení č. 1 nařeďte lOx tak, že k 10 (ll DNA napipetujte 90 (ll roztoku AE. 4) Naředěnou DNA napipetujte do kyvety a změřte hodnoty absorbance při 230, 260 a 280 nm. 5) Je-li naměřená hodnota A260 mimo hodnoty 0,1 až 0,3, opakujte ředění vzorku DNA. Jen v rozsahu hodnot 0,1 až 0,3 je závislost koncentrace na absorbanci lineární a naměřené hodnoty jsou přesné. 6) Vyhodnoťte dosažené výsledky. Další informace k této problematice najdete v Manchester K.L. 1995: Calue of A260/280 ratios for measurements of purity of nucleic acids. BioTechniques 19, 208-219. Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press 22 Kontrolní otázky a příklady 1) Kolik [ú vzorku DNA nanesete do reakce, potřebujete-li 2 ng a máte k dispozici roztok DNA o koncentraci 2 [j,g/ml? 2) Kolik molekul DNA plasmidu pCR2.1 o velikosti 3 900 bp je obsaženo ve 100 [ú vzorku o koncentraci DNA 50 [j,g/ml? 3) Kolikrát musíte naředit roztok DNA o koncentraci 100 (J,g/ml, aby byla jeho absorbance při 260 nm rovna hodnotě 0,2? 4) Kolik ředícího roztoku přidáte do 30 [ú vzorku DNA o koncentraci 60 (J,g/ml tak, aby koncentrace DNA po zředění klesla na 15 ng/[j,l? 5) Kolik molekul plasmidové DNA o velikosti 50 000 bp obsahuje 100 [ú roztoku u něhož byla hodnota absorbance při 260 nm po 10 násobném zředění rovna 0,15? 23 Reštrikční štěpení plasmidové DNA (cvičení č. 6) Úvodní slovo Při genových manipulacích jsou geny přenášeny z jednoho organismu do druhého. Jedním ze způsobů, jak geny přenášet je jejich umístění, tzv. klonování, do plasmidu. Z toho důvodu jsou molekuly plasmidu rozštěpeny na přesně definovaných místech tak, aby byl proces klonování reprodukovatelný. Vedle vlastního plasmidu se podobně štěpí i geny. Štěpení se provádí pomocí tzv. restrikčních enzymů neboli restriktáz. Restriktázy jsou enzymy, které se vyskytují u bakterií a ty je používají jako obranný systém při napadení fágy. Reštrikční endonukleáza, která rozpozná cizorodé DNA sekvence u fága vstupujícího do buňky, takovou DNA rozštěpí v přesně definovaných místech daných specifickou sekvencí bází. Této schopnosti využili genoví inženýři při manipulacích s geny. Byly objeveny celkem čtyři skupiny restriktáz, všechny štěpí dvouřetězcovou DNA. Restriktázy typu I rozpoznávají specifickou sekvenci ale štěpí na jiném, nahodilém místě, restriktázy typu II rozpoznávají stejnou sekvenci, kterou následně štěpí, restriktázy typu III štěpí v definované vzdálenosti od rozpoznávané sekvence a restriktázy typu IV štěpí mimo rozpoznávanou sekvenci a to pouze modifikovanou DNA, jejíž báze mohou být methylované, hydroxymethylované a glukosy-hydroxymethylované. V genovém inženýrství našly uplatnění zejména restriktázy typu II. V praxi se nejčastěji používají restriktázy typu II uvedené v Tabulce 6.1: Tabulka 6.1: Nejčastěji používané restriktázy typu II: Název enzymu Izolován z Rozpoznávaná sekvence Výsledné produkty štěpení EcoRl Escherichia coli ......gIa-a-t-t-c...... .......c-t-t-a-aTg...... A-A-t-t-c........... G........... G c-t-t-A-A Hind iii Haemophilus influenzae ........AlA-G-c-t-t......... ........t-t-c-G-AÍA......... A-G-c-t-t............ A............ A t-t-c-G-A BamHI Bacillus amyloliquefaciens ........GlG-A-t-c-c........ ...........c-c-t-A-GÍG........... G-A-t-c-c........... G........... G c-c-t-A-G Hae iii Haemophyllus aegytius ........g-gIc-c....... ..........c-cTg-g......... c-c............ G-G........... ..............G-G ..............c-c SauiA i Staphylococcus aureus .........Ig-a-t-c....... ..........c-t-a-gT........ G-A-t-c ..............c-t-A-G Not I Nocardia otitidis-caviarum G-c|G-G-c-c-G-c... ........c-G-c-c-GÍG-c-G..... G-G-c-c-G-c c-G G-c .........c-G-c-c-G-G Restriktázy jsou označovány podle organismu, ze kterého byly izolovány. Dále se dělí podle délky DNA-sekvence, kterou štěpí. Nejčastěji štěpí restriktázy DNA-sekvence o délce 4, 6 nebo 8 bp. Vzhledem k tomu, že specifická posloupnost 8 nukleotidů se vyskytuje mnohem 24 méně často než specifická posloupnost 4 nukleotidů, je zřejmé, že restriktázy, které rozpoznávají posloupnost 4 nukleotidů, budou DNA štěpit častěji, než ty, co rozpoznávají posloupnost 8 nukleotidů. Pokud tedy chceme štěpit DNA na malé fragmenty, použijeme např. enzymy Hae III nebo Sau3A I, zatímco chceme-li získat větší fragmenty, použijeme např. EcoR I. Pro restriktázy typu II je také typické, že jimi rozpoznávané sekvence jsou symetrické (palindromatické), takže štěpením vznikají fragmenty se stejným zakončením. Pokud se štěpení uskutečňuje mimo střed symetrie, vzniknou přesahující se konce s komplementárními bázemi. Takové konce označujeme jako lepivé, neboli kohezivní (např. po štěpení EcoR I nebo BamR I). Proběhne-li štěpení ve středu symetrie, vzniknou konce, které neobsahují přesahující se sekvence. Pak je označujeme jako konce tupé (např. po štěpení Hae III). Přehled všech restriktáz je možno najít na adrese „www.rebase.neb.com/rebase". Cíl cvičení Připravit linearizovaný plasmid pUC18, který se používá jako vektor v genovém inženýrství. Plasmid linerizovat reštrikční endonukleázou EcoR I. Seznam přístrojů • sada pipet 0,5-10 \ů, 5-50 \ů, 20-200 \ů • sada sterilních umělohmotných špiček na pipety • sterilní umělohmotné Eppendorfky • nádoba s ledem • chladící bloček na -20 °C • biologický termostat s nastavitelnou teplotou • pikofuga Vlastní pracovní postup 1) Z mrazáku -20 °C vyndejte plasmidovou DNA, vodu, pufr a všechny komponenty nechejte rozmrazit. Po rozmrazení krátce centrifugujte kapičky roztoků ze stěn mikrozkumavek na pikofuze a uložte do nádoby s ledovou tříští. 2) Dle „reakčního schématu" napipetujte do mikrozkumavek jednotlivé komponenty reakce. Všimněte si, že připravujete dvě reakce, každou s různým množstvím plasmidové DNA. Pracujte rychle, ale velmi opatrně tak, abyste do reakce nezanesli žádné nečistoty, které by poškodily průběh reakce. Všechny roztoky uchovávejte stále v nádobě s ledovou tříští. 3) Po nanesení poslední komponenty směs jemně promíchejte špičkou pipety. 4) Komponenty promíchejte jemným pohybem vyndejte z mrazáku restriktázu a v mrazícím bločku ji přineste k ostatním komponentám. Restriktázu nechejte v bločku, nedávejte ji do ledové tříště. 5) Opatrně napipetujte restriktázu a výslednou směs jemně promíchejte špičkou pipety. 6) Restriktázu ihned uschovejte v mrazáku na -20 °C. Rovněž zbylou vodu, pufr, a DNA uložte zpět do -20 °C. 7) Reakční směs přeneste do termostatu vytemperovaného na 37 °C. 8) Inkubujte po dobu 1 hodiny. 9) Reakci zastavte přidáním 0,5M EDTA, pH 8,0 (1 [ú na 50 [ú reakční směsi). 10) Proveďte kontrolu štěpení v 0,8% agarózovém gelu (viz. cvičení č. 10). 25 Reakční schéma (objemy jsou uvedeny v uľ): Pokusný zásah I II Voda 50 - (5+X+l) 50-(5+X+l) pufr 5 5 plasmid X (500 ng) X (200 ng) restriktáza (20u/ul) 1 1 Celkem 50 50 Další informace k této problematice najdete v Roberts, R.J. 2003: A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Research, 31: 1805-1812. Sambrook, J. a Russell, D. 2001: Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Poznámky k vypracování protokolu: Zásobní koncentrace mého plasmidu byla: Výsledné reakční schéma vypadalo následovně: Pokusný zásah I II Voda pufr 5 5 plasmid restriktáza (20 u/ul) 1 1 Celkem 50 50 Fotografie elektroforézy a vyhodnocení restrikčního štěpení: 26 Kontrolní otázky a příklady 1) Jaké množství plasmidu (v [ú) přidáte do reakční směsi, potřebujete-li štěpit 500 ng plasmidu a je-li jeho zásobní koncentrace 100 ng/[j,l ? 2) Jedna jednotka reštrikční endonukleázy (značí se U) je množství enzymu, které rozštěpí l[ig DNA fága X za optimálních reakčních podmínek při 37 °C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága je celkem 6 štěpných míst pro restriktázu Hinf I. Jaké množství plasmidu pUC18 rozštěpí 1 jednotka restriktázy Hinfl za jednu hodinu, jestliže je na tomto plasmidu jen jedno reštrikční místo ? Velikost plasmidu pUC18 je 2 686 bp. 3) Jak dlouho bude štěpit lu reštrikční endonukleázy Hind III 200 ng plasmidu pUC18 ? Na tomto plasmidu je jediné reštrikční místo pro restriktázu Hind III. 27 Stanovení genetické modifikace ac2 u Solanum tuberosum (cvičení č. 7) Úvodní slovo Geneticky modifikované organismy (GMO, transgenní organismy) se stávají reálnou součástí našeho života a jsou dnes běžně zaváděny do potravního řetězce člověka. Potraviny vyrobené z GMO představují tzv."potraviny nového typu". Do zemědělské praxe se začaly dostávat počátkem 90. let. V současné době je jimi oseto přes 60 milionů hektarů polí. Významnými pěstovanými GMO rostlinami jsou vedle sóji, kukuřice, řepky a bavlny také brambory. Brambory {Solanum tuberosum L.) patří do čeledi Solanaceae. Z hlediska celkové produkce potravin se vedle obilovin jedná o nejdůležitější potravní zdroj člověka. Vedle toho se používají jako krmivo pro hospodářská zvířata a průmyslovou surovinu při výrobě škrobu, alkoholu a jiných důležitých produktů. V oblasti genetických modifikací představují brambory vhodnou modelovou rostlinu, a to hned z několika důvodů. Z hlediska praktického využití nabízejí poměrně široké spektrum znaků a jako vegetativně se množící rostlina umožňují zachování příslušného znaku v delším časovém horizontu. Na druhou stranu mezi jejich nevýhody patří zejména nízká hladina exprese vložených genů, obtížná regenerace transformovaných rostlin mimo sterilní prostředí nebo výskyt morfologických změn, např. na hlízách. Geneticky upravené brambory se připravují zejména za účelem zvýšení odolnosti těchto plodin vůči škůdcům, herbicidům nebo nepříznivým vlivům prostředí, pro zlepšení výživových vlastností nebo dokonce pro produkci lékařsky významných látek, které by bylo možné používat jako vakcíny pro navození imunity proti různým chorobám u lidí. Zajímavou skupinou jsou modifikované brambory produkující látky využitelné např. v průmyslu. Genetická modifikace ac2 byla získána transformací odrůdy Desireé pomocí vektoru pH22Kneo nesoucího gen ac2 fungicidního peptidu ze semen amarantu (Amaranthus caudatus L.). Produktem genu ac2 je protein Ac-AMP2, který se vyznačuje fungicidními a antibakteriálními účinky a předpokládá se proto jeho role v ochraně semen amarantu před napadením houbovitými organismy. Proteiny Ac-AMP patří do skupiny peptidů s antimikrobními vlastnostmi, které jsou příbuzné rostlinným defenzinům. Důležitou vlastností rostlinných proteinů Ac-AMP je to, že na rozdíl od jiných defenzinů, negativně nepůsobí na savčí buňky. Výsledné geneticky modifikované rostliny bramboru jsou odolné vůči působení hub a některých grampozitivních bakterií. Cíl cvičení Detekovat gen ac2 z amarantu a gen StTSl, který je specifický pro druh Solanum tuberosum. Při amplifikaci geneticky modifikované brambory vznikají dva produkty: amplifikační produkt genu ac2 má velikost 306 bp, amplifikační produkt specifického genu StTSl je dlouhý 554 bp. Při amplifikaci geneticky nemodifikované brambory vzniká pouze produkt specifického genu StTSl. Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 10, 50 a 200 (ll 28 Použité primery OWB40 5'- AAT TGG TAC CAG TCA AGA GTA TTA ATT AGG - 3' OWB217 5'-CTA CTT TCA TGG ACT ACC AGC - 3' TS1-F 5'- CTT GAG AAG GCG GTT CAA TC - 3' TS1-R 5'- TCC TCT TGC AGC TTT CCT GT - 3' Kombinací primerů OWB40/OWB217 je možné získat amplikon o velikosti 306 bp, který je specifický pro část genu ac2. Kombinací primerů TS1-F/TS1-R je možné získat amplikon o velikosti 554 bp, který je specifický pro část genu StTS 1. Vlastní pracovní postup 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 ul, 5 až 50 ul, 0,5 až 10 ul), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 5 reakcí HOTStar Taq Master Mix (QIAGEN) 10,0 50,0 Voda deionizovaná 7,6 38,0 Primer OWB40 (100pmol/ul) 0,1 0,5 Primer OWB 217 (100pmol/ul) 0,1 0,5 Primer TS1-F (25pmol/ul) 0,1 0,5 Primer TS1-R (25pmol/ul) 0,1 0,5 4) Směs rozdělte po 18 ul do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 5 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 ul izolované DNA z brambor o koncentraci přibližně 50 pg/jol, B = 2 ul izolované DNA z brambor o koncentraci přibližně 100 pg/(il, K = 2 ul pozitivní kontroly, směs plasmidů, které nesou nakloňované části genů ac2 a StTSl N = 2 ul deionizovaná vody. Poznámka: Provedeme vyšetření vzorku ve dvou reakcích o různých koncentracích DNA. To proto, že PCR reakce je často inhibována různými látkami, které se nepodaří v průběhu izolace odstranit. Na inhibicích se podílí dokonce sama DNA. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 29 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 96 °C 15 min. 2 96 °C 10 s 3 45 °C 10 s 4 72 °C 40 s 5 go to step 2 repeat 35x 6 72 °C 2 min. 7 10 °c for ever 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1,5% agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Příklad analýzy Amplifikační produkt genu ac2 (GMO) má velikost 306 bp, fragment o délce 554 bp je výsledkem amplifikace specifického genu StTSl bramboru. Dráha č. 1 - výsledek amplifikace negativního vzorku (není GMO) Dráha č. 2 - výsledek amplifikace negativního vzorku (není GMO) Dráha č. 3 - výsledek amplifikace pozitivního vzorku (je GMO) Dráha č. 4 - výsledek amplifikace pozitivní kontroly PCR Dráha č. 4 - výsledek amplifikace negativní kontroly PCR nebo negativní kontroly izolační L - velikostní standard lOObp (Malamité, v.o.s., Česká republika) Další informace k této problematice najdete v Lapkova, N.S. et al. 2001: Isolation of genetically modified potato plant containing the gene of defensive peptide from Amaranthus. Prikl Biokhim Mikrobiol., 37(3):349-354. Broekaert, W.F. et al. 1992: Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry 31(17):4308-4314. Broekaert et al.: Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiol. 108(4): 1353-8. Miguel et al. 1996: Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus: expression, processing, localization and biological activity in transgenic tobacco. Plant Mol Biol 31: 993-1008. 30 Kontrolní otázky a příklady 1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnou, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt mutantní alely StTSl o délce 554 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii alely? 2) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 306 a 554 bp? 3) Jaké množství dNTP potřebujete dát minimálně do PCR reakce, abyste měli dostatek stavebního materiálu k amplifikaci obou fragmentů o délce 306 a 554 bp (za předpokladu, že v daných fragmentech je rovnoměrné zastoupení všech nukleotidů)? Předpokládejte, že chcete získat 200 ng každého z fragmentů a máte k dispozici zásobní roztok směsi všech čtyř nukleotidů, ve které má každý nukleotid koncentraci 25 mM. 31 Detekce delece A32 v receptoru CCR5 metodou PCR (cvičení č. 8) Úvodní slovo Receptor CCR5 je zodpovědný za transport chemokinu CC a podílí se na vstupu virových částic viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) do makrofágů. Dle současných představ o vstupu viru HIV-1 do buněk dochází nejprve k připojení povrchového glykoproteinu 120 viru HIV-1 k povrchovému receptoru CD4. To má za následek konformační změnu CD4, po které jsou do procesu vstupu virionů zapojeny i receptory chemokinu. Většina primárních kmenů HIV využívá receptoru chemokinu CCR5 a CXCR4. Alelové varianty těchto receptoru mají vliv na množství receptoru vyjádřených na povrchu buňky a tudíž přímý vliv na pronikání viru. U genu CCR5 byly popsány dvě hlavní varianty, a to deleční alela CCR5-A32 a alela CCR5-G59029 s jednoduchou bodovou mutací v promotoru. V případě mutace CCR5-A32 se jedná o deleci v délce 32 bp, v jejímž důsledku dochází k expresi zkrácené verze proteinu, který nemůže být transportován na povrch buněk a tudíž nemůže fungovat jako kofaktor transportu virových částic HIV-1. Osoby homozygotní v alele CCR5-A32 jsou proti infekci virem HIV-1 chráněny, protože vstup viru touto cestou je prakticky znemožněn. To bylo prokázáno i u vysoce promiskuitních jedinců. U heterozygotních jedinců (+/A32) dochází ke zpomalení progrese virové infekce v průměru o 2 až 4 roky. U bílých Evropanů a bělochů ze severní Ameriky je mutantní forma alely zastoupena u asi 10 % populace. Její přítomnost nebo absenci je možno stanovit metodou polymerázové reakce. Cíl cvičení Detekovat polymorfismus v genu pro CCR5 ve vzorku DNA z lidské krve izolované ve cvičení č. 1. Je možno použít DNA izolovanou též z plasmy, spermatu, a jiného biologického materiálu. Koncentrace DNA byla stanovena ve cvičení č. 4 nebo 5. Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 10, 50 a 200 (ll Použité primery CCR5-UP: 5'-TGG TGG CTG TGT TTG CGT CTC-3' CCR5-DOWN: 5'-AGC GGC AGG ACC AGC CCC AAG-3' CCR5-DOWN2: 5'-CAG TAG CTC TAA CAG GTT GGA CCA A-3' Kombinací primerů CCR5-UP/CCR5-DOWN je možné získat amplikony velikostí 162 bp pro normální variantu genu a nebo 130 bp pro mutantní variantu (CCR5 A32). 32 Kombinací primerů CCR5-UP/CCR5-DOWN2 je možné získat amplikony velikostí 373 bp pro normální variantu genu a nebo 341 bp pro mutantní variantu (CCR5 A32). Vlastní pracovní postup 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (ll, 5 až 50 (ll, 0,5 až 10 (ll), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v jíl 1 reakce 5 reakcí Taq Master Mix (QIAGEN) 20,0 100,0 Voda deionizovaná 17,8 89,0 Primer CCR5-UP (100 (iM) 0,2 1,0 Primer CCR5-DOWN (100 (iM) 0,2 1,0 4) Směs rozdělte po 38 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 5 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 (il izolované DNA o koncentraci přibližně 50 pg/jol, B = 2 (il izolované DNA o koncentraci přibližně 100 pg/(il, K = 2 (il pozitivní kontroly, N = 2 (il deionizovaná vody. Poznámka: Provedeme vyšetření vzorku ve dvou reakcích o různých koncentracích DNA. To proto, že PCR reakce je často inhibována různými látkami, které se nepodaří v průběhu izolace odstranit. Na inhibicích se podílí dokonce sama DNA. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 5 min 2 94 °C 20 s 3 55 °C 20 s 4 72 °C 60 s 5 GO TO 2 34x 6 72 °C 5 min 7 10 °c nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 2,5-3% agarózovém gelu (viz. cvičení č. 10). 33 Další informace k této problematice najdete v Hersberger, M. et al. 2002: Rapid detection of the CCR2-V64I, CCR5-A59029G and SDF1-G801A polymorphisms by tetra-primer PCR. Clinical Biochemistry 35, 399-403. Hoffman, T.L. et al. 1997: CCR5 Gynotypes in Sexually Active Couples Discordant for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection Status. The Journal of Infectious Diseases 176, 1093-1096. 34 Kontrolní otázky a příklady 1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5 ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnou, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt mutantní alely CCR5 A32 o délce 130 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu pro CCR5 A32? 2) Jak dlouhý amplikon může vzniknout na níže popsaném úseku DNA (je uveden pouze jeden z komplementárních řetězců) pokud má experimentátor k dispozici následující dvojici primerů? Primer forward: Primer reverse: 5ATG TGA GCG GTC TAC TGG - 3' 5GAT AGC TAG AAT TGA TAG - 3' Sekvence na které probíhá amplifikace: 5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3' 3) Jestliže alelu CCR5 A32 označíme v místě delece na chromozómu kolečkem rozhodněte, která ze slečen má nejmenší pravděpodobnost infekce virem HIV. Slečna A Slečna B Slečna C 35 Detekce delece v genu pro angiotensin konvertující enzym metodou PCR (cvičení č. 9) Úvodní slovo Angiotensin konvertující enzym (dipeptidyl karboxypeptidáza 1) je součástí systému renin-angiotensin (RAS), jehož jednotlivé komponenty, a to prorenin, angiotensinogen, angiotensin I, angiotensin II, renin a specifická vazebná místa pro angiotensin II byly nalezeny mimo jiné i v lidském oku. Protože je angiotensin II potenciálním vazokonstriktorem a angiogenním faktorem, je možné, že se místní RAS systém může podílet také na patogenezi proliferativní retinopatie, se kterou se setkáváme u některých diabetiků. Je známo, že prorenin zvyšuje množství tekutiny ve sklivci u pacientů, kteří jsou postiženi proliferativní diabetickou retinopatií. Tvorba angiotensinu II v oku diabetika tedy může být příčinným faktorem neovaskularizace. Z toho všeho vyplývá, že oční RAS systém se může účastnit proliferace krevních vlásečnic v sítnici a z toho plynoucího oslepnutí diabetiků. Některými autory byl prokázán vztah polymorfismu v genu pro angiotensin konvertující enzym (ACE) a diabetickou retinopatií u pacientů s diabetem typu 2. Polymorfismus je založen na deleci v oblasti intronu 16 tohoto genu. Tento polymorfismus je možné detekovat jednoduchou PCR, která odliší jak heterozygotní, tak oba homozygotní stavy. Potom je možné studovat vztah přítomnosti určité alely ke konkrétnímu fenotypovému projevu. U jedinců s diabetickou retinopatií je ve zvýšené míře detekována alela s delecí. Cíl cvičení Detekovat polymorfismus v genu pro angiotensin konvertující enzym ve vzorku DNA z lidské krve izolované ve cvičení č. 1. Je možno použít DNA izolovanou též z plasmy, spermatu, a jiného biologického materiálu. Koncentrace DNA byla stanovena ve cvičení č. 4 nebo 5. Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 10, 50 a 200 (ll Použité primery ANG-F: 5'-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3' ANG-R: 5'-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3' Kombinací primerů ANG-F/ANG-R je možné získat amplikony velikostí 190 bp pro deleční alelu a nebo 490 bp pro standardní variantu. 36 Vlastní pracovní postup 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (íl, 5 až 50 (íl, 0,5 až 10 (íl), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 5 reakcí Taq Master Mix (QIAGEN) 20,0 100,0 Voda deionizovaná 17,8 89,0 Primer ANG-F (100 (iM) 0,2 1,0 Primer ANG-R (100 (iM) 0,2 1,0 4) Směs rozdělte po 38 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 5 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 (il izolované DNA o koncentraci přibližně 50 pg/|il, B = 2 (il izolované DNA o koncentraci přibližně 100 pg/(il, K = 2 (il pozitivní kontroly, N = 2 (il deionizovaná vody. Poznámka: Provedeme vyšetření vzorku ve dvou reakcích o různých koncentracích DNA. To proto, že PCR reakce je často inhibována různými látkami, které se nepodaří v průběhu izolace odstranit. Na inhibicích se podílí dokonce sama DNA. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 5 min 2 94 °C 60s 3 55 °C 60s 4 72 °C 90s 5 GO TO 2 34x 6 72 °C 10 min 7 10 °c nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1,5% agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Další informace k této problematice najdete v Matsumoto, A. et al. 2000: Detection of the association between a deletion polymorphism in the gene encoding angiotensin I - converting enzyme and advanced diabetic retinopathy. Diabetes Research and Clinical Practise 50, 195-202. Rigat, B. et al. 1992: PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCP1) (dipeptidyl carboxypeptidase 1). Nucleic Acids Research 20, 1433. 37 Kontrolní otázky a příklady 1) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 190 a 490 bp? 2) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje lOnmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72 °C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu. 3) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10"6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 500 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonu v takovém výsledném vzorku DNA? 38 Poznámky 39 Detekce polymorfismu K469E v genu ICAM1 (cvičení č. 10) Úvodní slovo V genu ICAM-1 bylo identifikováno nejméně dvacet jednoduchých nukleotidových polymorfismu. Pouze dva jsou však spojovány s Crohnovou chorobu. Polymorfismus v kodonu 241 (G/R241, Gly/Arg, exon 4) a kodonu 469 (K/E469, Lys/Glu, exon 6) (Papa et al. 2004). Polymorfismy způsobují změny v řetězcích aminokyselin na imunoglobulinových doménách proteinu ICAM-1, což způsobuje alterace jejich interakce se specifickými ligandy. Polymorfismus K469E je nekonzervativní substitucí aminokyseliny lysinu za kyselinu glutamovou na páté imunoglobulinové doméně ICAM-1. Tato doména je důležitá pro adhezi a B-buněk a dendritických buněk, je prezentována jako imunodominantní epitop molekuly ICAM-1. Záměna aminokyseliny je způsobena nukleotidovou substitucí A za G (A/G). Polymorfismus K469E vede k změněné expresi výsledné adhezivní molekuly, což způsobuje alteraci interakce mezi LFA-1 (lymphocyte function antigén 1) a B-buňkami. Změna funkce proteinu ICAM-1 potenciálně přispívá ke genetickým predispozicím k zánětlivým a imunitním onemocněním. Návrh metody detekce polymorfismu 469E vychází z práce Nejentsev et al. (2000). Cíl cvičení Detekovat polymorfismus v genu ICAM1 ve vzorku DNA z lidské krve izolované ve cvičení č. 1. Je možno použít DNA izolovanou též z plasmy, spermatu, a jiného biologického materiálu. Koncentrace DNA byla stanovena ve cvičení č. 4 nebo 5. Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 0,5-10 \d, 5-50 \d, 20-200 [ú • nádoba s ledem • chladící bloček na -20 °C • biologický termostat s nastavitelnou teplotou Použité primery ICAM-1 F 5' - GGA ACC CAT TGC CCG AGC - 3' ICAM-1 R 5'- GGT GAG GAT TGC ATT AGG TC - 3' S použitím těchto primerů lze získat amplikony o délce 223 bp. Reštrikční endonukleáza Polymorfismus je možno detekovat reštrikční endonukleázou BstU I, která štěpí amplikon na dva fragmenty v případě nestandardní alely. Standardní alela není štěpena. 40 Pozice primerů v sekvenci lidského genomu podle GenBank Accesion Number - AC011511 98941 99001 99061 99121 99181 99241 99301 99361 99421 99481 99541 99601 99661 99721 99781 99841 99901 99961 aagcttgcag gtgtgacctg acgtgattct cccaccctag cccagctcct ccctggaggt gtgagtgggg cataaggtct tccagatggc ttcccagcag aaaggatggc gggcacctac gaatgtgctc aatgcaatcc tgagccaaga aacccggggc gacgaagcca agccaaggtg gctgaaggcc ggccggccag ctgctggtca tgcctccaag ccccgactgg actccaatgt actttcccac ctctgtcggg tgtgagtgag tcaccgcctg atcactgtgg aaccgccagc aaaccgaaca ccttcccata tagcagccgc ggaagatcaa cacaagccac ttggtggcag tcatgccact ggggctcact gaggtctcag acgctgaatg accccagagg cttatacaca atggccccta tcctgccccc acgagaggga gccaggcttg tgcccatcgg ccaggagcac ccggcgggca ttgtatcctc agtcataatg gaaatacaga gcctccctga tggtgccaca gcactccagc gtgtgcctat aagggaccga gggttccagc acaacgggcg agaaccagac tcccccaagg acccacctcc ttgtccggga ggggaaccca ggaatcagtg tcaaggggag gagctgggtg cccacagccc ggcactgcag ctacaacagg acctatcccg ctgaacagag ctgggcaaca tccaggcttt ggtgacagtg ccagccactg cagcttctcc ccgggagctt cccaatctcc atgtcatctc aactggacgt ttgcccgagc actgtcactc gtcacccgc^ ggggcagggg cccggtatga gcctcagcac cccaaaaagg ggacagggcc tggaagacat gagcaaaact ccggcgccca aagtgtgagg ggcccgaggg tgctctgcaa cgtgtcctgt ctgaaggtcc atcgtgtttt ggccagaaaa tcaagtgtct gagatcttga aggtgaccgt ccatggacct gattgtcatc gtacctctat gacccccatg tcttcctcgg atgccatgca Primer ICAM-IF Primer ICAM-IR Pozice polymorfismu (R = A/G) Vlastní pracovní postup Amplifíkace 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (ll, 5 až 50 (ll, 0,5 až 10 (ll), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 6 reakcí Taq Master Mix (QIAGEN) 10,0 60,0 Voda deionizovaná 7,8 -47,0 primer ICAM-1F (100 uM) 0,1 ul 0,6 primer ICAM-1R (100 uM) 0,1 ul 0,6 4) Směs rozdělte po 18 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 5 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 (il izolované DNA B = 2 (il DNA standardního homozygota C = 2 (il DNA nestandardního homozygota D = 2 ul DNA heterozygota N = 2 (il deionizovaná vody - slouží jako negativní kontrola 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 41 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 5 min 2 94 °C 20 s 3 64 °C 50 s 4 72 °C 60 s 5 GO TO 2 30x 6 72 °C 5 min 7 12 °C nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1,5% agarózovém gelu (viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu). Reštrikční štěpení 1) Z mrazáku -20 °C vyndejte vodu, pufr a nechejte rozmrazit. Po rozmrazení krátce centrifugujte kapičky roztoků ze stěn mikrozkumavek na pikofuze a uložte do nádoby s ledovou tříští. 2) Dle „reakčního schématu" napipetujte do mikrozkumavek jednotlivé komponenty reakce. Pracujte rychle, ale velmi opatrně tak, abyste do reakce nezanesli žádné nečistoty, které by poškodily průběh reakce. Všechny roztoky uchovávejte stále v nádobě s ledovou tříští. 3) Po nanesení poslední komponenty směs jemně promíchejte špičkou pipety. 4) Komponenty promíchejte jemným pohybem vyndejte z mrazáku restriktázu a v mrazícím bločku ji přineste k ostatním komponentám. Restriktázu nechejte v bločku, nedávejte ji do ledové tříště. 5) Opatrně napipetujte restriktázu a výslednou směs jemně promíchejte špičkou pipety. 6) Restriktázu ihned uschovejte v mrazáku na -20 °C. Rovněž zbylou vodu, pufr, a DNA uložte zpět do -20 °C. 7) Reakční směs přeneste do termostatu vytemperovaného na 60 °C. 8) Inkubujte po dobu 1 hodiny. 9) Reakci zastavte přidáním 6x GLB pufru (složení viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu) v poměru vzorek : 6 x GLB = 5:1 10) Proveďte kontrolu štěpení v 3,0% agarózovém gelu (viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu). Reakční schéma (objemy jsou uvedeny v ul): Komponenta Množství Voda 7,0 ul NEB pufr 2 (lOx) 2,0 ul restriktáza BsňJ 1(10 U/ul) 1,0 ul PCR produkt (asi 100 ng/ul) 10,0 ul Celkem 20,0 ul 42 Vyhodnocení alela počet fragmentů bp nestandardní homozygot EE 2 136 a 87 heterozygot EK 3 223, 136 a 87 standardní homozygot KK 1 223 Další informace k této problematice najdete v Nejentsev S. et al. 2000: Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) K469E polymorphism: no association with type 1 diabetes among Finns. Tissue Antigens 55: 568-570. Papa A. et al. 2004: Prevalence of the K469E polymorphism of intercellular adhesion molecule 1 gene in Italian pationts with inflammatory bowel disease. Dig Liver Dis. 36 (8): 528-32. Kontrolní otázky a příklady 1) Napište sekvenci nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací standardní alely 2) Napište sekvenci nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací nestandardní alely a vyznačte v ní pozici restrikčního místa pro restriktázu BstU I 3) Napište sekvenci aminokyselin v místě polymorfismu pro standardní a nestandardní alelu -vždy 3 aminokyseliny ve směru k N i C konci polypeptidového řetězce od místa polymorfismu 43 Detekce polymorfismu 1007fs v genu NOD2 (cvičení č. 11) Úvodní slovo Protein, který je kódován genem NOD2 patří do skupiny rozpoznávacích receptoru (PRRs) vrozené imunity. Tento receptor rozpoznává tzv. s patogenem asociované molekulární znaky (PAMP). Polymorfismem genu NOD2 je inserce cytosinu v pozici 3020 nukleotidové sekvence (odpovídá tripletu 1007). Jde tedy o posunovou mutaci (frame-shift mutation) v jejímž důsledku je porušen čtecí rámec a na ribosomech dochází k translaci nesprávné primární struktury proteinu. Polymorfismus se označuje 1007fs. Spolu s dalšími dvěma mutacemi tvoří 81 % mutací, které souvisejí s Crohnovou chorobou. U heterozygotních forem je riziko vzplanutí Crohnovy choroby si 2 až 4x vyšší než u jedinců se standardní formou alely. U homozygotů je riziko dokonce 20 až 40x vyšší. Cíl cvičení Detekovat polymorfismus v genu pro NOD2 ve vzorku DNA z lidské krve izolované ve cvičení č. 1. Je možno použít DNA izolovanou též z plasmy, spermatu, a jiného biologického materiálu. Koncentrace DNA byla stanovena ve cvičení č. 4 nebo 5. Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 0,5-10 ul, 5-50 ul, 20-200 ul • nádoba s ledem • chladící bloček na -20 °C • biologický termostat s nastavitelnou teplotou Použité primery N1007fs F 5' - CCT GCA GTC TCT TTA ACT GG- 3' N1007fs R 5'- CTT ACC AGA CTT CCA GGA TG- 3' S použitím těchto primerů lze získat amplikony o délce 168 bp. (respektive 169 pokud je přítomna inserce) Reštrikční endonukleáza Polymorfismus je možno detekovat reštrikční endonukleázou NlaTV, která štěpí amplikon na dva fragmenty v případě nestandardní alely. Standardní alela není štěpena. 44 Pozice primerů v sekvenci lidského genomu Podle GenBank Accesion Number - AJ303140 128521 atttgataaa ctcatctagt gaatggaaga gagacggtta catttcactg atggtactga 128581 gcctttgttg atgagctcat tgggaatctc agacatgagc aggatgtgtc taagggacag 128641 gtgggcttca gtagactggc taactcctgc agtctcttta actggacagt ttcaagagga 128701 aaaccaagaa tccttgaagc tcaccattgt atcttctttt ccaggttgtc caataactgc 128761 atcacctacc taggggcaga agccctcctg cagg^cccttg aaaggaatga caccatcctg 128821 gaagtctggt aaggcccctg ggcaggcctg ttttagctct ccgaacctca gtttttctat 128881 ctgtaaaatg gggtgacggg agagaggaat ggcagaattt tgaggatccc ttctgattct N1007fs F N1007fsR Místo inserce X Vlastní pracovní postup Amplifíkace 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (ll, 5 až 50 (ll, 0,5 až 10 (ll), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v jíl 1 reakce 6 reakcí Taq Master Mix (QIAGEN) 10,0 60,0 Voda deionizovaná 7,8 -47,0 primer N1007fs F (100 jiM) 0,1 [il 0,6 primer N1007fs R (100 \M) 0,1 |il 0,6 4) Směs rozdělte po 18 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 6 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 (il izolované DNA B = 2 (il DNA standardního homozygota C = 2 (il DNA nestandardního homozygota D = 2 \il DNA heterozygota N = 2 (il deionizovaná vody - slouží jako negativní kontrola 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 45 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 1 min 2 94 °C 20 s 3 45 °C 20 s 4 72 °C 30 s 5 GO TO 2 45x 6 72 °C 5 min 7 12 °C nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 3,0% agarózovém gelu (viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu). Reštrikční štěpení 1) Z mrazáku -20 °C vyndejte vodu, pufr a nechejte rozmrazit. Po rozmrazení krátce centrifugujte kapičky roztoků ze stěn mikrozkumavek na pikofuze a uložte do nádoby s ledovou tříští. 2) Dle „reakčního schématu" napipetujte do mikrozkumavek jednotlivé komponenty reakce. Pracujte rychle, ale velmi opatrně tak, abyste do reakce nezanesli žádné nečistoty, které by poškodily průběh reakce. Všechny roztoky uchovávejte stále v nádobě s ledovou tříští. 3) Po nanesení poslední komponenty směs jemně promíchejte špičkou pipety. 4) Komponenty promíchejte jemným pohybem vyndejte z mrazáku restriktázu a v mrazícím bločku ji přineste k ostatním komponentám. Restriktázu nechejte v bločku, nedávejte ji do ledové tříště. 5) Opatrně napipetujte restriktázu a výslednou směs jemně promíchejte špičkou pipety. 6) Restriktázu ihned uschovejte v mrazáku na -20 °C. Rovněž zbylou vodu, pufr, a DNA uložte zpět do -20 °C. 7) Reakční směs přeneste do termostatu vytemperovaného na 37 °C. 8) Inkubujte po dobu 1,5 hodiny. 9) Reakci zastavte přidáním 6x GLB pufru (složení viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu) v poměru vzorek : 6 x GLB = 5:1 10) Proveďte kontrolu štěpení v 3,0% agarózovém gelu (viz cvičení Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu). Reakční schéma (objemy jsou uvedeny v |il): Komponenta Množství NEB pufr4(10x) 2,0 \ú BSA (lOx) 2,0 \ú restriktázaMalV (10 U/pl) 1,0 \ú PCR produkt (asi 100 ng/jil) 15,0 \ú Celkem 20,0 \ú 46 Vyhodnocení alela počet fragmentů bp nestandardní homozygot 3020insC/3020insC 2 130 a 39 heterozygot wild-type/3020insC 3 168, 130 a 39 standardní homozygot wild-type/wild-type 1 168 Další informace k této problematice najdete v Ogura Y. et al. 2001: A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature 411: 603-606. Hugot J.-P. et al. 2001: Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature 411: 599-603. Kontrolní otázky a příklady 1) Napište sekvenci nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací standardní alely 2) Napište sekvenci nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací nestandardní alely a vyznačte v ní pozici restrikčního místa pro restriktázu NlaTV 3) Napište sekvenci aminokyselin v místě inserce a dále po směru translace pro standardní a nestandardní alelu. Porovnejte rozdíl. 47 Detekce polymorfismu v genu pro TMPT (thiopurin S-methyl transferáza) metodou real-time PCR (cvičení č. 12) Úvodní slovo TMPT se podílí na metabolismu thiopurinových léčiv (6-merkaptopurin, azathioprin) používaných jako cytostatika či imunosupresiva. Heterozygotní a homozygotní nositelé nestandardních alel mají sníženou aktivitu TMPT, která má za následek kumulaci aktivní látky v organizmu a projevům netolerance při standardním dávkovacím schématu cytostatika. Homozygotní nositelé standardní alely mají zvýšenu (standardní - ovšem v literatuře se také objevuje spojení „standard or high" existuje ale i alela TPMT*1A (C-178T), která má vyšší aktivitu než ta standardní) aktivitu TPMT a rychle odbourávají účinnou látku; to vede k riziku relapsu nádorového onemocnění. Metoda využívá tzv. „real-time" PCR, co je kombinované provádění DNA amplifikace a detekce cílové nukleové kyseliny současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu s fluoroforů. Fluorofory se navazují na amplikony nebo jsou jimi značeny hybridizační sondy. V reakci dokazující přítomnost polymorfizmu (je přítomna sekvence standardní alely a sekvence nestandardní alely) je konkrétní alela asociována s fluorescencí konkrétního fluoroforů. Na základě přítomnosti signálů jednotlivých fluorescenčních látek (kvalitativní stanovení) je určen genotyp. Real-time PCR umožňuje také kvantitativní analýzu vzorku. Díky vztahu mezi intenzitou záření fluoroforů a množstvím k sondě komplementární DNA, která jej uvolní je, možné stanovit kvantitativní množství matrice vložené do reakce (kvantitativní PCR). Cíl cvičení Detekovat polymorfizmus v genu pro TMPT ve vzorku DNA z lidské krve izolované ve cvičení č. 1. Je možno použít DNA izolovanou též z plasmy, spermatu, a jiného biologického materiálu. Koncentrace DNA byla stanovena ve cvičení č. 4 nebo 5. Seznam přístrojů • termocykler StepOne • pikofuga • sada pipet o objemech 0,5-10 ul, 5-50 ul, 20-200 ul Sekvence použitých sond Sonda VIC 5' - CCAACTACACTGTGTCCCCGGTCTGCAAACCTGCATAAAATCATACATTTA - 3' Sonda FAM 5' - CCAACTACACTGTGTCCCCGGTCTGGAAACCTGCATAAAATCATACATTTA - 3' 48 Vlastní pracovní postup Amplifíkace 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 ul, 5 až 50 ul, 0,5 až 10 ul), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro pět reakcí smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 6 reakcí Master mix (2X) 10,0 60,0 H20 7,0 -47,0 Assay mix (20X) 1,0 0,6 DNA 2,0 0,6 4) Směs rozdělte po 18 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 5 reakcí, ovšem v důsledku chyb při pipetování vám už asi na pátou reakci směs stačit nebude. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 2 ul izolované DNA B = 2 ul DNA standardního homozygota C = 2 ul DNA nestandardního homozygota D = 2 ul DNA heterozygota N = 2 ul deionizované vody - slouží jako negativní kontrola 6) Uzavřete zkumavky a vložte je do Step-One termocykleru. 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 60 °C 30s 2 95 °C 10 min 3 95 °C 15 s 4 60 °C 1 min 5 GO TO 3 40x 6 60 °C 30 s 7 10 °C nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení procesu amplifikace program vyhodnotí data a na základě fluorescence určí genotyp 49 Vyhodnocení Experiment: TPMT RT 9,12,2008 cviko Type: Genotyping Reagents: TaqMan® Reagents Reanaiyse Allelic Discrimination Plot e Plot Settings \ SNP Assay: Plot Type: C_12091562_30 >J Apply Call: [Mixed Cartesian *\ i 1 SNP Assay Flag Found! 1 ÍH I— Allelic Discrimination Plot Leyend - *C/G A Si J V - X E 1 X ■: J n v 1 1 «6/6 ^Undetermined View Plate Layout View Well Table -SelectItem - t| |^ ' Show in Wells T irg: View Legend 2 3 4 5 íík, T a Tji Ta Tis T T Ta j|] C_12. C_12. IJJ] C_12. [J] C_12 [j] C_12. £j] C_12. C_12. Q C_12 Q C_12. [J] C_12 0] C_12.. JI] C_12 0] C_12.. [j] C_12 [J] C_12.. [J] C_12 Wells: 0] 16 Unknown [Jj 1 Negative Control Qo Positive Control 31 Empty Další informace k této problematice najdete v Yates C. R. et al.1997: Molecular diagnosis of thiopurine S-methyltransferase deficiency: Genetic basis for azathiopurine and mercaptopurine intolerance. Ann. Intern. Med. 126: 608-614 Podrobný popis metodiky najdete na www.appliedbiosystems.com Kontrolní otázky a příklady 1) Popište základní princip kvalitativního a kvantitativního stanovení genotypu pomocí realtime PCR 50 Poznámky 51 Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu (cvičení č. 13) Úvodní slovo Elektroforéza v agarózovém gelu je standardní metoda pro dělení, identifikaci a purifikaci fragmentů DNA. Touto relativně jednoduchou metodou je možné rozdělit i komplexní směsi fragmentů DNA, které nelze rozdělit jinými způsoby, například centrifugací v hustotním gradientu. Kromě toho je při elektroforéze možné přímo sledovat jak polohu jednotlivých fragmentů a tím stanovit jejich velikost, tak díky fluorescenci po „obarvení" ethidiumbromidem odhadnout i jejich koncentraci. Princip elektroforézy spočívá v protlačování fragmentů DNA (nebo v principu jakýchkoli jiných makromolekul) rozpuštěných v tekutém prostředí ve stejnosměrném elektrickém poli molekulovým sítem, který tvoří gel agarózy. Chemická struktura agarózy, to jsou střídající se zbytky D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-laktózy, vzájemně spojené střídavě vazbami P-l-4 a a-1-3. Elektroforetickou pohyblivost ovlivňuje řada faktorů. Základní silou, která určuje pohyb DNA je skutečnost, že součástí struktury DNA jsou zbytky kyseliny fosforečné, které dávají molekule DNA celkový záporný náboj. Proto DNA putuje ve stejnosměrném elektrickém poli od záporného ke kladnému pólu. Rychlost pohybu DNA v elektrickém poli však není dána velikostí náboje, ale především jejími rozměry. Lineární fragmenty DNA se pohybují rychlostí, která je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Dalším důležitým faktorem je koncentrace agarózového gelu. Čím je vyšší koncentrace agarózy, tím hustší je síť, kterou musí fragmenty DNA procházet. Existují různé komerčně dostupné druhy agaróz, ale obecně platí, že na běžném agarózovém gelu (používají se koncentrace 0,6% až 3,0%) lze úspěšně rozdělit fragmenty o velikostech od 100 bp do 20 000bp (20kbp). Větší fragmenty vyžadují jiné uspořádání, tzv. pulsní gelovou elektroforézu. Rovněž konformace DNA má vliv na její pohyb. Jinou rychlostí se pohybují kompaktní struktury CCC plasmidové DNA, jinou její OC formy a jinou lineární fragmenty. Kromě toho je elektroforéza ovlivňována intenzitou elektrického pole, složením elektroforetického média (pufru) a teplotou. V tomto cvičení provedete elektroforézu ve 2% agarózovém gelu, v tris-borátovém pufru při laboratorní teplotě při napětí 10 V/cm gelu (optimální je 5 V/cm). DNA je v gelu detekována po „obarvení" ethidiumbromidem. Ethidiumbromid, který má planární strukturu se vmezeřuje mezi báze v nukleové kyselině. Po ozáření krátkovlnným ultrafialovým zářením fluoreskuje červeným světlem o vlnové délce 590 nm a to je možno zachytit fotografickým zařízením. Ethidiumbromid vmezeřený v DNA září asi 80x intenzivněji než ve volném stavu. Cíl cvičení Detekovat amplifikační produkty z předchozích cvičení. Seznam přístrojů • váhy s váživostí +/- 0,1 g • aparatura pro elektroforézu • mikrovlnná trouba • sada pipet o objemech 10, 50 a 200 (ll 52 Příprava gelu 1) Připravte 1 litr 0,5xTBE pufru ze základního roztoku 5xTBE. 2) Změřte velikost gelu, jehož výška musí být 6 mm. 3) Spočítejte objem gelu a navážku agarózy na 2% gel. 4) Navážku agarózy vsypte do Erlenmeyerovy baňky o objemu alespoň 2x větším, než je uvažovaný objem gelu. 5) Odměřte objem 0,5xTBE pufru a nalijte do Erlenmeyerovy baňky s agarózou. 6) Vynulujte váhy s Erlenmeyerovou baňkou. 7) Dokonale rozvařte agarózu v mikrovlnné troubě, tzn. za průběžného míchání přivést 3 až 4x k varu. Pozor na utajený var ! 8) Znovu zvažte Erlenmeyerovu baňku s rozvařenou agarózou a úbytek hmotnosti doplňte destilovanou vodou. 9) Zchlaďte rozvařenou agarózu na teplotu 50 až 60 °C (odhadem). 10) Přidejte roztok ethidium bromidu (0,15 mg/ml) v množství stanoveném podle objemu gelu. Platí, že množství přidaného objemu roztoku ethidiumbromidu v mikrolitrech musí být stejné jako objem gelu v mililitrech. 11) V průběhu zchlazování agarózy upevněte matrici pro tvorbu komůrek (hřebínek) do nalévací aparatury. Dolní okraj hřebínku se nesmí dotýkat dna - optimální je výška lmm nad dnem. Nalévací aparatura musí být umístěna na vodorovné podložce. 12) Ochlazenou agarózu nalijte po opatrném ale důkladném zamíchání do nalévací aparatury, čistou špičkou odstraňte případné bubliny. 13) Nechte gel zatuhnout (asi 30 min.). 14) V průběhu tuhnutí nalijte elektroforetický pufr do elektroforetické vany. 15) Po zatuhnutí gelu vložte nalévací aparaturu včetně hřebínku do elektroforetické vany. 16) Tahem kolmo vzhůru vyjměte hřebínek. 17) Zkontrolujte neporušenost komůrek pro nanášení vzorku. 18) Zkontrolujte výšku hladiny pufru nad gelem - musí být alespoň lmm nad gelem. Nanesení vzorků, elektroforéza 1) Upravte polohu černé fólie pod nanášecí komůrky. 2) Do vzorku po PCR napipetujte koncentrovaný nanášecí pufr (6 x GLB) v poměru vzorek : 6 x GLB = 5 : 1. 3) Pipetou naneste 10 (ll směsi do komůrek pod hladinu elektroforetického pufru. 4) Připojte elektroforetické kabely k vaně, zasuňte bezpečnostní kryt a připojte kabely ke zdroji - černý kabel k zápornému pólu, červený kabel ke kladnému pólu. Pozor na správnou orientaci vany. DNA putuje od minus k plus pólu! 5) Proveďte elektroforézu při 10 V/cm gelu. 6) Po 5 minutách zkontrolovat průběh elektroforézy, zejména správný směr pohybu detekční barvičky (bromfenolová modř) obsažené v 6 x GLB pufru. 7) Poté, co detekční barvička dosáhne asi 2/3 gelu (nebo uběhne předepsaná doba po kterou se má elektroforéza provádět, což je v našem případě asi 30 min.), ukončete elektroforézu. 8) Odpojte elektrické kabely od zdroje. 9) Nasaďte si rukavice. 10) Odsuňte bezpečnostní kryt z elektroforetické vany. 11) Přeneste gel na UV-transluminátor, proveďte vizuální kontrolu gelu, případně vyfotografujte na dokumentačním zařízení. 53 Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Složení roztoků 5 x Tris-borátový pufr (5xTBE pufŕ) (0,089M tris-borát/0,089M kyselina boritá/0,002M EDTA) 1) Navažte a postupně rozpusťte v 900 ml destilované vody 54 g trishydroxymethyl-aminomethanu a 27,5 g kyseliny borité. 2) Přidejte 20 ml 0,5M EDTA (pH 8,0). 3) Doplňte objem na 1 000 ml v analytické odměrné baňce. 4) Přelijte roztok do 1 000 ml láhve se šroubovacím uzávěrem. 5) Skladujte pň 4 až 8 °C, pň tomto způsobu skladování možno používat 6 měsíců. Zásobní roztok ethidiumbromidu (10 mg/ml) Ethidiumbromid je červená krystalická látka. Je to mutagen a karcinogén, proto je nutné při jakékoli manipulaci s touto látkou nebo roztoky, které ethidiumbromid obsahují, pracovat v rukavicích a dodržovat zásady manipulace s mutageny a karcinogény ! 1) Na analytických vahách navažte 100 mg krystalického ethidiumbromidu do umělohmotné zkumavky s uzávěrem. 2) Pňdejte 10 ml destilované vody. 3) Po rozpuštění ethidiumbromidu skladujte roztok pň laboratorní teplotě ve tmě, možno skladovat po dobu 5 let. Nanášecí elektroforeticky pufŕ s barvičkou (6 x GLB) Pufŕ se připravuje v šestinásobném zahuštění, obsahuje detekční barvičku bromphenol blue. 1) Na analytických vahách navažte 0,5 g bromfenolové modři 2) Rozpusťte v 50 ml 1 x TBE pufru. 3) Pňdejte 50 ml glycerolu. 4) Doplňte objem do 200 ml pomocí 1 x TBE pufru v analytické odměrné baňce. 5) Sterilizujte v přehřáté páře pň 112 °C/30min. 6) Část roztoku po 1 ml sterilně rozpipetujte do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek typ „Eppendorf". 7) Rozpipetované dávky a zbytek uskladněte pň 4 až 8 °C, lze skladovat po dobu 10 let. 54 Kontrolní otázky a příklady 1) Závislost velikosti DNA na elektroforetické není lineární. V určitém zjednodušení může být vyjádřena logaritmickou funkcí. Stanovte délku amplifikačního produktu z obrázku výsledné elektroforézy. START Elektroforetická pohyblivost amplikonu = 34,0 mm Standard A B C D E Velikost standardů A = 500 bp B = 400 bp C = 300 bp D = 200 bp E = 100 bp Elektroforetická pohyblivost 29,0 mm 32,5 mm 35,5 mm 38,0 mm 45,0 mm Návod řešení: Vyneste hodnoty přirozeného logaritmu velikosti standardů a elektroforetické pohyblivosti do grafu a z něho pak odečtěte velikost amplikonu. \ = ln X kde N = elektroforetická pohyblivost v cm X = velikost DNA fragmentu v bp 2) Jaká je výsledná koncentrace ethidiumbromidu ve Vámi připraveném agarózovém gelu? 3) Kolik ml zásobního roztoku ethidiumbromidu (10mg/ml) použijete pro přípravu 100 ml roztoku o koncentraci 0,15 mg/ml? 55 Izolace DNA z agarózového gelu (cvičení č. 14) Úvodní slovo Během PCR reakce vznikají v malém množství i nespecifické amplikony. Pro některé aplikace (in vitro translace, klonování) je nutné získat potřebné úseky DNA ve velmi čisté podobě, bez příměsí nespecifických amplikonů a v roztoku, který by neinhiboval následné reakce. Po rozdělení produktů takové PCR reakce v agarózovém gelu, je možné požadovaný fragment DNA (amplikon) z gelu vyříznout a izolovat ho. K tomuto účelu byly vyvinuty komerčně dostupné soupravy, které to umožňují. Základem je pufr, který rozpustí agarózu a uvolní tak DNA do roztoku. Následuje navázání DNA na kolonku, její promytí a eluce do požadovaného roztoku. Takto izolovaný PCR fragment je velmi čistý, bez přítomnosti nespecifických produktů a solí. Cíl cvičení Izolovat PCR amplikon z agarózového gelu. Seznam přístrojů • sada pipet o objemech 10, 100 a 1000 (ll • suchý termoblok • centrifuga na 1,5 ml mikrozkumavky s otáčkami do 14.000 rpm (20.000 g) Vlastní postup 1. Vyřízněte DNA fragment z gelu pomocí skalpelu. Odstraňte co nejvíce nadbytečné agarózy. 2. Zvažte kousek gelu v mikrozkumavce a přidejte 3 objemy QG pufru na 1 objem gelu (100 mg ~ 100 \ň). 3. Inkubujte 10 min. při 50 °C (nebo dokud se gel nerozpustí). Pro urychlení rozpouštění, vortexujte vzorek každé 2-3 min. 4. Až se gel rozpustí, přidejte 1 objem gelu (100 mg ~ 100 \ň) isopropanolu ke vzorku a zamíchejte (pokud má fragment velikost 500 až 4 000 bp, je možné tento krok přeskočit). 5. Naneste vzorek do kolonky a centrifugujte 1 min/ 10 000 g. Maximální kapacita kolonky je 800 \ň, pokud je objem vzorku větší, opakujte krok 5 se zbytkem vzorku na stejné kolonce. 6. Odstraňte proteklou fázi a vraťte kolonku zpět do sběrné zkumavky. 7. Přidejte 500 \ň QG pufru do kolonky a centrifugujte 1 min/ 10 000 g. V tomto kroku se odstraní veškeré zbytky agarózy. 8. Odstraňte proteklou fázi a vraťte kolonku zpět do sběrné zkumavky. 9. Přidejte 750 \ň PE pufru do kolonky a centrifugujte 1 min/ 10 OOOg. 10. Odstraňte proteklou fázi a vraťte kolonku zpět do sběrné zkumavky. 11. Centrifugujte 1 min/ při maximálních otáčkách pro odstranění reziduálního alkoholu z PE pufru. 12. Umístěte kolonku do čisté 1,5 ml mikrozkumavky. 13. Naneste 50 \ň EB pufru na střed membránky a centrifugujte 1 min/ 10 000 g. 14. Popište zkumavku a uchovejte vzorek s čistým PCR amplikonem. 56 Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Kontrolní otázky a příklady 1) Spočítejte jaké přetížení působí na dně zkumavky na materiál, jestliže jste na vaší centrifuze použili maximální otáčky (krok 11. návodu), tj. 14 000 rpm. Poloměr rotoru je 7 cm. 57 Izolace RNA z myší tkáně (cvičení č. 15) Úvodní slovo Typická savčí buňka obsahuje přibližně desítky fg (femtogramů) RNA. Z toho 80-85 % tvoří ribozómová RNA (28S, 18S, 5,8S a 5S). Zbylých 15-20% sestává z rozličných nízkomolekulárních druhů, tj. transferových RNA a malých jaderných RNA. Tyto druhy RNA jsou charakteristické definovanou velikostí a specifickými sekvencemi, proto je lze izolovat v poměrně čisté formě pomocí gelové elektroforézy, centrifugací v hustotním gradientu, iontoměničovou nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Naproti tomu mediátorová RNA, mRNA, která tvoří 1 až 5 % celkové buněčné RNA představuje heterogenní skupinu molekul jak z hlediska velikosti (několik set až mnoho kilobází), tak sekvencí. Většina eukaryotické mRNA ale nese na svém 3'-konci úseky polyA díky kterým lze mRNA purifikovat afinitní chromatografií na oligo(dT) celulóze. Protože ribóza obsahuje ve své struktuře hydroxylové skupiny v pozicích 2'a 3', je RNA chemicky mnohem reaktivnější než DNA a snadno se štěpí kontaminujícími RNázami. RNázy jsou enzymy, které hydrolyzují diesterové vazby spojující fosfát a zbytek ribózy. Protože jsou RNázy uvolňovány v průběhu lyže buňky a jsou také přítomny na kůži, je třeba být velmi opatrní při přípravě roztoků a pomůcek. RNázy jsou jednoduché enzymy složené z jediného polypeptidového řetězce, který navíc obsahuje několik intramolekulárních disulfidových můstků. Z těchto důvodů snadno renaturují a jsou proto velmi odolné vůči denaturaci varem nebo slabými denaturačními činidly. Nevyžadují jako kofaktory dvojmocné katióny a proto je, na rozdíl od DNáz, nelze inaktivovat pomocí chelatačních činidel, například ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA). Nej spolehlivějším způsobem, jak se vyhnout problémům s RNázami, je vůbec jimi zpracovávaný materiál nekontaminovat. Přítomnost endogenních RNáz má za následek rychlou degradaci mRNA, proto je třeba odebírané tkáně co nejdříve zchladit, nejlépe na -70 °C. Rovněž při izolaci je třeba pracovat při snížené teplotě. Problémy s RNázami se řeší použitím inhibitorů RNáz. Existují tři druhy těchto inhibitorů: 1) Diethylpyrokarbonát (DEPC), alkylační činidlo, které se používá k inaktivaci RNáz v pufrech a pomůckách používaných k izolaci. Protože poškozuje i jiné proteiny a RNA, nelze jej použít při vlastní izolaci a purifikaci RNA a je nekompatibilní s některými pufry (například Trisem, ...). 2) Vanadyl ribonukleozidové komplexy, analogy které se vážou do aktivních míst mnoha RNáz a tím většinou kompletně inhibují jejich katalytickou aktivitu. Protože nemodifikují RNázy kovalentně musí být přítomny po celou dobu extrakce a purifikace RNA. Protože ale inhibují i RNA polymerázy a translaci in vitro, je nutné je před posledním krokem izolace odstranit (k tomu účelu se používá několikanásobná extrakce fenolem s přídavkem 0,1% hydroxychinolinu). 3) Proteinové inhibitory RNáz, proteiny o molekulové hmotnosti přibližně 50 000. Vyskytují se v cytoplasmě prakticky všech savčích tkání a ve velkém množství je lze izolovat z placenty. V podmínkách in vivo tyto proteiny fungují jako inhibitory proteinů patřících k superrodině pankreatických RNáz, zejména angiogeninu. Proteinové inhibitory RNáz působí specificky, neovlivňují jiné procesy v buňce a neinteragují s jinými složkami při izolaci RNA. Protože s RNázami netvoří kovalentní komplexy, nemohou být použity v přítomnosti denaturačních činidel, jako jsou SDS nebo guanidin, které se používají v prvních krocích izolace RNA, ve všech dalších krocích purifikace jsou už však účinné. Fenol je ničí. 58 Cíl cvičení Izolovat mediátorovou RNA z různých tkání myši. Seznam přístrojů • laboratorní váhy • třecí miska (sterilní, RNase-free) • mikrozkumavky (sterilní, RNase-free) • zláštní sada pipet používaná pouze k izolaci RNA • skalpel (sterilní, RNase-free) • centrifuga na mikrozkumavky • nádoba s ledem • vortex Příprava sterilního či RNase-free materiálu Třecí misku lx propláchněte roztokem RNaseZapu (Ambion, USA), 2x propláchněte destilovanou či DEPC vodou, usušte, zabalte do alobalu a sterilizujte v sušárně 2hod/200 °C. Čistý skalpel lx propláchněte roztokem RNaseZapu (Ambion, USA), 2x propláchněte destilovanou či DEPC vodou, usušte, zabalte do alobalu a sterilizujte v sušárně 2hod/200 °C Vlastní pracovní postup K izolaci použijte komerční soupravu RNeasy Mini Kit (QIAGEN). 1) Čerstvou tkáň či tkáň zmraženou na -70 °C vložte do nádoby s ledem, sterilním skalpelem uřízněte kousek potřebné velikosti (minimálně 0,5x0,5cm) a přeneste do mikrozkumavky. 2) Na laboratorních vahách předvažte prázdnou mikrozkumavku, vynulujte váhy, poté vyměňte za mikrozkumavku obsahující tkáň a zjistěte hmotnost kousku tkáně. 3) Tkáň přeneste do sterilní třecí misky a homogenizujte v prostředí tekutého dusíku. 4) Přidejte 350 ul lyzačního roztoku RLT s přídavkem p-merkaptoethanolu (10 ul p-merkaptoethanolu na lml roztoku RLT). Roztok obsahuje inhibitory RNáz. 5) Přeneste lyzát do kolonky QIAshredder a centrifugujte po dobu při 14 000 g při laboratorní teplotě po dobu 2 min. Tím dojde k dokonalé homogenizaci vzorku. 6) Odstraňte kolonku a k lyzátu přidejte 350 ul 70% ethanolu, promíchejte pipetováním. Dojde k vysrážení RNA, kterou pak zachytíte na filtru (krok 7). Po přidání ethanolu se může vytvořit precipitát, na konečný výsledek to však nemá vliv. 7) Přeneste 700 ul vzorku, včetně případného precipitátu, na kolonku „RNeasy mini column". 8) Centrifugujte při 8 000 g při laboratorní teplotě po dobu 15 sekund. Odstraňte fázi, která proteče na dno jímací zkumavky. Na filtru zachycenou RNA nyní promyjete několika roztoky. 9) Na filtr kolonky napipetujte 700 ul pufru RW1 a centrifugujte při 8 000 g při laboratorní teplotě po dobu 15 sekund. Odstraňte fázi, která proteče na dno jímací zkumavky. 10) Přeneste kolonku do nové jímací zkumavky. Na filtr kolonky napipetujte 500 ul pufru RPE a centrifugujte při 8 000 g při laboratorní teplotě po dobu 15 sekund. Odstraňte fázi, která proteče na dno jímací zkumavky. Upozornění! Při prvním použití pufru RPE do něj nezapomeňte přidat ethanol podle doporučení výrobce. 59 11) Opakujte promytí, tj. na filtr kolonky napipetujte 500 ul pufru RPE a centrifugujte při 8 000 g při laboratorní teplotě, tentokrát po dobu 2 min. Odstraňte fázi, která proteče na dno jímací zkumavky. 12) Filtr v kolonce musí v kroku 11) dokonale vyschnout. Proto je vhodné vložit kolonku do nové jímací zkumavky a centrifugovat při 14 OOOg při laboratorní teplotě, tentokrát po dobu 1 min 13) Přeneste kolonku do nové zkumavky (RNase-free) a přímo na filtr napipetujte 30 až 50 ul RNase-free vody. Centrifugujte při 8 000 g při laboratorní teplotě po dobu 1 min. RNA je na dně zkumavky, uskladněte ji při -70 °C. Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 60 Kontrolní otázky a příklady 1) Jedna savčí buňka obsahuje 100 fg RNA. Kolik je to ribonukleotidů? Jeden ribonukleotid má molekulovou hmotnost přibližně 360. 2) Koncentraci RNA lze podobně jako koncentraci DNA stanovit spektrofotometricky. Platí převodní vztah, že ssRNA má koncentraci 40 (J,g/ml, jestliže OD260 v lem kyvetě je rovna 1,0. Přepočtěte tento údaj na molaritu. 3) Jaká je kódovací kapacita (uveďte v počtu aminokyselin) molekuly mRNA, která má molekulovou hmotnost 108 000. Předpokládejte, že všechny nukleotidy v molekule této mRNA se uplatní při tvorbě kodonů, zanedbejte regulační oblasti. 61 Zpětná transkripce a příprava cDNA genu pro G3PDH (cvičení č. 16) Úvodní slovo Zpětná transkripce pomocí oligo dT umožňuje přepis všech mRNA vláken do odpovídajících cDNA. Ke zjištění, zda zpětná transkripce proběhla, je třeba provést amplifikaci na některý housekeeping gen (vyskytuje se ve všech tkáních u velkého množství organismů). Jedním z takovýchto genů je gen pro G3PDH (glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenáza), který po amplifikaci dává fragment o velikosti 983 bp. V případě pozitivního výsledku na G3PDH lze předpokládat, že zpětná transkripce proběhla v pořádku a testované vzorky lze podrobit dalším pokusům. Cíl cvičení Připravit cDNA a amplifikovat G3PDH z celkové RNA izolované ve cvičení č. 11. Seznam přístrojů • vodní lázeň • nádoba s ledem • chladící bloček na -20 °C • pikofuga • mikrozkumavky (sterilní, RNase-free) • umělohmotné špičky na pipety (sterilní) • termocykler Vlastní pracovní postup 1. Příprava cDNA K přípravě cDNA použijte komerční soupravu „Advantage RT-for-PCR Kit" (Clontech) 1) Předehřejte vodní lázeň na 70 °C. 2) Připravte si vaničku s ledem. 3) Vytáhněte z mrazáku komponenty soupravy „Advantage RT-for-PCR Kit", tedy DEPC-treated water, Oligo dT primer - 20 uM, 5x Reaction buffer, Recombinant Rnase inhibitor - 40 U/ul, dNTP mix (10 mM each), Control RNA - 1 ug/ul, uložte vše na led a nechejte rozmrznout. 4) Vytáhněte izolovanou RNA (rozpuštěnou ve vodě) z -70 °C, uložte na led a nechejte rozmrznout. 5) Po rozmražení všech komponent je všechny krátce stočte na pikofuze a vraťte na led. 6) Do 0,5ml PCR zkumavky, označené V (jako VZOREK) napipetujte 0,2-1 ug RNA (celkový objem musí být 12,5 ul, chybějící množství doplňte vodou). 7) Do další zkumavky označené písmenem K (jako KONTROLA) napipetujte 1 ul „Control RNA" a 11,5 ul vody. Tato zkumavka slouží jako pozitivní kontrola zpětné transkripce). 62 8) Do obou zkumavek přidejte 1 [ú 20[jM „Oligo dT primem", promíchejte pipetováním (špička s filtrem) a stočte případné kapky, které by vznikly na stěnách zkumavek. 9) Směs RNA s „Oligo dT primery" zahřejte ve vodní lázni na 70 °C/2 min. a rychle přeneste zpět na led. 10) Dále přidejte: 4 [ú 5x Reaction bufferu, 1 [ú 10 mM dNTP, 0,5 [ú Recombinant RNase inhibitoru, promíchejte pipetováním (špička s filtrem) a stočit případné kapky, které by vznikly na stěnách zkumavek. 11) Z mrazáku vytáhněte „MMLV reverse transcriptase" a udržujte ji na chladícím bločku. 12) Přidejte 1 [ú „MMLV reverse transcriptase" ke směsi a promíchejte pipetováním. 13) Reakční směsi vložte do termocycleru a spusťte program RT (inkubace 42 °C/1 hod., zahřátí 94 °C/5 min.) 14) Po skončení programu vyjměte reakční směsi a krátce stočte na pikofuze. 15) Zředťe cDNA přidáním 80 [ú DEPC vody a promíchejte pipetováním (špička s filtrem). 16) Rozpipetujte cDNA do malých PCR zkumavek po 10 \d, popište a uložte do -70 °C. 17) cDNA určenou k okamžitému použití ihned uložte na led. 2. Kontrola průběhu zpětné transkripce - příprava genu pro G3PDH amplifikací Použité primery Komerční primery ze soupravy „Advantage RT-for-PCR Kit" (CLONTECH), primery poskytují amplikon o velikosti 983 bp. Vlastní pracovní postup 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (ll, 5 až 50 (ll, 0,5 až 10 (ll), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro čtyři reakce smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 4 reakce Taq Master Mix (QIAGEN) 25,0 100,0 Voda deionizovaná 14,6 68,4 PrimerF(100(lM) 0,2 0,8 PrimerR(100(lM) 0,2 0,8 4) Směs rozdělte po 40 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 4 reakce, potřebujete 3 reakce, zbytek směsi zůstane nevyužit. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 10 (ll cDNA ze vzorku V B = 10 (ll cDNA ze vzorku K N = 10 (ll deionizovaná vody. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 63 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 5 min 2 94 °C 45 s 3 60 °C 45 s 4 72 °C 2 min. 5 GO TO 2 25x 6 72 °C 7 min 7 10 °c nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1% agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Advantage RT-for-PCR Kit. Manuál firmy BD Biosciences, USA. 64 Kontrolní otázky a příklady 1) Jedna jednotka zpětné transkriptázy z Moloney Murine Leukémia Viru (M-MuLV) inkorporuje 1 nmol dTTP do struktury DNA na RNA matrici za 10 minut při 37 °C. Za předpokladu, že podobnou rychlostí inkorporuje ostatní deoxyribonukleotidy stanovte rychlost v nukleotidech za sekundu. 2) S jakou četností se na nahodilé sekvenci mRNA může vyskytovat specifický hexanukleotid? 3) Uvažujte rychlost syntézy DNA zpětnou transkriptázou podle zadání v úloze č. 1. Kolik [ú zpětné transkriptázy ze zásobního roztoku o koncentraci 20 000 U/ml použijete k přípravě molekul DNA o průměrné délce 500 nukleotidů tak, aby teoretický výtěžek při 10% účinnosti syntézy činil 500 ng DNA? 65 Příprava rekombinantního genu pro lidský leptin amplifikací (cvičení č. 17) Úvodní slovo Mechanismus, kterým je vyvažován příjem potravy a výdej energie, určuje, kdo bude obézní a kdo štíhlý. Jedním z hormonů, které regulují energetickou rovnováhu, je produkt genu ob - leptin. Název proteinu - leptin - pochází z řeckého slova leptos = tenký. Mutace v genu ob má u myší za následek extrémní obezitu a diabetes typu II jako součást syndromu, který se podobá morbidní obezitě u lidí. Leptin je řazen mezi cytokiny s helikální strukturou skupiny TNF (tumor necrosis factor). Funguje v signální dráze vedoucí od adipózní tkáně do hypothalamu, kde působí na regulaci množství tělního tuku. Hlavním místem exprese leptinu je bílá tuková tkáň, velmi slabá exprese byla zjištěna v hnědé tukové tkáni. Leptin je dále exprimován v placentě, buňkách granulosy preovulačního folikulu, v ovocytu a v menší míře i v jiných tkáních. Prvním a hlavním účinkem leptinu je působení přes specifické receptory umístěné v CNS (v hypotalamu) a v periferních tkáních. Leptin omezuje příjem potravy a zvyšuje energetický výdej, působí tedy jako lipostat. Leptin už dnes většina vědecké obce přijímá jako klíčovou komponentu lipostatu, teoretického fyziologického mechanismu, který kontroluje adipositu. Zjednodušeně řečeno, leptin signalizuje množství tukové tkáně centrálnímu nervovému systému. Přímo inhibuje koncentraci vnitrobuněčných tuků omezováním syntézy mastných kyselin a triglyceridů a současným zvyšováním oxidace lipidů. Leptin hraje úlohu také v reprodukci, regulaci nástupu puberty, při anorexii a bulimii a řadě poruch, které souvisí s výživou. Gen pro lidský leptin byl objeven v roce 1994. Je lokalizován na chromozómu 7 v pozici 7q31.3, je dlouhý 650 kbp a obsahuje 3 exony oddělené 2 introny. První intron, dlouhý 10,6 kbp se nachází v nepřekládané oblasti na 5'-konci, 29 bp proti směru transkripce od iniciačního kodonu ATG. Druhý intron je dlouhý 2,3 kbp. Exony mají délku 29, 172 a 4039 bp. Oblast, na které dochází k iniciaci transkripce, se nachází 54-57 bp proti směru transkripce od iniciačního kodonu. Gen ob se přepisuje do hnRNA dlouhé 4,5 kb, která je postranskripčně upravována do mRNA dlouhé 504 bp. Alternativním sestřihem v místě glutamin +49 vznikají po translaci dvě varianty leptinu dlouhé 166 nebo 167 aminokyselin. Produkt translace má charakteristiky typické pro sekretované proteiny, po translaci je z pre-proteinu odštěpeno 21 aminokyselin signální sekvence. Cíl cvičení Připravit amplikon genu ob s připojenými restrikčními místy pro účely klonování do plasmidového vektoru. Stanoveného cíle dosáhnete dvoukrokovou amplifikací. V prvním kroku připravíte tzv. primární amplikon, který přesahuje kódující sekvenci genu ob po obou stranách. Ve druhém kroku z tohoto amplikonu připravíte kratší úsek, tzv. sekundární amplikon, který vymezuje kódující sekvenci a má připojeny sekvence specifické pro dvě vybrané reštrikční endonukleázy. Amplikon získaný ve druhém kroku je výchozím materiálem pro klonování (cvičení č. 14). Jako výchozí materiál bude použita cDNA z lidské tukové tkáně nebo lidské placenty dodávaná firmou CLONTECH. cDNA je také možno připravit z mRNA postupem popsaným ve cvičeních č. 11 a 12. 66 Seznam přístrojů • termocyklerPTC-100 • pikofuga • sada pipet o objemech 10, 50 a 200 (ll Použité primery LEP-2: 5'- CTT CTT GGG AAG GAA AAT GC - 3' LEP-530: 5'- GTA GAC TTG CAG GAA GAG TG - 3' Těmito primery je možno získat primární amplikon o velikosti 548 bp HLEP81KPN: 5'-GCN NNG GTA CCC GTG CCC ATC CAA AAA GTC CA -3' HLEP524XBA: 5'- GCN CTC TAG AGG TCA GCA CCC AGG GCT GAG GTC -3' Těmito primery je možno získat sekundární amplikon o velikosti 462 včetně připojených restrikčních míst pro restriktázy Kpn I a Xba I. Vlastní pracovní postup Příprava primárního amplikonu 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (ll, 5 až 50 (ll, 0,5 až 10 (ll), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro čtyři reakce smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v jíl 1 reakce 4 reakce Taq Master Mix (QIAGEN) 25,0 100,0 Voda deionizovaná 14,6 68,4 Primer LEP-2 (100(lM) 0,2 0,8 Primer LEP-530 (100(lM) 0,2 0,8 4) Směs rozdělte po 40 (ll do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 4 reakce, potřebujete 3 reakce, zbytek směsi zůstane nevyužit. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 10 (ll cDNA ze vzorku V B = 10 (ll cDNA ze vzorku K N = 10 (ll deionizovaná vody. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 67 7) Proveďte amplifikaci dle následujícího programu: Krok č. Teplota Doba 1 94 °C 5 min 2 94 °C 30 s 3 58 °C 30 s 4 72 °C 1 min. 5 GO TO 2 34x 6 72 °C 5 min 7 10 °c nekonečný čas 8 END 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1,5% agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Příprava sekundárního amplikonu 1) Připravte si mikropipety (rozsah 50 až 200 (li, 5 až 50 (li, 0,5 až 10 ul), tři druhy špiček s filtrem, PCR zkumavky, stojánek. 2) Nasaďte si rukavice. 3) Namíchejte směs pro čtyři reakce smícháním následujících komponent: Komponenta Objem v ul 1 reakce 4 reakce Taq Master Mix (QIAGEN) 25,0 100,0 Voda deionizovaná 14,6 68,4 Primer HLEP81KPN (lOOuM) 0,2 0,8 Primer HLEP524XBA (lOOuM) 0,2 0,8 4) Směs rozdělte po 40 ul do čtyř zkumavek. Poznámka: Připravili jste směs na 4 reakce, potřebujete 3 reakce, zbytek směsi zůstane nevyužit. 5) Do jednotlivých směsí přidejte následující vzorky: A = 5 ul primárního amplikonu + 5 ul deionizovaná vody B = 10 ul primárního amplikonu N = 10 [il deionizovaná vody. 6) Uzavřete zkumavky, řádně je popište a vložte do termocykleru. 7) Proveďte amplifikaci dle stejného programu jako pro získání primárního amplikonu: 8) Po ukončení programu proveďte elektroforézu v 1,5 % agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Další informace k této problematice najdete v Masuzaki H. et al. 1995: Human obese gene expression. Adipocyte-specific expression and regional differences in the adipose tissue. Diabetes 44, 855-858. Zhang Y. et al. 1994: Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432. 68 Kontrolní otázky a příklady 1) V uvedené sekvenci aminokyselin pre-proteinu pro leptin vyznačte sekvenci signálního peptidu. Kterou aminokyselinou pak začíná vlastní leptin? MHWGTLCGFL WLWPYLFYVQ AVPIQKVQDD TKTLIKTIVT RINDISHTQS VSSKQKVTGL DFIPGLHPIL TLSKMDQTLA VYQQILTSMP SRNVIQISND LENLRDLLHV LAFSKSCHLP WASGLETLDS LGGVLEASGY STEVVALSRL QGSLQDMLWQ LDLSPGC 2) Stanovte teplotu annealingu pro primery LEP2 a LEP530. 3) V uvedené sekvenci části genu ob vyznačte pozice primerů LEP2, LEP530, a částí primerů HLEP81KPN a LEP530XBA. Vyznačte také iniciační a terminační kodon. 1 gcttcttggg aaggaaaatg cattggggaa ccctgtgcgg attcttgtgg ctttggccct 61 atcttttcta tgtccaagct gtgcccatcc aaaaagtcca agatgacacc aaaaccctca 121 tcaagacaat tgtcaccagg atcaatgaca tttcacacac gtcagtctcc tccaaacaga 181 aagtcaccgg tttggacttc attcctgggc tccaccccat cctgacctta tccaagatgg 241 accagacact ggcagtctac caacagatcc tcaccagtat gccttccaga aacgtgatcc 301 aaatatccaa cgacctggag aacctccggg atcttcttca cgtgctggcc ttctctaaga 361 gctgccactt gccctgggcc agtggcctgg agaccttgga cagcctgggg ggtgtcctgg 421 aagcttcagg ctactccaca gaggtggtgg ccctgagcag gctgcagggg tctctgcagg 481 acatgctgtg gcagctggac ctcagccctg ggtgctgagg ccttgaaggt cactcttcct 541 gcaagactac gttaagggaa ggaacctggc ttcaggtatc tccaggattg aagagcattg 601 catggacacc cttatcagga ctctgtcaat tcctgactct ctag 69 Simultánní štěpení amplikonu a vektoru (cvičení č. 18) Úvodní slovo Jednou z možností, jak nakloňovat gen do plasmidu, je rozštěpit plasmid a klonovaný gen reštrikční endonukleázou. Na obou molekulách pak vzniknou dva konce, které je následně možno spojit ligázou. Přitom z jednoho řetězce naštěpené molekuly vyčnívá fosfátová skupina, druhý řetězec obsahuje 3'-OH skupinu (viz obrázek 14.1). Obrázek 14.1: Struktura konců plasmidu po rozštěpení restriktázou EcoR I: 5'..........G-OH P-A-A-T-T-C..........3' 3'..........C-T-T-A-A-P OH-G..........5' Při použití jediného enzymu dochází při ligaci k přednostnímu znovuspojení konců na plasmidu a účinnost klonování je nízká. To se obchází použitím fosfatázy, která z konců vzniklých restrikčním štěpením odstraní fosfáty (viz obrázek 14.2), čímž recirkulaci znemožní. Obrázek 14.2: Struktura konců plasmidu po rozštěpení restriktázou EcoR I a působení fosfatázy: 5'..........G - OH HO - A-A-T-T-C..........3' 3'..........C-T-T-A-A - OH OH - G..........5' I takový způsob klonování má však nevýhodu spočívající v tom, že může dojít k nakloňování fragmentu v obou orientacích, přičemž jen jedna zajišťuje správnou transkripci a následnou expresi rekombinantního proteinu. Při tzv. orientovaném klonování je vektor naštěpen dvěma různými restriktázami se vzájemně nekompatibilními konci. Podobně je upraven fragment, který je do plasmidu vnášen. Tento způsob klonování zajistí, že plasmid nebude ligací recirkulován, a že gen bude nakloňován ve správné orientaci. Reštrikční štěpení dvěma restriktázami s sebou nese komplikaci v tom smyslu, že ne všechny restriktázy štěpí ve stejném pufru a za stejné teploty. Proto je nutné buďto zvolit takové restriktázy, které štěpí za stejných podmínek, potom je možné provést štěpení v jediné reakci. Pokud restriktázy štěpí za vzájemně nekompatibilních podmínek, je nutné provést postupné štěpení, nejprve jednou a po pročištění druhou restriktázou. Jako první se používá restriktáza, která štěpí v pufru s nižší koncentrací iontů. O tom, že reštrikční štěpení proběhlo je nesnadné se přesvědčit. Velikost fragmentu před štěpením a po štěpení zůstává elektroforézou nerozlišitelná. Jak ale víme z úlohy č. 6, je elektroforézou možno odlišit CCC a L formu plasmidu. Proto budeme štěpit amplifikovaný fragment genu v jedné reakci s plasmidovou DNA. Rozštěpení plasmidu bude dobrým indikátorem funkce enzymu a je tedy pravděpodobné, že enzym rozštěpil i konce amplikonu. Cíl cvičení Spojit ligací vektor pTrxFus s amplikonem genu ob připraveným ve cvičení č. 13. Plasmid pTrxFus je jedním z vektorů používaných pro expresní klonování genů. 70 Seznam přístrojů • sada pipet 0,5-10 ul, 5-50 ul, 20-200 ul • sada sterilních umělohmotných špiček na pipety • sterilní umělohmotné Eppendorfky • vana s ledem • chladící bloček na -20 °C • biologický termostat s nastavitelnou teplotou • pikofuga Vlastní pracovní postup 1) Z mrazáku -20 °C vyndejte plasmidovou DNA, vodu, pufr a všechny komponenty nechejte rozmrazit. Po rozmrazení krátce centrifugujte kapičky roztoků ze stěn mikrozkumavek na pikofuze a uložte do nádoby s ledovou tříští. 2) Dle „reakčního schématu" napipetujte do mikrozkumavek jednotlivé komponenty reakce. Pracujte rychle, ale velmi opatrně tak, abyste do reakce nezanesli žádné nečistoty, které by poškodily průběh reakce. Všechny roztoky uchovávejte stále v nádobě s ledovou tříští. 3) Po nanesení poslední komponenty směs jemně promíchejte špičkou pipety. 4) Vyndejte z mrazáku restriktázy a v mrazícím bločku je přineste k ostatním komponentám. Restriktázu nechejte v bločku, nedávejte ji do ledové tříště. 5) Opatrně napipetujte restriktázy a výsledné směsi jemně promíchejte špičkou pipety. 6) Restriktázy ihned uschovejte v mrazáku na -20 °C. Rovněž zbylou vodu, pufr, a DNA uložte zpět do -20 °C. 7) Reakční směsi přeneste do termostatu vytemperovaného na 37 °C. 8) Inkubujte po dobu 1 hodiny. 9) Reakci zastavte přidáním 0,5M EDTA, pH 8,0 (1 ul na 50 ul reštrikční směsi). 10) Proveďte kontrolu štěpení v 1,2% agarózovém gelu (viz cvičení č. 10). Reakční schéma (objemy jsou uvedeny v ul): I. restriktáza Il.restriktáza Směs restriktáz Voda 50-(ll+X+Y) 50-(ll+X+Y) 50-(12+X+Y) pufr 5 5 5 BSA lOx 5 5 5 plasmid Y Y Y amplikon X X X Kpnl (10u/ul) 1 - 1 Xbal{\0xxl\ú) - 1 1 Celkem 50 50 50 Y = zpravidla 5 ul X = zpravidla 10-15 ul (za normálních okolností by počet molekul amplikonu mělo být zhruba 5x vyšší než počet molekul plasmidové DNA) 71 Poznámky pro vypracování protokolu: Zásobní koncentrace mého plasmidu byla: Koncentrace amplikonu byla: Výsledné reakční schéma vypadalo následovně: I. restriktáza Il.restriktáza Směs restriktáz Voda pufr 5 5 5 BSA lOx 5 5 5 plasmid amplikon Kpnl (10 U/ul) 1 - 1 Xbal (10 U/ul) - 1 1 Celkem 50 50 50 Fotografie elektroforézy a vyhodnocení restrikčního štěpení: Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 72 Kontrolní otázky a příklady 1) Kolik molekul obsahuje 5 ul plasmidu pTrxFus (velikost 3 600 bp) jestliže jeho zásobní koncentrace je 100 ug/ml? 2) Kolik molekul obsahuje 10 ul amplikonu o velikosti 500 bp, jestliže jeho koncentrace je 250 ug/ml? 3) V jakém množství smícháte vektor pTrxFus a amplikon pro ligaci, jestliže zásobní koncentrace vektoru je 200 ug/ml a koncentrace amplikonu je 600 ug/ml? Do reakce můžete vložit maximálně 5 ul směsi. 73 Ligace vektoru a naštěpené DNA (cvičení č. 19) Úvodní slovo Ligaci, neboli spojení 5'-fosfátového a 3'-OH konce DNA nebo RNA katalyzuje enzym ligáza. Tento enzym spojuje jak tupé tak kohezivní konce. Kromě toho působí při reparaci jednořetězcových zářezů v dsDNA, dsRNA nebo v hybridních molekulách DNA/RNA. K ligaci se nejčastěji používá DNA ligáza z bakteriofága T4 (T4 DNA ligáza) nebo méně účinná DNA ligáza z Escherichia coli. T4 DNA ligáza využívá jako zdroj energie ATP, spojuje tupé i kohezivní konce, kdežto DNA ligáza z Escherichia coli využívá NAD a spojuje pouze konce kohezivní, je však při spojování konců přesnější. Oba enzymy mají reakční optimum při 14-16 °C. Vedle dvou zmíněných ligáz se využívá termostabilní DNA ligáza izolovaná z Thermus aquaticus. Tento enzym spojuje dva oligonukleotidy, které jsou hybridizovány vedle sebe na komplementárním DNA řetězci. Její reakční optimum je mezi 45 °C až 65 °C, jako kofaktor vyžaduje NAD. V určitých aplikacích (ligase chain reaction, ligase detection reaction) se využívá k amplifikacím a nahrazuje metodu PCR. Další z enzymů, T4 RNA ligáza, využívá jako substrát jednořetězcovou RNA, ssDNA a dinukleosid pyrofosfáty. Teplotní optimum má při 37 °C. Při praktickém provedení je nutné mít na paměti, že ligace tupých konců je méně účinná, a proto je nutné při spojování tupých konců zvýšit koncentraci enzymu. Poznámka: Jedna jednotka T4 DNA ligázy od firmy New England Biolabs je množství enzymu, které spojí 50% Hind lil fragmentů DNA fága 1 (koncentrace 5'-konců 0,12 (iM, 300 |ig/ml) ve reakci o objemu 20 (il za 30 minut pň 16 °C. Takto definovaná jedna jednotka je ekvivalentní 0,015 Weissovým jednotkám. Cíl cvičení Spojit ligaci vektor pTrxFus s amplikonem genu ob připraveným ve cvičení č. 14. Plasmid pTrxFus je jedním z vektorů používaných pro expresní klonování genů. Seznam přístrojů • sada pipet 0,5-10 \ů, 5-50 \ů, 20-200 \ů • sada sterilních umělohmotných špiček na pipety • 0,5 ml PCR zkumavky • vana s ledem • chladící bloček na -20 °C • vodní lázeň • pikofuga • termocyklerPTC-100 74 Vlastní pracovní postup 1) Na termocykleru nastavte program pro ligaci. 2) Vytemperujte vodní lázeň na 60 °C. 3) Z -20 °C vyndejte naštěpenou plasmidovou DNA a DNA sekundárního amplikonu připravené ve cvičení č. 14. Dále vyndejte vodu, ligační pufr. 4) Všechny komponenty nechejte rozmrazit na ledu, poté krátce stočte na pikofuze a uchovávejte na ledu. 5) Ligázu uchovávejte v mrazícím bločku. 6) Zahřejte plasmid a amplikon 10 min. při 60 °C. 7) Připravte ligační směs dle schématu, napipetujte do 0,5 ml PCR zkumavek všechny příslušné složky, ligázu až nakonec. 8) Všechny komponenty promíchejte mícháním špičkou. 9) Zbylé komponenty uskladněte při -20 °C. 10) Ligační směsi stočte krátce na pikofuze a vložte do termocykleru. Nezapínejte vyhřívané víko! 11) Inkubujte při 16 °C po dobu 1 až 4 hodin. 12) Poté použijte ligační směs ke transformaci bakteriálních buněk - viz úloha č. 17. Ligační směsi (objemy jsou uvedeny v ul): Komponenty Pokusné zásahy Ligace č. 1 2 3 Voda 7 5 3 4 lOx pufr 1 1 1 1 Fragment + vektor* 1* 3* 5* 5* T4 DNA ligáza 1 1 1 - Celkem 10 10 10 10 * množství směsi v ligaci se řídí kvalifikovaným odhadem na základě koncentrace DNA v restrikčních směsích po přečištění. Aby bylo dosaženo úspěšného klonování zkouší se více variant. ** K = kontrola bez přidání ligázy, v tomto pokusném zásahu by nemělo dojít ke spojení vektoru s klonovaným fragmentem a po provedení transformace by neměli vzniknout žádní transformanti. Poznámka: Občas se může stát, že při použití kohezivních konců a nízké teplotě inkubace může dojít ke vzniku transformantů i v kontrole bez použití ligázy ! Další informace k této problematice najdete v Engler, M. J. a Richardson, C. C. 1982: In P. D. Boyer (Ed.), The Enzymes Vol. 5 (p. 3). San Diego: Academie Press. 75 Kontrolní otázky a příklady 1) Kolika jednotkám T4 DNA ligázy od firmy New England Biolabs odpovídá 1 Weissova jednotka? 2) Jaká je hmotnost 1 ul DNA fága X, jestliže je jeho koncentrace 1 pmol ? Velikost DNA fága X je 48 502 bp. Molekulová hmotnost jednoho bp = 650. 3) Jaká je koncentrace 5'- konců lineární DNA fága X (100 ug/ul) v5[il této DNA po jejím štěpení restriktázou Hind III, jestliže má tento enzym na této DNA 7 restrikčních míst? 76 Poznámky 77 TA klonování amplifikačních produktů (cvičení č. 20) Úvodní slovo Klonování genu je možno uskutečnit také jinými způsoby než je opracování jeho konců restrikčními endonukleázami, jak bylo uvedeno ve cvičení č. 14. Enzym Taq polymeráza používaná pro polymerázovou řetězovou reakci připojuje na 3'- konce amplikonů adenylátový zbytek ve formě přesahu. Této přesah slouží jako háček, ke kterému se může připojit molekula vektoru upravená tak, že obsahuje na 3'-konci přesah ve formě thymidylového zbytku. Metoda, která uvedené vlastnosti Taq polymerázy využívá, se označuje jako TA-klonování. Příkladem vektoru pro TA klonování je plasmid pCR2.1, který má v klonovacím místě následující sekvenci nukleotidů: 5'- ... GAATTCGCCCTT 3 '- ... CTTAAGCGGGA AGGGCGAATTC ... - 3 TTCCCGCTTAAG ... - 5 Tento vektor se nemůže uzavřít bez inzertu, neboť obsahuje nekompatibilní konce, ale může být použit pro přímou ligaci s produkty PCR získanými Taq polymerázou. Struktura amplikonů pro TA klonování vypadá obecně takto (N značí libovolný nukleotid): 5 ' - ... NNNNNNNNNN ............... NNNNNNNNNNA ... - 3 ' 3 ' - ... ANNNNNNNNNN ............... NNNNNNNNNN ... - 5 ' Spojení vektoru pCR2.1 s produktem amplifikace zajišťuje DNA ligáza (viz obrázek 16.1). Obrázek 16.1: Schéma spojení vektoru s fragmentem pomocí ligázy vektor PCR produkt vektor LIGAZA Jiným způsobem propojení vektoru a amplikonů je využití topoizomerázy I, která kromě schopnosti vytvářet zlomy v DNA může tyto zlomy spojovat. Příkladem vektoru, který se takto používá je plasmid pCRII-TOPO. Reakce využívající topoizomerázu je velmi rychlá a k jejímu proběhnutí zpravidla stačí 0,5 až 5 minut, naproti několika hodinám při použití ligázy. 78 Cíl cvičení Spojit ligací vektor pCR2.1 s amplikonem genu ob připraveným ve cvičení č. 14. Seznam přístrojů • sada pipet 0,5-10 \ů, 5-50 \ů, 20-200 \ů • sada sterilních umělohmotných špiček na pipety • 0,5ml PCR zkumavky • vana s ledem • chladící bloček na -20 °C • vodní lázeň • pikofuga • termocyklerPTC-100 Vlastní pracovní postup Použijte komponenty komerční soupravy „Originál TA cloning kit" firmy INVITROGEN. 1) Na termocykleru nastavte program pro ligaci. 2) Z -20 °C vyndejte všechny komponenty soupravy a DNA sekundárního amplikonu připravené ve cvičení č. 14. 3) Všechny komponenty nechejte rozmrazit na ledu, poté krátce stočte na pikofuze a uchovávejte na ledu. 4) Ligázu uchovávejte v mrazícím bločku. 5) Připravte ligační směs dle schématu, napipetujte do 0,5ml PCR zkumavek všechny příslušné složky, ligázu až nakonec. 6) Všechny komponenty promíchejte mícháním špičkou. 7) Zbylé komponenty uskladněte při -20 °C. 8) Ligační směsi stočte krátce na pikofuze a vložte do termocykleru. Nezapínejte vyhřívané víko! 9) Inkubujte při 16 °C po dobu 1 až 4 hodin. 10) Poté použijte ligační směs ke transformaci bakteriálních buněk - viz úloha č. 17. 79 Ligační směsi (objemy jsou uvedeny v ul): Komponenty Pokusné zásahy Ligace č. 1 2 3 Voda 5 3 1 2 lOx pufr 1 1 1 1 čerstvý amplikon 1* 3* 5* 5* vektor pCR2.1 2 2 2 2 (25 ng/ul) T4 DNA ligáza 1 1 1 - Celkem 10 10 10 10 * množství směsi v ligaci se řídí kvalifikovaným odhadem na základě koncentrace DNA v restrikčních směsích po přečištění. Aby bylo dosaženo úspěšného klonování zkouší se více variant. ** K = kontrola bez přidání ligázy, v tomto pokusném zásahu by nemělo dojít ke spojení vektoru s klonovaným fragmentem a po provedení transformace by neměli vzniknout žádní transformanti. Další informace k této problematice najdete v INVITROGEN 1982: Originál TA Cloning Kit. Manuál, www.invitrogen.com 80 Kontrolní otázky a příklady 1) ) Kolik molekul představují Hind III fragmenty DNA fága X (koncentrace 5'-konců 0,12[jM, 300 ng/ml) ? 2) Jaká je koncentrace 5'- konců lineární DNA plasmidu pCR2.1 (100 (J,g/[J,1) v5[il této DNA po jeho upravení do podoby T-vektoru? Velikost plasmidu pCR2.1 je 3 900 bp. 3) Ke klonování chromosomální DNA se v genovém inženýrství často používají fágy, například fág X. Aby bylo možné účinně klonovat vybrané fragmenty, je při přípravě experimentů zapotřebí znát některé parametry. Mějme tedy linearizovanou dsDNA fága X o koncentraci 50 [j,g/ml. a) Kolik molekul obsahuje 1 [ú tohoto roztoku? b) Kolik je to molů v 1 [j,l? c) Jaká je molární koncentrace molekul dsDNA fága v roztoku? d) Jaká je molární koncentrace konců molekul dsDNA fága v roztoku? 81 Transformace bakteriálních buněk Escherichia coli (cvičení č. 21) Úvodní slovo Jakmile je gen ligací spojen s vektorem, je třeba přenést tento vektor do živé buňky. Vnesení izolované molekuly DNA do bakteriální buňky se nazývá transformace. K tomuto procesu dochází i spontánně, u tzv. recipientních buněk ve stavu kompetence. Stav kompetence lze navodit i uměle, ale účinnost transformace je nízká, tzn. že pouze malé procento kompetentních buněk přijme cizí DNA. Proto genoví inženýři po transformaci podrobují buňky procesům tzv. selekce, kterými dosáhnou výběru jen těch buněk, které nesou transformovanou DNA. Vzhledem k tomu, že vektory jsou konstruovány s tímto cílem, nesou řadu selektivních znaků, zpravidla geny rezistence k antibiotikům. Pro účinné vnesení DNA do bakteriálních buněk existuje několik metod. Nejúčinnějším postupem je tzv. elektroporace. Tato metoda je velmi rychlá, ale vyžaduje speciální, nákladné zařízení. Při této technice jsou buňky podrobeny silnému elektrickému šoku, který způsobí lokální změny a vznik pórů v buněčné stěně a membráně, kterými DNA vstupuje do buněk. Elektroporací lze dosáhnout frekvence transformace 109-1010 transformantů na lug plasmidové DNA. Elektroporace rozšířila aplikační možnosti přenosu DNA i na velké plasmidy a buňky, u nichž ostatní techniky selhávaly. Další metodou je použití CaCi2 pro přípravu kompetentních buněk. Vzhledem k jednoduchosti je tato metoda nejčastěji používaná, i když je její účinnost nižší. Pro tuto metodu je velmi důležité, aby byly použity buňky v optimálním fyziologickém stavu. Používají se mladé buňky z počátku exponenciální fáze růstu, kdy jsou jejich buněčné stěny tenké. Buňky se přenesou do hypotonického prostředí CaCl2 při 4 °C, čímž se během 30 min. výrazně změní propustnost jejich buněčné stěny. Kladně nabité vápenaté ionty vytvoří na povrchu buňky struktury, na které se záporně nabité molekuly DNA snadno navážou. Je známo několik modifikací této metody, jako je použití Rb+, Mn2+ nebo K+ iontů místo Ca2+ či přídavky různých činidel, jako dithiothreitol nebo dimethylsulfoxid. Buňky opracované CaCl2 lze skladovat při -70 °C několik měsíců. Transformují se s využitím tzv. teplotního šoku, kdy se nejprve inkubují s DNA na ledu a poté se podrobí krátké teplotní změně na 42 °C a opětovnému zchlazení. Následkem prudkých teplotních změn buňky cizorodou DNA přijmou. Po kultivaci v bohatém regeneračním médiu se v buňce obnoví její životní funkce (utlumené v procesu přípravy kompetentních buněk, skladováním při teplotě -70 °C a vlastním procesem transformace) a začnou se v ní množit transformované vektory. Po transformaci narostou v selekčním médiu buňky s vektorem, který může a nemusí obsahovat fragment (inzert), který do něj byl klonován. Selekce buněk, které přijaly vektory s cizorodou DNA, tzv. transformantů, se provádí na médiích s antibiotiky. Přítomnost nakloňovaného fragmentu se pak ověřuje různými technikami. Nejčastěji se jedná o reštrikční analýzu plasmidové DNA po minipreparaci, tzv. inzerční inaktivaci, a-komplementaci, hybridizaci kolonií, testování s využitím PCR a nebo sekvenování. 82 Cíl cvičení Transformovat produkty ligace připravené ve cvičení č. 15 nebo 16. Seznam přístrojů • sada pipet 0,5-10 \ů, 5-50 \ů, 20-200 \ů • sada sterilních umělohmotných špiček na pipety • mikrozkumavky na l,5ml • vana s ledem • chladící bloček na -20 °C • mrazící box na -80 °C • vodní lázeň na 42 °C • pikofuga • biologický termostat s teplotou 37 °C • rotátor • centrifuga na mikrozkumavky Vlastní pracovní postup Proveďte metodu transformace tepelným šokem. 1) Dejte temperovat médium SOC na teplotu 37 °C a vodní lázeň na 42 °C. 2) Příslušný počet dávek kompetentních buněk vyndejte z -80 °C a dejte rozpustit v nádobě s ledem. 3) K buňkám napipetujte po 3 [ú jednotlivých ligačních směsí nebo 3 [ú čisté plasmidové DNA (pozitivní kontrola) nebo 3 [ú vody (tuto variantu připravte dvakrát - negativní kontrola a kontrola vitality). Jemně promíchejte špičkou pipety. 4) Inkubujte 30 minut na ledu. V této fázi dochází k zachycení DNA na povrchu buněk. 5) Podrobte buňky tepelnému šoku ponořením do vodní lázně vyhřáté přesně na 42 °C po dobu 30 sekund při a dejte na 2 minuty na led. V této fázi dojde k průniku DNA dovnitř buněk. 6) Zastavte transformaci přidáním á 800 [ú média SOC rozehřátého na teplotu 37 °C. 7) Inkubujte buňky na rotátoru v termostatu při 37 °C po dobu 45 až 60 minut podle typu použitých buněk. V tomto kroku buňky regenerují a dochází k expresi p-galaktozidázy a vyjádření rezistence k ampicilinu. Po uplynutí uvedené doby se začínají buňky dělit, proto je nutné je co nejdříve vyset na selekční médium. 8) Centrifugujte buňky na centrifuze při 12 000 rpm/3 min. 9) Odlijte většinu supernatantu a buňky resuspendujte ve zbytku tekutiny, která steče ze stěn zkumavky. 10) Vysejte buňky na misky LB s ampicilinem (50 (j,g/ml). Pouze pokusný zásah „kontrola vitality" vysejte na misky LB bez ampicilinu. 11) Kultivujte po dobu 16 hod. a spočítejte narostlé kolonie. Vyhodnoťte experiment. 83 Příprava roztoků 17.1. Příprava zásobního roztoku ampicilinu 1) Zásobní roztok ampicilinu se připravuje v koncentraci 100 mg/ml. 2) Vezměte jednu ampuli ampicilinu pro injekce (navážka 500 mg, Bristol-Myers-Squibb) a rozpusťte ji v 5 ml sterilní destilované vodě (AQUA pro injectione, Biotika). 3) Nechte prášek řádně rozpustit. 4) Rozpipetujte po lml do sterilních l,5ml mikrozkumavek typu Eppendorf. 5) Zamrazte roztok a skladujte při -20 °C. Expirace takto připraveného roztoku ampicilinu je 1 rok. 17.2. Příprava LB agaru s ampicilinem (250 ml) 1) Navažte 10 g LB agaru (výrobce DIFCO). 2) Alternativně je možno použít následující komponenty - Bacto Tryptone 2,5 g (výrobce DIFCO), Bacto Yeast Extract 1,25 g (výrobce DIFCO), Chlorid sodný 2,5 g (výrobce LACHEMA), Bacto agar 3,5 g (výrobce DIFCO) 3) Nasypte do 500 ml Erlenmeyerovy baňky. 4) Přelijte 250 ml destilované vody. 5) Sterilizujte v přehřáté páře pň 120-125 °C/20 minut. 6) Vytemperujte na vodní lázni na 55 °C. 7) Pňdejte ampicilin do konečné koncentrace 100 (ig/ml a ihned rozlijte na misky - na jednu misku asi 20-25 ml půdy, z jedné 250 ml dávky je tedy možné připravit asi 10-12 misek. Další informace k této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 84 Poznámky k vypracování protokolu: Typ použitých buněk: Plasmid: Ligace: Transformační směsi: 1 = buňky + 3 ul vody..... 2 = buňky + 3 ul vody..... 3 = buňky + 3 ul plasmidu 4 = ligační směs N = ligační směs Kultivace od..........hod. do..........hod. Celková doba kultivace: Výsledky: Transformační zásah Počet kolonií 1 2 3 4 N Závěry: Negativní kontrola Kontrola vitality (vyseté na médium bez antibiotika) Pozitivní kontrola 85 Kontrolní otázky a příklady 1) Jaký byl vkladový poměr (počet molekul plasmidu vložených na jednu kompetentní buňku) při transformaci jestliže ke 40 ul kompetentních buněk o hustotě 5 x 101 buněk/ml jste přidali 3 ul u pUC18 (velikost 2 686 bp) o koncentraci 100 ng/ul? 2) Stanovte frekvenci transformace jako počet transformantů/ug vloženého plasmidu, jestliže jste v pokusném zásahu, ve kterém jste transformovali 3 ul plasmidu pBR322 (velikost 4 361 bp) o koncentraci 100 ng/ul, získali 150 transformantů. 3) Z výsledků uvedených v úloze č. 2 stanovte frekvenci transformace jako podíl molekul plasmidu, které účinně transformovaly buňky k celkovému počtu molekul plasmidu vložených do transformace. 86 Poznámky 87 Exprese rekombinantního proinsulinu (cvičení č. 22) Úvodní slovo Rekombinantní proinsulin je produkován ve formě N-terminálního fúzního proteinu, obsahuje translační iniciační kodon ATG, šesti-histidinový fragment, umožňující purifikaci proteinu afinitní vazbou ke kovům a Xpress epitop, který dovoluje snadnou detekci proteinu specifickou protilátkou a místo pro enterokinázu. Ve vektoru pCR T7/NT je rekombinantní gen pro proinsulin nakloňován pod promotorem, který v buňkách E. coli TOP10F' není aktivní. Hladina exprese je tudíž minimální nebo až žádná. Pro docílení silné exprese klonované DNA, a to až po indukci IPTG, je možné provést expresi v buňkách E. coli BL21(DE3)pLysS. Tyto buňky nesou gen pro T7 RNA polymerázu s promotorem indukovatelným IPTG. Kromě toho tyto buňky obsahují plasmid pLys, který kóduje lysozym. Lysozym je přirozený inhibitor T7 RNA polymerázy. Protože T7 RNA polymeráza spouští transkripci z promotoru plasmidu pCR T7/NT, pak T7 lysozym po vazbě na T7 RNA polymerázu inhibuje transkripci cizorodé DNA. Funkcí T7 lysozymu je tedy zajistit nízkou nebo nulovou expresi v expresních buňkách do té doby, než nastanou vhodné podmínky pro produkci rekombinantního proteinu. Lysozym tedy např. zabraňuje předčasné expresi pro buňku toxických proteinů. Vhodné podmínky pro expresi rekombinantního proteinu nastávají zpravidla v časné exponenciální fázi růstu (Goeddel, 1991). Po přidání IPTG do média kultury rostoucí v časné exponenciální fázi růstu dochází k indukci T7 RNA polymerázy, prudkému zvýšení hladiny transkriptů z plasmidu pCR T7/NT a tím i mRNA nakloňovaného rekombinantního genu. Ať už je výsledný protein pro buňku toxický nebo ne, jsou jeho výtěžky obrovské a mohou dosahovat až 40 % celkového obsahu proteinů v buňce. Cíl cvičení Transformovat buňky Escherichia coli BL21(DE3)pLysS a exprimovat rekombinantní proinsulinu. Seznam přístrojů • Sada pipet o objemech 10 ul, 100 ul a 1000 ul • Mikrozkumavky • Centrifuga na mikrozkumavky • Váhy s váživostí +/- 0,1 g • Erlenmeyerovy baňky • Třepačka Vortex • Třepačka termostatovaná • Kuchyňské minutky • Nádoba s ledem • Vodní lázeň • UV-VIS spektrofotometr • Termostat - biologický inkubátor 88 Chemikálie • Buňky Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen) • Plasmid pCR T7/NT-PROINS-17 • NaCl • LB médium • SOC médium • Ampicilin (zásobní koncentrace 100 mg/ml) • Chloramfenikol (zásobní koncentrace 17 mg/ml), • Isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) (zásobní koncentrace 100 mM) Vlastní pracovní postup Příprava materiálu 1) Připravte celkem 3 Erlenmeyerovy baňky. Do první si připravte 5 ml LB média, do druhé 60 ml LB média. Třetí baňka zůstane prázdná. 2) Všechny Erlenmeyerovy baňky (dvě s LB médiem a jednu prázdnou) sterilizujte autoklávováním při 120 °C/20min. 3) Připravte vodní lázeň vytemperovanou na 42 °C. 4) SOC médium zahřejte v termostatu vytemperovaném na 37 °C. 5) Připravte misku se směsí ledu, vody a soli (dále v textu značeno jako ledová lázeň). Transformace buněk Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 1) Z mrazáku (- 80 °C) vyndejte potřebné množství dávek kompetentních buněk E.coli BL21(DE3)pLysS (podle počtu transformací, které budete dělat) a plasmidplazmid pCR T7/NT-PROINS-17 (uložený v mrazáku na - 20 °C) a nechte je krátce rozmrazit, poté hned umístěte na ledové lázni. 2) K rozmražené dávce buněk E.coli BL21 přidejte 1 ul (asi 5 ng) plasmidové DNA -jemně zamíchejte (ne pipetováním!). 3) Inkubujte směs na ledu po dobu 30 min. 4) Proveďte transformaci teplotním šokem: a) umístěte buňky E.coli BL21 do připravené vodní lázně (42 °C) a inkubujte po dobu 30 sekund b) ihned poté vložte buňky zpět do ledové lázně 5) Bezprostředně poté, nejdéle však do 2 minut, přidejte k transformovaným buňkám 250 ul SOC média vyhřátého na 37 °C (dále v textu označováno jako transformační směs A). 6) Transformační směs A třepejte v termostatu 30 min při 250 rpm/37 °C a mikro-zkumavku umístěte do téměř vodorovné polohy. 7) Ukliďte vodní lázeň a ledovou lázeň, připravte 5 ml sterilního LB média a rozmrazte zásobní roztoky ampicilinu - AMP (zásobní koncentrace 100 mg/ml) a chloramfenikolu - CP (zásobní koncentrace 17 mg/ml). 8) V laminárním boxu pokračujte (ještě dnes!) noční kultivací. Noční kultivace 1) Do sterilní plastové zkumavky (15 ml) přeneste 5 ml sterilního LB média a přidejte 5 ul AMP a 10 ul CP. 2) Toto médium inokulujte transformační směsí A (použijte 1/100 kultivačního objemu, tzn. 50 ul transformační směsi A). 89 3) Plastovou zkumavku řádně popište „E. coli BL21 (pCR T7/NT-PROINS)-17, rr/mm/dd, XY", kde rr = rok, mm = měsíc, dd = den, XY = zkratka Vašeho jména. 4) Zbytek transformační směsi uložte do ledničky a popište stejným způsobem. 5) Pokračujte v inkubaci inokulovaného média 16 hod. při 250 rpm/37 °C. 6) Druhý den ráno odeberte 100 ul LB média s antibiotiky (BLANK) a změřte optickou hustotu ODôoo noční kultury. Naměřené údaje zaznamenejte. Exprese (druhý den ráno) 1) Do vysterilizované Erlenmeyerovy baňky (popsané výše uvedeným způsobem) s 60 ml LB média přidejte 60 ul AMP a 120 ul CP. 2) Inokulujte 1/100 kultivačního objemu, tedy 600 ul transformační směsi (noční kultury). 3) Pokračujte v inkubaci při 250 rpm/37 °C. 4) V časech 75 min. a dále každých 30 min. měřte optickou hustotu inkubované směsi (ODôoo) a zapište si naměřené údaje. V čase, kdy se bude optická hustota blížit hodnotě přibližně 0,5, rozmrazte potřebné množství induktoru IPTG. 5) Poté, co optická hustota dosáhne hodnoty přibližně 0,5, odeberte lml frakci do prázdné mikrozkumavky a označte tuto mikrozkumavku jako To, je to neindukovaná kultura. 6) Sterilním postupem (tzn. v laminárním boxu a ožíháním hrdla obou baněk nad plamenem) rozdělte 60 ml bakteriální kultury na dvě stejné části, označení A a B. 7) K buněčné kultuře A přidejte 150|ul IPTG c = 100 mM. Kultura B slouží jako neindukovaná kontrola. 8) Obě kultury třepejte při 250 rpm/37 °C. 9) V 30 min. intervalech, tj. v časech Ti, T2, T3, a t4 kontrolujte optickou hustotu obou kultur, hodnoty ODôoo zaznamenejte. Po změření ODôoo přeneste po 1 ml vzorku kultury A i B do mikrozkumavek. Zkumavky řádně popište. 10) Odebrané 1 ml frakce centrifugujte 5 min/11 300 g. Supernatant přepipetujte do další mikrozkumavky označené jako supernatant, jelikož pro proinsulin již není třeba. 11) Vzorky sedimentu dále použijte pro následnou elektroforetickou analýzu exprimovaných proteinů v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Zkoncentrování sedimentu 1) Pomocí trojčlenky vypočítejte objem vody potřebné k „zkoncentrování" sedimentu na teoretickou ODôoo = 5 a hodnoty si zapište. Například: Teoretická OD60o.......... 5,000 ..........X ul H20 Naměřená OD000..........0,521 .......... 1 000 ul média X = 5,000 x 1 000 ul/ 0,521 X = 104,2 ul H20 Výše uvedený výpočet znamená, že při naměřené ODôoo = 0,521 musíme k sedimentu přidat 104,2 ul H2O, aby byla konečná ODôoo = 5,0. 2) K jednotlivým vzorkům sedimentů nepipetujte vypočtený objem vody, sediment důkladně promíchejte. 3) Takto zkoncentrovaný sediment (i neupravovaný supernatant) lze přímo použít k analýze exprimovaných proteinů pomocí SDS-PAGE. 90 Další informace k této problematice najdete v Invitrogen 2002: pCR T7 TOPO TA Expression Kits, Manuál společnosti Invitrogen. Verze 1, 48 s. Goeddel D.V. 1991: Methods in enzymology: Gene expression technology. USA, California Academie press, Inc., ISBN 0-12-287045, 185, s. 681. Kontrolní otázky a příklady 1) Jaké jsou konečné koncentrace ampicilinu a chloramfenikolu v médiu použitém pro noční kultivaci ? 2) Jaká je konečná koncentrace IPTG přidaného jako induktor do média ? 91 Elektroforéza proteinů v polyakrylamidovém gelu (cvičení č. 23) Úvodní slovo Metoda elektroforézy v denaturačním polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) se používá k rozdělení proteinů na základě jejich molekulové hmotnosti. K rozdělování dochází, podobně jako při elektroforéze v agarózovém gelu, při pohybu molekul ve stejnosměrném elektrickém poli. Molekulární síto představuje polyakrylamid a vodivé prostředí mezi elektrodami je zajištěno tlumivým roztokem. Při SDS-PAGE dochází k denaturaci proteinů jejich hydrofobní vazbou na dodecylsulfát sodný. Množství navázaného SDS (asi 1,4 mg na 1 mg proteinu) je tak velké, že náboje postranních zbytků aminokyselin jsou zanedbatelné vůči náboji sulfátových skupin. SDS tedy uděluje proteinům uniformní záporný náboj a ty se pak všechny pohybují k anodě, přičemž pohyblivost je dána velikostí molekuly. Cíl cvičení Separovat exprimované proteiny metodou SDS-PAGE Seznam přístrojů • Sada pipet o objemech 10 \ú, 100 \il a 1000 \il • Mikrozkumavky • Váhy s váživostí +/- 0,1 g • Odměrný válec (1000 ml, 100 ml) • Erlenmayerovy baňky • Suchý blok • Třepačka Vortex • Transiluminátor • Třepačka • Plastový nůž • Kuchyňské minutky • Celofánové fólie • Plastový stojánek • Sušící rámečky • Držáky Chemikálie • Proteinový hmotnostní standard Dalton Mark VITL (Molecular Weight Marker Kit, Sigma), Molecular Weight Range 14 200 - 66 000 • Aqua pro injectione (Biotika) • Amoniumpersulfát (100%) • TEMED Ultra Pure Grade (Amresco®) • NEXT Gel™ 15% (Amresco®) A Ready-To-Pour acrylamide gel (Amresco®) • NEXT Gel™ Running Buffer, 20x (Amresco®) • NEXT Gel™ Sample Loading Buffer, 4x (Amresco®) • Barvící roztok (0,1 % Coommasie Blue, 50 % metanolu, 10 % kyseliny octové) 92 • Odbarvovací roztok č. 1 (50 % metanolu, 10 % kyseliny octové) • Odbarvovací roztok č. 2 (12,5 % metanolu, 2,5 % kyseliny octové) • Ekvilibrační roztok (25 % etanolu denaturovaného benzínem a 3 % glycerolu) • Destilovaná voda Vlastní pracovní postup Příprava dvou polyakrylamidových gelů (sada BIORAD) 1) Sestavte aparaturu pro PAGE, tzn. do stojánku pro PAGE opatrně vložte sklíčka a tento stojánek upevněte v aparatuře. Pro přípravu jednoho gelu potřebujete dvě sklíčka a jeden hřebínek. 2) V mikrozkumavce si připravte 1 ml 10% roztoku amoniumpersulfátu (APS) (tzn. pro 1 ml: navážíte do mikrozkumavky 100 mg APS, přidáte 1 ml vody aqua pro injectione a na vortexu důkladně promícháte (je možné připravit i menší objem navážením menšího množství APS a přidáním odpovídajícího množství vody). 3) Do Erlenmayerovy baňky si odměřte 15 ml NEXT Gel™ 15% (Amresco®) A Ready-To-Pour acrylamide gel. 4) Přidejte do baňky 90 \il 10% APS a směs promíchejte. Amoniumpersulfát iniciuje polymerizaci. 5) Přidejte do baňky 9 ul TEMEDu (Amresco®) Ultra Pure Grade (TEMED katalyzuje polymerizaci). 6) Rychle tuto směs promíchejte špičkou pipety v Erlenmayerově baňce. 7) Rychle a pozorně napipetujte 1 ml roztoku z baňky a OPATRNE jej vypouštějte mezi 2 sklíčka. Špičku pipety dejte mezi sklíčka co nejníže a při vypouštění roztoku opřete špičku o silnější sklíčko. 8) Po vyplnění téměř celého prostoru mezi sklíčky (těsně pod horní okraj) roztokem, umístěte mezi 2 sklíčka plastové hřebínky tak, aby se pod nimi nevytvořily bubliny. 9) Ubrouskem setřete přebytečné množství gelu, které vyteklo při nasazování hřebínků. 10) Nechte gely tuhnout přibližně 30 min. Příprava vzorků 1) Zapněte suchý blok nastavený na 100 °C. 2) Popište potřebné množství mikrozkumavek. Počet i popis odpovídá vzorkům odebraným při expresi proteinu v předchozím cvičení. Jedna mikrozkumavka je určená pro proteinový standard Dalton Mark VII-L (Molecular Weight Marker Kit, Sigma). 3) Do každé mikrozkumavky se vzorkem pipetujte 5 \il NEXT Gel™ Sample Loading Bufferu, 4x (Amresco®) a pro proteinový standard násobek objemu odpovídající počtu jeho použití. 4) Do připravených mikrozkumavek pipetujte 15 |Lil jednotlivých vzorků, u proteinového standardu opět násobek objemu, které odpovídá počtu jeho použití. Příprava vany pro elektroforézu 1) Ze sklíček s již zatuhlými gely odstraňte přebytečné zaschlé kousky a pečlivě vložte sklíčka do rámečků na elektroforézu tak, aby rámečky byly sklíčky z gely těsně ohraničené a nevznikly žádné mezery, kterými by mohl protékat pufr. 2) Vložte rámeček se sklíčky do elektroforetické vany. 3) Připravte elektroforetický pufr, tzn. do kádinky odměřte 40 ml NEXT Gel™ Running Bufferu, 20x (Amresco®), přidejte 760 ml destilované vody a promíchejte. 4) Nalijte promíchaný pufr do vnitřního prostoru mezi sklíčka tak, aby hladina pufru mírně přesahovala okraje tenčích sklíček a pufr se tak dostal i do nanášecích jamek. 93 5) Zbytek pufru nalijte do vnějšího prostoru a zkontrolujte těsnost celého systému (hladiny se nesmí měnit). 6) Nanášecí jamky propláchněte pomocí pipety elektroforetickým pufrem a špičkou pipety odstraňte v pufru bubliny. Aplikace vzorků a samotná SDS-PAGE elektroforéza 1) Mikrozkumavky se vzorky a NEXT Gel™ Running Bufferem, 20x (Amresco®) vložte na 3 min. do suchého bloku vytemperovaného na 100 °C (vlivem vysoké teploty dojde k rozpadu buněčných stěn). 2) Naneste 15 \il směsi vzorku a NEXT Gel™ Running Bufferu, 20x (Amresco®)do jednotlivých nanášecích jamek v následujícím pořadí. GEL 1: Kultura A (indukovaná) číslo 123456789 10 jamky: vzorek PS T0 ATi AT2 AT3 AT4 BTi BT2 BT3 BT4 GEL 2: Kultura B (neindukovaná) číslo 123456789 10 jamky: vzorek PS T0 AT, AT2 AT, AT4 BT, BT2 BT, BT4 PS = proteinový standard 3) Nasaďte víko elektroforetické vany s elektrodami, připojte ke zdroji elektrického napětí a zapněte. 4) Nastavte parametry elektroforézy 40 V/400 mA/15 min. Tím dojde k zkoncentrování vzorků v jamkách, čelo elektroforézy by mělo být po 15 min. elektroforézy za těchto podmínek rovné. 5) Nastavte konečné parametry elektroforézy 140 V/400 mA/80 min, spusťte elektroforézu a separujte proteiny dokud se čelo nedostane na konec gelu. Barvení gelů 1) Do vaničky nalijte předem připravený barvící roztok. Nezapomeňte na rukavice, i vaše ruce obsahují proteiny! 2) Z elektroforetické vany vyjměte stojánky se sklíčky a opatrně odlijte přebytečný pufr. 3) Pomocí plastového nože od sebe opatrně oddělte sklíčka. 4) Opatrně odřízněte gel po okrajích v místech nanášecích jamek a seříznutím jeho pravého rohu si označte orientaci gelu. 5) Opatrně přeneste gel pomocí nože do vaničky s barvícím roztokem a nechte barvit při cca 50 rpm po dobu 30 min. 94 Odbarvení gelů 1) Po uplynutí 30 min. přelijte barvící roztok zpět do zásobní láhve. Barvící roztok lze použít opakovaně. 2) Do prázdné vaničky s gelem přilijte odbarvovací roztok č. 1 a nechte odbarvovat při cca 90 rpm po dobu cca 60 min. 3) Znečištěný odbarvovací roztok č. 1 vylijte do odpadní láhve. 4) Do prázdné vaničky s gelem přilijte odbarvovací roztok č. 2 a nechte odbarvovat při cca 90 rpm po dobu cca 60 min. 5) Průběžně kontrolujte stupeň odbarvení gelu a případně vyměňte odbarvovací roztok č. 1, nebo 2. Na konci odbarvovacího procesu odlijte znečištěný odbarvovací roztok 2 do odpadní láhve a gel promyjte vodou. Focení PAGE gelů 1) Z digitálního fotoaparátu sundejte filtr pro focení agarózových gelů v UV světle. 2) Digitální fotoaparát připojte k počítači a zapněte počítač i obrazovku. 3) Na desku světelného zdroje nastaveného na viditelné světlo umístěte správně orientovaný gel a zapněte zdroj. 4) Spusťte program pro fotografování. (AlphaDigiDoc) 5) Zaostřete a maximálně přibližte gel 6) Optimalizujte intenzitu světla na světelném zdroji. 7) V programu nastavte uzávěrku na 50 ms. 8) Vyfoťte gel. 9) Změňte intenzitu světla, a pokud není vyhovující, focení opakujte, dokud nebude fotka optimální. 10) Po vyfocení lze v programu AlphaEaseFC ver. 4.0.0 (Alpha Innotech Corporation, Kalifornie) doladit jas, kontrast a gama funkci. 11) Uložte fotku pod jednoznačným názvem do adresáře s fotkami jako soubor jpg. 12) Bezpečně odpojte digitální fotoaparát, vypněte světelný zdroj a počítač. Sušení gelů 1) Do velké plastové vany ze zásobní láhve nalijte připravený ekvilibrační roztok. 2) Po focení ponořte gel do vany s ekvilibračním roztokem na 30 min.. 3) Na 5 min. vložte do ekvilibračního roztoku celofánové fólie (pozn. 2 fólie pro jeden sušený gel). 4) Na vyvýšenou podložku (plastový stojánek) položte sušící rámeček. 5) Na podložní sušící rámeček velice pečlivě narolujte celofánovou fólii tak, aby byla rovná a bez bublin. 6) Doprostřed celofánové folie umístěte gel a zalijte jej ekvilibračním roztokem. 7) Na první celofánovou folii a gel velice pečlivě narolujte druhou fólii, opět aby byla rovná a bez bublin. 8) Na druhou fólii položte vrchní sušící rámeček. 9) Důkladně obě fólie vypněte přes rámeček a fixujte držáky vždy na protilehlých stranách. 10) Gel v sušícím rámečku nechte volně schnout ve svislé poloze po dobu cca 24 hodin. 95 Další informace k této problematice najdete v Westermeier R. 2001: Electrophoresis in Practise: A guide to Methods and Applications of DNA and Proteins Separations. 3rd ed., Weinheim: Wiley-VCH, s. 349. Alphalnnotech: AlphaEase™ FCStand Alone, Manuál společnosti Alphalnnotech. [CD-ROM], Verze 4.0.0, pro Windows 2000/XP Kontrolní otázky a příklady 1) Jaká je konečná koncentrace amoniumpersulfátu, kterou je zahajována polymerizace gelu? 2) Napište strukturní vzorec akrylamidu, bisakrylamidu a znázorněte schématicky molekulární síto v polyakrylamidovém gelu. 96 Poznámky 97 Western Blot (cvičení č. 24) Úvodní slovo PAGE gely jsou tlustá, ale křehká média, přičemž tyto vlastnosti znesnadňují manipulaci s nimi. Proto se vyvinuly metody, které umožňují přemístit proteiny z gelu na pevnější membránu bez změny jejich vzájemné pozice. Tyto metody se souhrnně označují Westernův přenos (Westernblot). Pro tento přenos se nejčastěji používá metoda elektrotransferu - proteiny z gelu na membránu putují v elektrickém poli, které je kolmé na gel. Další možností je kapilární přenos nebo přenos pomocí vakua. Nejběžnější membrány pro Westernův přenos jsou vyrobeny z nitrocelulózy nebo PVDF (polyvinyliden difluorid) a mají vysokou vazebnou schopnost pro proteiny. Po přenesení proteinů z gelu na membránu se volné vazebná místa na membráně blokují roztokem bovinního sérového albuminu (BSA), odtučněným mlékem nebo želatinou, čímž se zabrání nespecifické vazbě protilátek na tato místa. Pro vlastní detekci proteinů slouží specifické protilátky, které mohou být polyklonální nebo monoklonální a mohou být produkovány celou škálou organismů (myši, králíci, ovce,...). Na tyto takzvané primární protilátky se následně použijí sekundární protilátky, které rozpoznávají specifické struktury primární protilátky. Toto sendvičové uspořádání poskytuje vyšší citlivost než použití pouze jediné protilátky. Sekundární protilátka je konjugována s enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza), který v přítomnosti konkrétního substrátu poskytuje detekovatelný signál. Ten je zaznamenán detekčním zařízením a archivován. Cíl cvičení Detekovat protein zájmu na nitrocelulózové membráně pomocí specifické protilátky. Seznam přístrojů • sada pipet o objemech 10, 100 a 1000 (ll • elektroforetická vana na blotování • skalpel • třepačka • fotodokumentační zařízení Vlastní postup 1) Do připravených malých misek nalijte Transfer Buffer a ponořte do nich 2 kusy filtračního papíru pro blotování, 1 kus nitrocelulózové membrány a 2 kusy houbičky. 2) Destilovanou vodou omyjte PAGE gel umístěný stále mezi skly, odstraníte tak zbytky SDS. 3) Opatrně odklopte jedno sklo a odřízněte koncentrační gel. 4) Na gel položte vlhký filtrační papír, tak aby gel byl přibližně uprostřed a jemně odstraňte případné bublinky. 5) Do velké misky nalijte Transfer Buffer aby hladina byla cca 7 cm vysoko. 6) Ve velké misce sestavte pod hladinou blotovací aparaturu následujícím způsobem: 6.1. otevřete rámeček černou částí dolů 6.2. na něj položte navlhčenou houbičku 6.3. zkumavkou vyválcujte houbičku, abyste z ní odstranili co nejvíce bublin 6.4. na houbičku položte filtrační papír s gelem tak, aby gel směřoval vzhůru 98 6.5. gel přikryjte druhým filtračním papírem a zkumavkou jemně odstraňte bubliny 6.6. nahoru položte další houbičku a opět jemně vyválcujte 6.7. zavřete rámeček houbička filtrační papír membrána - gel filtrační papír 7) Sestavenou blotovací aparaturu dejte do elektroforetické vany, vložte formičku s ledem a zalijte Transfer Buffrem až po okraj. 8) Zapněte elektroforetický zdroj na 100 V / 60 min. 9) Po ukončení blotování, rozeberte blotovací aparaturu a membránu (jestli jste správně blotovali, poznáte podle toho, že na membráně bude vidět proteinový marker) postupně promyjte v: 9.1. TBST (omyje membránu od Transfer Bufferu) 9.2. Ponceau S (obarví proteiny na membráně) 9.3. TBST (odstraní zbytky Ponceau S) 10) Obarvenou membránu přeneste do čisté misky a skalpelem opatrně odřízněte nepotřebné části membrány. 11) Membránu přeneste do roztoku 5% BSA v TBST a ponechte na třepačce 30 min. BSA zablokuje volná vazebná místa pro proteiny na membráně, čímž sníží pozadí pro následnou detekci. 12) Omyjte membránu destilovanou vodou. 13) Do čisté misky nebo zkumavky odměřte 10-20 ml 5% BSA v TBST (dle velikosti membrány) a ponořte do něj membránu. 14) Přidejte primární (specifickou) protilátku v poměru 1:1000 - 1:5000. 15) Inkubujte na třepačce přes noc při 4 °C. 16) 3x omyjte membránu v TBST 5 min. 17) Přeneste membránu do čisté misky nebo zkumavky s 10-20 ml 5% BSA v TBST a přidejte sekundární protilátku (s navázanou peroxidázou) v poměru 1:5000. 18) Inkubujte na třepačce při laboratorní teplotě 1 hod. 19) 5x omyjte membránu v TBST 5 min. a přeneste ji do čisté misky. 20) Smíchejte 1 ml Opti-4CN diluent s 9 ml destilované vody. 21) Přidejte 200 \il Opti-4CN substráte, dobře promíchejte a nalijte na membránu a na třepačce inkubujte 5-30 min. dokud se membrána dostatečně nevybarví. 22) Omyjte membránu destilovanou vodou a vyfotografujte na dokumentačním zařízení. Další informace o této problematice najdete v Sambrook J. a Russell D. 2001: Molecular cloning. A laboratory Manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Bio-Rad. Instruction manuál for Opti-4CN Substráte Kit. 99 Kontrolní otázky a příklady 1) Máte primárni protilátku o koncentraci 220 |jg/ml. Kolik jjI této protilátky musíte přidat k 10 ml pufru, abyste získali konečnou koncentraci 1 |ig/ml? 2) Molekula IgG má molekulovou hmotnost přibližně 150 000. Kolik molekul IgG je obsaženo v 1 |ag? 100 Výsledky příkladů Cvičení č. 1 Izolace chromosomální DNA z krve D 6,9 ug 2) 6,9 attogramů (6,9 x 10"18g) 3) 4 x 1012 molekul 4) 76 milimetru Cvičení č. 2 Izolace genomové DNA z rostlinných buněk D Organismus Velikost DNA (bp) Molární hmotnost Hmotnost 1 molekuly Počet molekul vlg Člověk 3,2 x 10y 2,1 x 1012 3,49 x 10"12 g 2,87 x 1011 Drosophila 1,2 x 10s 7,7 x 101U 1,28 x 10"13 g 7,82 x 1012 Saccharomyces cerevisiae 1,6 x 10v 1,0 x 101U 1,66 x 10"14 g 6,02 x 1013 Escherichia coli 4,0 x 10b 2,5 x 10y 4,15 x 10"1S g 2,41 x 1014 Bakteriofág X 48 514 3,1 x 10v 5,15 x 10"17g 1,94 x 10lb Zea mays 3,9 x 10y 2,5 x 1012 4,15 x 10"12g 2,41 x 1011 2) 15 ng 3) 163 cm Cvičení č. 3 Izolace plasmidplazmidové DNA 1) Rozštěpením plasmidové DNA reštrikční endonukleázou, která štěpí plasmid jen lx. Všechny formy se přemění formu lineární. 2) Na uvedeném elektroforetickém snímku vyznačte různé formy plasmidu. multimery OC-forma CCC-forma denaturovaná DNA chromosomální DNA chromosomální DNA po štěpení restriktázou L-forma 3) Že lyže buněk probíhala příliš dlouho nebo za vysokého pH (vyššího než 12,45) 101 Cvičení č. 4 Odhad koncentrace a čistoty DNA na agarózovém gelu 1) 250 ng/ul 2) V poměru 1 díl DNA : 11 dílům pufru 3) 1,85 x 1012 molekul Cvičení č. 5 Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky 1) 1 lil 2) 1 x 1012 molekul 3) 10 x 4) 90 ul 5) 1,4 x 1011 molekul Cvičení č. 6 Restrikční štěpení plasmidové DNA 1) 5 ul 2) 0,31 ug 3) 37,6 minut Cvičení č. 7 Stanovení genetické modifikace ac2 u Solanum tuberosum 1) Je zapotřebí alespoň 33 cyklů 2) 2,06 sekundy a 3,69 sekundy 3) 3 ul Cvičení č. 8 Detekce delece A32 v receptoru CCR5 metodou PCR 1) 36 cyklů 2) 117bp 3) C 102 Cvičení č. 9 Detekce delece v genu pro angiogensin konvertuj ící enzym metodou PCR 1) 1,27 sekundy a 3,27 sekundy 2) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje 200 x 1012 nukleotidů za minutu 3) 105 milionů amplikonů bude chybných Ve skutečnost bude počet chybných amplikonů vyšší, protože chyba v prvních cyklech se přenese i do dalších amplikonů. Cvičení č. 10 Detekce polymorfismu K469E v genu ICAM1 1) Sekvence nukleotidů v amplikonů získaného amplifikací standardní alely ggaaccca ttgcccgagc tcaagtgtct aaaggatggc actttcccac tgcccatcgg actgtcactc gagatcttga gggcacctac ctctgtcggg ccaggagcac tcaaggggag aggtgaccgt gaatgtgctc tgtgagtgag ccggcgggca gagctgggtg ggggcagggg aatgcaatcc tcacc 2) Sekvence nukleotidů v amplikonů získaného amplifikací nestandardní alely ggaaccca ttgcccgagc tcaagtgtct aaaggatggc actttcccac tgcccatcgg ggaatcagtg actgtcactc gagatcttga gggcacctac ctctgtcggg ccaggagcac tcaaggggag gtcacccgcg aggtgaccgt gaatgtgctc tgtgagtgag ccggcgggca gagctgggtg ggggcagggg ccatggacct aatgcaatcc tcacc Pozice restrikčního místa pro restriktázu BstU I je vyznačena tučně, podtržené 3) Sekvence aminokyselin - pro standardní alelu gtc - acc - cgc - aag - gtg - acc - gtg Val - Thr - Arg - Lys -Val - Thr - Val - pro nestandardní alelu gtc - acc - cgc - gag - gtg - acc - gtg Val - Thr - Arg - Glu - Val - Thr - Val ggaatcagtg gtcacccgca ccatggacct 103 Cvičení č. 11 Detekce polymorfismu 1007fs v genu NOD2 1) Sekvence nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací standardní alely cctgc agtctcttta actggacagt ttcaagagga aaaccaagaa tccttgaagc tcaccattgt atcttctttt ccaggttgtc caataactgc atcacctacc taggggcaga agccctcctg capHJ|tta aaaggaatga caccatcctg gaagtctggt aag v takto vyznačeném místě dojde v nestandardní alele ke vzniku místa pro restriktázu NlaTV 2) Sekvence nukleotidů v amplikonu získaného amplifikací nestandardní alely cctgc agtctcttta actggacagt ttcaagagga aaaccaagaa tccttgaagc tcaccattgt atcttctttt ccaggttgtc caataactgc atcacctacc taggggcaga agccctcctg 'aFFHH9t 1 CT aaaggaatga caccatcctg gaagtctggt aag ozice restrikčního místa pro restriktázu NlalV vyznačen 3) Sekvence aminokyselin pro standardní alelu Q-STOP-L-H-H-L-P-R-G-R-S-P-P-A-G-P " STOP-K-E-STOP-H-H-P-G-S-L-V-X Sekvence aminokyselin pro nestandardní alelu Q-STOP-L-H-H-L-P-R-G-R-S-P-P-A-G-P L-K-G-M-T-P-S-W-K-S-G-K Cvičení č. 12 Detekce polymorfismu v genu pro TMPT (thiopurin S-methyl transferáza) metodou real-time PCR 1) Podívejte se na www.farmakogenomika.cz Cvičení č. 13 Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu 1) 257 bp 2) 150ng/ml 3) 1,5 ml Cvičení č. 14 Izolace DNA z agarózového gelu 1)RCF= 1,119 x 10~5xrpm2xr = 1,119 x 10~5 x 14 0002 x 7 = 15 352 g Cvičení č. 15 Izolace mediátorové RNA z myší tkáně 1) 1,67 x 108 ribonukleotidů 2) 0,11 mM 3) 100 aminokyselin 104 Cvičení č. 16 Zpětná transkripce a příprava cDNA genu pro G3PDH 1) 1 x 1012 deoxyribonukleotidů / sekundu 2) Jedenkrát za 46 = 4 096 nukleotidů 3) asi 0,9 ul Cvičení č. 17 Příprava rekombinantního genu pro lidský leptin amplifikací 1) Sekvence signálního peptidu. Leptin začíná valinem. MHWGTLCGFL WLWPYLFYVQ AVPIQKVQDD TKTLIKTIVT RINDISHTQS VSSKQKVTGL DFIPGLHPIL TLSKMDQTLA VYQQILTSMP SRNVIQISND LENLRDLLHV LAFSKSCHLP WASGLETLDS LGGVLEASGY STEVVALSRL QGSLQDMLWQ LDLSPGC 2) LEP2 = 5'- CTT CTT GGG AAG GAA AAT GC - V = (9 x 4) + (1 lx 2) = 58 °C LEP530 = 5'- GTA GAC TTG CAG GAA GAG TG - 3' = (10 x 4) + (lOx 2) = 60 °C 3) Pozice primerů LEP2, LEP530, a částí primerů HLEP81KPN a LEP530XBA. Iniciační a terminační kodon. 1 gcttcttggg aaggaaaatg cattggggaa ccctgtgcgg attcttgtgg ctttggccct 61 atcttttcta tgtccaagct gtgcccatcc aaaaagtcca agatgacacc aaaaccctca 121 tcaagacaat tgtcaccagg atcaatgaca tttcacacac gtcagtctcc tccaaacaga 181 aagtcaccgg tttggacttc attcctgggc tccaccccat cctgacctta tccaagatgg 241 accagacact ggcagtctac caacagatcc tcaccagtat gccttccaga aacgtgatcc 301 aaatatccaa cgacctggag aacctccggg atcttcttca cgtgctggcc ttctctaaga 361 gctgccactt gccctgggcc agtggcctgg agaccttgga cagcctgggg ggtgtcctgg 421 aagcttcagg ctactccaca gaggtggtgg ccctgagcag gctgcagggg tctctgcagg 481 acatgctgtg gcagctggac ctcagccctg ggtgctgagg ccttgaaggt cactcttcct 541 gcaagactac gttaagggaa ggaacctggc ttcaggtatc tccaggattg aagagcattg 601 catggacacc cttatcagga ctctgtcaat tcctgactct ctag Cvičení č. 18 Simultánní štěpení amplikonu a vektoru 1) 1,29 x 1011 molekul 2) 4,63 x 1012 molekul 3) Smícháme lul vektoru a 5ul amplikonu. Cvičení č. 19 Ligace vektoru a naštěpené DNA 1) 67 2) 32,01 ug 3) 2,56 x 10"13 molů 105 Cvičení č. 20 TA klonování amplifikačních produktů 1) 7,2 x 1016 molekul 2) 8 x 10"13 molů 3) a) 9,71 x 108 b) 1,61 x 109 molů c) 1,61 nM d) 3,22 nM Cvičení č. 21 Transformace bakteriálních buněk Escherichia coli 1) 50 molekul plasmidu na jednu buňku 2) 5 x 108 transformantů/ug 3) 2,3 x 10"9 Cvičení č. 22 Exprese rekombinantního proinsulinu 1) Ampicilin = (5ul o koncentraci 100 mg/ml na 15ml média) = 500ug/15 ml = 33ug/ml Chloramfenikol = (lOul o koncentraci 17 mg/ml na 15ml média) = 170|ig/15ml = llug/ml 2) Např. při objemu kultury 15ml IPTG = (150ul o koncentraci lOOmM) = ředění 15 000/150 (lOOx) = lmM 106 Cvičení č. 23 Elektroforéza proteinů v polyakrylamidovém gelu 1) 90ul 10% amoniumpersulfátu na přibližně 15 ml gelu, ředění je tedy 15 000/90x, tedy výsledná koncentrace = 0,06% 2) Strukturní vzorce Akrvlamid Bisakrylamid Cvičení č. 24 Western Blot 1. 45,45 ul 2. 4xl012molekul/ug 107